固定化脂肪酶的創制及其在乙酸肉桂酯無溶劑制備中的應用

陳金行 張逸 張軍濤 未本美 王宏勛 鄭明明，，3

（1.武漢輕工大學生命科學與技術學院，武漢 430023；2.中國農業科學院油料作物研究所，武漢 430062；3.湖州市菱湖新望化學有限公司，湖州 313018）

乙酸肉桂酯是一種存在于肉桂、荔枝、甜瓜等植物中的天然風味物質，具有果香、花香和茉莉香，是我國《食品安全國家標準》允許使用的香精香料［1］，被廣泛應用于食品和化妝品中。乙酸肉桂酯主要通過天然提取［2］、化學法合成［3］和酶法合成［4］等手段制備。然而，植物中天然存在的乙酸肉桂酯含量低，提取工藝復雜，生產成本高；化學法合成通常需要在高溫、高壓等條件下進行，導致高能耗、高污染，副產物難分離等問題。酶法合成具有反應條件溫和、專一性強、反應效率高、綠色無污染等優勢［5-6］。另外，酶法合成的產物被認為是天然的，價格優勢明顯，市場前景廣闊［7-8］。因此，利用酶法合成以乙酸肉桂酯為代表的風味酯比植物提取和化學合成更具有技術優勢和產業化前景。

目前，酶法合成主要以游離酶為主，但游離酶在外界刺激下易失活，難回收和重復利用［9］。已報道的固定化手段包括物理吸附、包埋法、共價連接等方法，可以一定程度上提高游離酶的穩定性和重復使用性［10-12］。其中，物理吸附法因其操作步驟簡單、對酶活性影響小、成本低等優勢被廣泛使用。如劉昱杉等［13］通過物理吸附成功將熒光假單胞菌脂肪酶固定在玻璃上，有效提高了脂肪酶的催化活性和穩定性，并可使乙酸肉桂酯的酶法產率在18 h內達99%。周美娟等［14］通過物理吸附將脂肪酶固定在脫脂棉上用于合成乙酸肉桂酯，在最佳條件下，肉桂醇與乙酸乙烯酯摩爾比為1∶2.16，反應溫度為37℃，固定化酶添加量為15 mg，反應12 h肉桂醇的轉化率可以達到92.0%。然而，物理吸附仍存在固定化酶易脫落、酶活性不穩定的缺點，是亟待解決的瓶頸難題［15］。選擇合適的載體是脂肪酶物理吸附效果和活性穩定性的關鍵，其中，有序介孔材料OMS（ordered mesoporous silicon）具有適當的孔徑和優異的比表面積，近年來受到廣泛報道和應用［16］。

已經報道的乙酸肉桂酯酶法制備相關文獻中存在使用有機溶劑、催化效率低、耗時長、酶重復使用效果差等問題［13-14］。使用有機溶劑雖然可以保持脂肪酶的催化穩定性，但是在實際生產中不利于產物分離，增加生產成本。催化效率和酶的重復使用性與生產效益直接相關，良好的催化效率和重復使用性不僅可以縮短反應的時長還可以有效節省生產投入。目前，關于OMS介孔材料用于乙酸肉桂酯的研究鮮有報道。

本研究通過將假絲酵母脂肪酶（Candida sp.lipase, CSL）固定在經過疏水改性的OMS上，成功制備固定化脂肪酶（CSL@OMS-C8），用于無溶劑體系中催化乙酸乙烯酯與肉桂醇酯交換制備乙酸肉桂酯。對反應溫度、底物摩爾比、脂肪酶添加量等關鍵反應參數進行系統優化，為乙酸肉桂酯的綠色高效合成和工業化生產提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B, CALB）購自諾維信公司。皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase, AYS）、洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomomas cepacian lipase, PS）、皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase, CRL）和豬胰腺脂肪酶（Porcine pancreas lipase, PPL）購自Amano Enzyme 公司。假絲酵母脂肪酶（Candida sp.lipase,CSL）購自開泰新世紀生物技術有限公司（北京）。肉桂醇、乙酸乙烯酯、正己烷、硅酸四乙酯（TEOS，98%）、1,3,5-三甲苯（TMB）和三甲氧基（辛基）硅烷（C8，97%）購自阿拉丁試劑有限公司（上海）。三嵌段共聚物（聚（環氧乙烷）106-聚（環氧丙烷）70-聚（氧化乙烯）106）（Pluronic F127）購自于上海元葉生物技術有限公司（上海）。三乙胺購自國藥集團化學試劑（上海）。

1.2 方法

1.2.1 載體OMS和OMS-C8的制備 參考Li等［17］方法制備載體OMS和OMS-C8。

有序介孔硅（OMS）的制備：在20℃條件下，將1.0 g三嵌段共聚物Pluronic F127和2.5 g KCl溶解于100 mL 1.0 mol/L HCl溶液。隨后，加入1.2 g 1,3,5-三甲基苯（TMB），并攪拌1 h，再加入4.0 g硅酸四乙酯（TEOS），劇烈攪拌15 min后，將溶液靜置陳化48 h，然后轉移至反應釜中，200℃保持24 h，用乙醇洗滌，60℃過夜烘干。將上述干燥物進行煅燒，煅燒程序為：以5℃/min的速率從環境溫度升高至550℃，保持該溫度6 h，然后以10℃/min的速度降低至環境溫度。收集最終產物，即為有序介孔硅（OMS），儲存以備后續使用。

通過硅烷偶聯劑（C8）與OMS表面羥基接枝改性制備OMS-C8：首先，將1.0 g OMS樣品、50 mm C8和15 μL三乙胺置于10 mL甲苯中，進行超聲均勻分散。隨后，將混合物置于130℃高壓釜中20 h。最后，用乙醇洗滌3次，過濾，60℃干燥12 h，即可獲得OMS-C8。

1.2.2 脂肪酶的固定化 4℃條件下，將脂肪酶CSL充分溶解在磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 9）中，離心除去雜質獲得脂肪酶溶液上清液。隨后，取0.1 g OMS-C8和10 mL脂肪酶溶液上清液混合，220 r/min搖動40 min，離心收集殘留物，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。最后，-70℃冷凍干燥24 h，即可獲得固定化酶CSL@OMS-C8。

1.2.3 OMS、OMS-C8和CSL@OMS-C8的表征 通過掃描電子顯微鏡（SU8010）觀察樣品的表面形貌，使用透射電子顯微鏡（TG2 20S-TWIN）觀察樣品的內部結構。通過氮氣吸附分析儀（ASAP 2010）分析樣品的比表面積和孔徑分布。利用傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜儀分析樣品所含基團變化以及固定化結果。使用接觸角測試儀（SDC-200S）測量材料親疏水性。

1.2.4 乙酸肉桂酯的酶法制備 在10 mL反應瓶中，固定反應體積為5 mL，調節加入乙酸乙烯酯和肉桂醇的量改變底物的摩爾比，加入催化劑濃度為1-10 g/L，在不同溫度下研究肉桂醇的轉化率。反應過程中，每隔一定時間取樣20 μL溶于正己烷，通過0.22 μm PDVF過濾器過濾后進行氣相色譜檢測。

1.2.5 產物分析檢測 氣相色譜柱為DB-5 HT，氮氣為載氣（分流比為50∶1）。升溫程序：50℃保持2 min，以15℃/min升溫至150℃，再以10℃/min升溫至240℃并保持1 min。進樣器溫度和檢測器溫度為270℃。通過比較肉桂醇和乙酸肉桂酯的峰面積得到肉桂醇的轉化率。

1.2.6 數據分析 使用Origin 2019進行數據處理和繪圖，數據以均值±標準差（SD）形式表示。用SPSS軟件進行數據分析，用單因素方差分析確定數據組之間的統計學差異，不同字母表示P＜0.05水平下差異顯著。

2 結果

2.1 脂肪酶的篩選

脂肪酶作為酯交換反應的催化劑，在反應中起至關重要的作用，同一反應條件下，對不同種類脂肪酶進行篩選是酶促反應的常用手段［18-19］。固定反應體積為5 mL，加入肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾比為1∶5，反應溫度為50℃，脂肪酶添加量為2 g/L的反應條件下反應3 h，比較6種不同的脂肪酶（包括CSL、PS、PPL、AYS、CALB和CRL）在無溶劑體系中催化制備乙酸肉桂酯的效果（圖1）。可以看出，反應3 h后，6種脂肪酶在乙酸肉桂酯的制備中催化效果存在顯著性差異。脂肪酶CSL催化肉桂醇的轉化率達63.8%，遠高于脂肪酶CALB（17%）和脂肪酶PS、PPL、AYS、CRL（不超過10%）。表明在此反應中脂肪酶CSL具有更好的催化效果，這與脂肪酶的選擇性催化有關［20］。因此，選擇脂肪酶CSL作為乙酸肉桂酯酶法制備的催化劑進行下一步研究。

2.2 載體表征

運用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對載體材料和固定化酶進行表征。結果顯示，負載材料OMS呈六角形結構，直徑約為6微米（圖2-a）。可以清楚地觀察到材料表面有序、密集的孔結構（圖2-b）。OMS材料的吸附等溫線是典型的介孔材料特征［21-22］，介孔孔徑為15 nm（圖2-c），這保證了脂肪酶能夠順利進入材料孔道內。另外，與未修飾的材料OMS相比，經過疏水修飾的材料OMS-C8在孔徑和孔容上稍有下降（圖2-d），說明C8修飾成功，但并未改變載體材料的原有形貌結構。經過固定化以后，材料CSL@OMS-C8的孔容急劇下降，這是因為脂肪酶成功進入材料的孔道并占據孔道［23］。

利用傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜儀分析樣品所含基團變化以及固定化（圖3），與OMS相比，材料OMS-C8在2 923和2 852 cm-1處有明顯的特征峰，這是由于C-H的對稱和不對稱拉伸振動所導致，表明C8被成功接枝到OMS材料上。在1 653和1 539 cm-1處的特征峰與N-H彎曲振動相關，在CSL和CSL@OMS-C8的光譜中能找到相對應的特征峰，表明脂肪酶CSL成功固定在OMS-C8上。

圖3 游離脂肪酶CSL、OMS、OMS-C8、CSL@OMS-C8的傅里葉紅外結果Fig.3 FT-IR spectra of the free lipase CSL, OMS,OMS-C8 and CSL@ OMS-C8

通過使用接觸角測試儀（SDC-200S）測量材料親疏水性（圖4），發現經過C8疏水修飾，OMS材料的接觸角從20°增加到120°，表明C8修飾可有效改善OMS的疏水性，這與紅外結果相吻合。經過疏水改性的材料更有利于打開脂肪酶的“蓋子”結構，暴露出催化活性位點，提高脂肪酶催化活性［24-25］。

圖4 OMS（A）和OMS-C8（B）的疏水測定Fig.4 Hydrophobic measurement for OMS（A）and OMS-C8（B）

2.3 底物摩爾比對酯化反應的影響

固定反應體積為5 mL，CSL@OMS-C8的濃度為2 g/L，反應溫度為50℃條件下，反應3 h，考察不同肉桂醇和乙酸乙烯酯摩爾比對乙酸肉桂酯產率的影響（圖5-a）。結果表明，當肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾比由1∶1逐漸增大至1∶5時，肉桂醇的轉化率由23.5%上升至99.5%；繼續增大底物摩爾比至1∶10后，肉桂醇的轉化率沒有繼續增加，反應平衡時間縮短。這可能是由于其他條件保持不變，增加反應底物導致反應平衡向正反應方向移動［26］。為了獲得較多的產物且同時保持高效性，選擇肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾比為1∶5進行后續的研究。

圖5 不同反應條件對乙酸肉桂酯合成的影響以及最優條件下固定化酶和游離酶對比Fig.5 Effects of different reaction conditions on the synthesis of cinnamyl acetate and comparison of immobilized and free enzymes under optimal conditions

2.4 溫度對酯化反應的影響

反應溫度不僅對反應速率和反應平衡時間有影響，還會對酶活性產生影響，因此，在30-70℃范圍內研究溫度對反應的影響。保持其他反應條件不變，在不同溫度下（30-70℃）反應3 h，考察溫度對肉桂醇轉化率的影響（圖5-b），結果表明，不斷升高溫度，反應3 h，肉桂醇的最終轉化率呈先上升再下降的趨勢。當溫度由30℃升高至50℃，乙酸肉桂酯的產率從91.9%升高至99.5%。繼續升高溫度至70℃，肉桂醇的轉化率隨著溫度的升高而降低至72.9%。說明適當提高溫度有助于提高脂肪酶活性，持續升高溫度，高溫下脂肪酶活性會部分喪失［27］。綜合考慮50℃為最佳反應溫度。

2.5 脂肪酶添加量對酯化反應的影響

保持其他條件不變，改變固定化脂肪酶添加量為1-10 g/L反應3 h，研究固定化脂肪酶添加量對肉桂醇轉化率的影響（圖5-c），結果表明，當催化劑添加量從1 g/L增加至2 g/L,反應3 h肉桂醇的最終轉化率由原來的84.8%升高至99.5%。繼續增加催化劑添加量為3、5、7和10 g/L，反應達到平衡的時間不斷提前，當添加劑的量為10 g/L時，0.5 h反應就能達到平衡。說明增加催化劑的添加量，脂肪酶催化活性位點也隨之增加，活性位點與底物之間的接觸增加導致轉化率上升和平衡時間縮短［28］。綜合考慮，以2 g/L作為固定化脂肪酶實際添加量，反應時間為2 h。

在最優條件下游離酶與固定化酶3 h內催化效果如圖5-d所示。可以很明顯看到，脂肪酶經過固定化處理以后，催化效果得到很大程度提高。固定化脂肪酶在2 h反應達到平衡，轉化率為96.6%，而游離酶3 h的轉化率僅為81.7%，并且固定化酶催化效率達到1 159.2 mmol/（g·h），是游離酶（653.6 mmol/（g·h））的1.7倍。可能是因為固定化材料OMS為脂肪酶提供了一個相對穩定催化環境有關。并且，經過C8疏水修飾可以促進脂肪酶穩定催化環境有關。并且，經過化效果得到很大程度提高［29］。結果表明，固定化酶催化活性較游離酶大幅提升。

2.6 固定化酶重復使用性評價

重復使用性是評價固定化酶穩定性的重要指標，也是判斷其產業應用前景的依據。圖6為最優條件下固定化脂肪酶循環使用結果，盡管CRL@OMS-C8在重復使用時催化活性出現下降趨勢，但5次循環使用后CRL@OMS-C8仍能保持80%以上的催化活性，表明基于疏水改性修飾的OMS材料可以有效提高脂肪酶的活性穩定性和重復使用性，因此，大幅降低酶法制備乙酸肉桂酯的成本，表明CRL@OMS-C8在風味酯酶法制備的產業化潛力。

圖6 固定化脂肪酶CSL@OMS-C8循環使用結果Fig.6 Reusability of CSL@OMS-C8

3 討論

本文提出一種基于有序介孔材料制備固定化酶用于綠色高效制備乙酸肉桂酯的新方法，肉桂醇轉化率在2 h達到96.6%，催化效率達到1 159.2 mmol/（g·h），是游離酶的1.7倍。結果表明，經過固定化后脂肪酶催化活性有顯著提升，這歸因于疏水載體材料有利于打開脂肪酶“蓋子”結構，暴露出活性位點。

姚俠等［4］使用Novozym 435商品化脂肪酶作為催化劑合成乙酸肉桂酯，反應3 h肉桂醇轉化率達到99%；劉昱杉等［13］將脂肪酶PFL固定在玻璃上催化乙酸乙烯酯與肉桂醇進行轉酯化反應，反應18 h肉桂醇的轉化率可以達到99%；周美娟等［14］使用脫脂棉成功固定脂肪酶PCL用于乙酸肉桂酯的合成，反應12 h最高轉化率達到92.0%。本研究使用自制CSL@OMS-C8在更短的時間達到同一水平轉化率（2 h，96.6%）。此外，OMS硅載體具有良好的重復使用性和更高的熱穩定性，特別是在惡劣條件下（即高溫、強酸性/堿性反應）。最后，硅是經中華人民共和國國家衛生健康委員會批準允許用于食品加工的材料，這意味著疏水有序介孔SiO2載體固定化脂肪酶有望用于食品領域的工業加工。

為進一步提高固定化酶的重復使用次數，擬采用“場酶結合”的方式進行改進，即將超聲、微波等技術與固定化脂肪酶相結合，旨在通過不同的處理方式降低反應過程中對脂肪酶的傷害，提升固定化酶的可重復使用能力并獲得更高效的制備方法［30-31］。另外，也可將固定化酶與連續流反應器相結合，構建新型高效的連續流酶反應體系［32］。固定化脂肪酶與連續流反應器相結合可以有效解決脂肪酶回收困難的問題，推動固定化酶制備乙酸肉桂酯工業化制備的產業化。

4 結論

使用辛基（C8）疏水改性的有序介孔二氧化硅（OMS）固定化脂肪酶。固定化脂肪酶CSL@OMS-C8在無溶劑生產乙酸肉桂酯中催化效果顯著，是極具工業化應用潛力的催化劑。