巨噬細胞來源的外泌體對彌漫大B細胞淋巴瘤增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響*

韓 笑,王雪蓮

復旦大學附屬中山醫院青浦分院血液科,上海 201700

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最為常見的一種類型,每年約有15萬例新發病例,約占所有非霍奇金淋巴瘤的30%,DLBCL具有高度侵襲性,發病后可累及全身多個臟器。目前,利妥昔單抗、環磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松方案已經成為治療DLBCL的標準一線化療方案,大大提高了患者的生存率,由于該病異質性大,仍有近1/3的患者容易復發或者產生耐藥性。在過去的幾十年里,基于臨床病理學特征的預后因子,包括AnnArbor分期、國際預后指數(IPI)等被廣泛應用于評價DLBCL患者的預后,然而,IPI和治療方案一致的患者卻有著不同的預后[1]。外泌體是由多種細胞分泌的小細胞外囊泡,在人體體液中廣泛分布,不同組織來源的外泌體攜帶的核酸、蛋白質和脂質也不完全相同。目前,關于外泌體的研究主要集中在腫瘤血管生成、免疫、腫瘤微環境等方面,與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移有一定相關性[2]。腫瘤細胞來源的外泌體具有調控巨噬細胞的功能,反之,巨噬細胞來源的外泌體亦具有調控腫瘤細胞生物學行為的作用;腫瘤細胞與腫瘤相關巨噬細胞(TAM)可以通過與外泌體互相作用,在腫瘤的增殖、侵襲、轉移等方面發揮重要作用。目前有研究主要集中在肝癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌等[3],而巨噬細胞來源的外泌體對DLBCL的影響及機制尚不清楚,探尋新的DLBCL疾病預后標志物及機制可為深入研究DLBCL的發病機制及防治提供新思路。本研究主要探討巨噬細胞來源的外泌體對人DLBCL細胞系U2932細胞生物學行為的影響,為進一步研究DLBCL的發病機制提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 巨噬細胞株(RAW264.7細胞)、人DLBCL細胞系U2932細胞均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑 RPMI1640購自美國Corning公司;青/鏈霉素購自美國Gibco公司;Dil染料購自北京索萊寶科技公司;CCK-8試劑盒、結晶紫染液均購自上海碧云天生物科技公司;外泌體染色濾柱購自上海碧云天生物科技公司;人源重組巨噬細胞集落刺激因子購自美國ThermoFisher公司;胎牛血清購自天根生化科技有限公司。

1.3方法

1.3.1體外巨噬細胞極化模型構建 將RAW264.7細胞株用含10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基,置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養,當RAW264.7細胞株達到2×106/mL時,將細胞懸液放入離心管中離心處理,當細胞狀態良好且懸浮細胞總量達107個時,接種于12 孔板中,用白細胞介素(IL)-4和IL-13慢病毒表達載體感染細胞,12 h后去上清液,更換培養基,72 h 后在培養液中加入嘌呤霉素(1 μg/mL)繼續培養7 d,在藥物篩選下最后存活的細胞為穩定株,即為M2型巨噬細胞,然后收集用于后續試驗。

1.3.2外泌體提取 取標本15 mL放入離心管中,加入磷酸鹽緩沖液(PBS),配平后以300×g、4 ℃離心10 min,取上清液轉移到新的15 mL離心管中,配平后以2 000×g、4 ℃離心10 min,轉移至超速離心機配套的離心管中,配平所收集的超速離心機配套離心管中的上清液后以10 000×g、4 ℃離心30 min,取上清液轉移至超速離心機配套的離心管中;配平所收集的超速離心機配套離心管中的上清液后以100 000×g、4 ℃離心70 min,取透明沉淀,并用250、150 μL的PBS重懸,所得即為外泌體溶液,按檢測要求分裝后于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.3.3透射電鏡檢測外泌體形態 將50 μL外泌體標本滴在200目的銅網上,室溫下孵育5 min,然后用濾紙吸去銅網邊緣多余的液體,接著用1%磷鎢酸負染色1 min,用蒸餾水沖洗銅網1～2次,再用濾紙吸去多余的液體,干燥后,用TEM-1400plus透射電鏡在80 kV下觀察銅網。

1.3.4納米顆粒跟蹤分析技術(NTA)檢測外泌體水平和粒徑 將外泌體標本的水平用PBS稀釋,采用ZetaViewPMX110儀器進行檢測,并用ZetaView8.04.02軟件進行數據分析。

1.3.5免疫熒光法檢測外泌體傳遞 將適量Dil染料加入外泌體中,避光染色20 min,經外泌體染色濾柱去除多余的染料。以加外泌體的人DLBCL細胞作為外泌體組,以未加外泌體的人DLBCL細胞作為對照組,處理后的外泌體加入DLBCL細胞中培養,在37 ℃培養箱中培養24 h后,用4%甲醛固定并采用熒光顯微鏡觀察兩組人DLBCL細胞和RAW264.7細胞中的熒光強度。

1.3.6CCK-8法檢測U2932細胞增殖 取人DLBCL細胞與M2型巨噬細胞來源的外泌體共孵育24 h后取計數板,進行細胞計數,將1.5×104個/孔接種于96孔板中,以加外泌體的人DLBCL細胞作為外泌體組,以未加外泌體的人DLBCL細胞作為對照組,每組設置為5個復孔,將細胞放入培養箱中培養,分別在每孔0、24、48、72 h加入10 μL CCK溶液,孵育2 h,采用酶標儀于450 nm處測定吸光度(A)值。

1.3.7細胞劃痕試驗檢測U2932細胞遷移 取人DLBCL細胞與M2型巨噬細胞來源的外泌體共孵育24 h后計數,接種于6孔板中,在直尺輔助下,采用槍頭劃直線,PBS清洗,培養48 h。以加外泌體的人DLBCL細胞作為外泌體組,以未加外泌體的DLBCL細胞作為對照組,顯微鏡下觀察6孔板中U2932細胞劃痕,分別在0、48 h的時間點內隨機選擇3個視野拍照,計算遷移率。

1.3.8Transwell法檢測U2932細胞侵襲 取人DLBCL細胞與M2型巨噬細胞來源的外泌體共孵育24 h后計數,取2×105個DLBCL細胞均勻平鋪到8 μm PET小室中,并加入200 μL不含胎牛血清(FBS)的培養基,將小室放置于24孔板中,下室加入600 μL含FBS的培養基,然后置于37 ℃培養箱中培養18 h,隨后將小室取出并用PBS清洗,用棉簽小心將小室內的細胞擦掉,PBS洗3次,接著將小室浸沒于4%甲醛中固定20 min,固定后室溫晾干并放于結晶紫染液中10 min,PBS沖洗3次后使用顯微鏡觀察并計數,以加外泌體的人DLBCL細胞作為外泌體組,以未加外泌體的DLBCL細胞作為對照。

1.3.9流式細胞術檢測U2932細胞凋亡 取人DLBCL細胞與M2型巨噬細胞來源的外泌體共孵育接種于培養皿中。以加外泌體的人DLBCL細胞作為外泌體組,以未加外泌體的DLBCL細胞作為對照組。采用離子水將10×BindingBuffer稀釋成1×BindingBuffer后,將各組以1 200 r/min離心5 min,PBS重懸,1 200 r/min離心5 min,重懸細胞,離心后加入BindingBuffer和AnnexinV-FITC混勻,孵育15 min,采用流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.1外泌體濃度和粒徑 通過透射電鏡檢測發現,所得的外泌體呈圓形,具有比較明顯的膜結構。NTA檢測結果顯示,外泌體水平為(5.27±0.36)×1010particles/mL,平均粒徑為121.69 nm,單峰,呈正態分布,直徑50～150 nm,其密度約為(1.15±0.03)g/mL。

2.2外泌體傳遞 免疫熒光法檢測結果顯示,外泌體組在人DLBCL細胞和RAW264.7細胞中的熒光強度分別為22.78±5.42和32.96±4.93,對照組人DLBCL細胞和RAW264.7細胞中的熒光強度分別為9.03±1.46和8.97±1.35,與對照組比較,外泌體組在人DLBCL細胞和巨噬細胞株RAW264.7細胞中的傳遞均明顯增多,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注:與對照組比較,*P<0.05。

2.3人DLBCL細胞系U2932細胞增殖能力 CCK-8 法檢測結果顯示,外泌體組在0、24、48、72 h的A值分別為0.44±0.07、0.63±0.13、0.87±0.21、0.96±0.19,對照組分別為0.42±0.05、0.49±0.08、0.53±0.11、0.61±0.15,外泌體組人DLBCL細胞系U2932細胞增殖能力均明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組人DLBCL細胞系U2932細胞增殖能力比較

2.4人DLBCL細胞系U2932細胞遷移和侵襲能力 細胞劃痕試驗和Transwell法檢測結果顯示,外泌體組人DLBCL細胞系U2932細胞遷移率為(78.92±11.45)%,細胞侵襲個數為(218.54±30.57)個;對照組人DLBCL細胞系U2932細胞遷移率為(47.32±8.19)%,細胞侵襲個數為(89.21±13.84)個。外泌體組細胞遷移率和細胞侵襲個數均明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.5人DLBCL細胞系U2932細胞凋亡能力 流式細胞術檢測結果顯示,外泌體組凋亡率為(4.87±1.07)%,對照組為(13.16±4.63)%,外泌體組凋亡率明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注:A為對照組細胞凋亡;B為外泌體組細胞凋亡。與對照組比較,*P<0.05。

3 討 論

DLBCL是淋巴瘤中侵襲性較強的一類,無論是在生物學特征還是在臨床上均具有很大的異質性[4]。盡管以抗CD20的Rituximab為代表的治療使DLBCL患者的生存得到明顯改善,但是仍有部分患者完全緩解后容易在疾病早期復發或者出現耐藥,對患者預后的預測仍然困難[5]。外泌體屬于細胞外囊泡,起源于細胞內的多泡內體,通過內向出芽作用,并包裹特異分選的核酸、蛋白、脂質等生物大分子產生多個管腔囊泡,外泌體隨體液流動到達靶細胞,發揮其相應的生物學作用。巨噬細胞是一群具有高度可塑性的細胞,是固有免疫系統的重要組成部分,根據環境的變化,巨噬細胞可以快速作出反映,表現出不同的表型和功能,在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。M1型巨噬細胞一般被認為具有抗腫瘤作用,而M2型巨噬細胞通常被認為是腫瘤相關巨噬細胞,可以通過血管生成和淋巴管生成調節、免疫抑制、缺氧誘導等促進腫瘤發生、增殖、轉移[6]。巨噬細胞來源的外泌體參與很多重要的病理、生理過程。XU等[7]通過研究發現,腫瘤相關巨噬細胞來源的外泌體通過將lncMMPA 轉移至腫瘤細胞并激活糖酵解途徑促進肝細胞癌的惡性發展;WEI等[8]研究發現,M2型巨噬細胞來源的外泌體通過傳遞miR-942 促進肺腺癌進展。人們也越來越關注腫瘤或巨噬細胞來源的外泌體的基本特征及其之間的相互作用關系,這些外泌體會導致治療期間的癌癥進展和耐藥性,及其潛在的臨床應用前景。目前,關于巨噬細胞來源的外泌體在DLBCL中的作用和機制尚不明確,因此,揭示巨噬細胞來源的外泌體與DLBCL發病之間的關系,探討巨噬細胞來源的外泌體對DLBCL細胞生物學行為的影響及相關發病機制就顯得非常重要。

本研究采用超速離心法提取外泌體,得到50～150 nm大小的囊泡,分離囊泡的純度較好。同時采用免疫熒光法檢測外泌體的傳遞情況,結果顯示,外泌體組在人DLBCL細胞和巨噬細胞株RAW264.7細胞中的傳遞均明顯增多。為了驗證M2型巨噬細胞來源的外泌體在人DLBCL細胞中增殖、侵襲、遷移和凋亡的作用,本研究讓人DLBCL細胞與M2型巨噬細胞來源的外泌體共孵育24 h,以未加外泌體的人DLBCL細胞作為對照,通過各項試驗研究結果表明,加入外泌體的人DLBCL細胞系U2932細胞增殖、遷移、侵襲能力均明顯高于對照組,而凋亡能力明顯低于對照組。上述結果表明,M2型巨噬細胞來源的外泌體具有調控人DLBCL細胞系U2932細胞的生物學功能,能夠促進人DLBCL細胞系U2932細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制其凋亡。癌癥的進展與免疫細胞活性的失調密切相關,腫瘤相關外泌體被認為是癌癥和免疫細胞之間交換物質的媒介,M2型腫瘤相關巨噬細胞具有促進腫瘤進展的功能。LING等[9]研究發現,DLBCL分泌的外泌體可以誘導巨噬細胞轉化為腫瘤M2樣表型,并且阻斷藥物誘導的DLBCL細胞凋亡,不同DLBCL衍生的外泌體可以通過STAT3信號改變巨噬細胞的表型,STAT3信號上調致癌基因和M2樣表型巨噬細胞經典標志物的表達,DLBCL衍生的外泌體可以促使巨噬細胞極化為促生長的M2樣表型的表達。此外,LIU等[10]研究發現,從DLBCL釋放的細胞外囊泡增強了巨噬細胞的M2極化效應,DLBCL衍生的細胞外囊泡通過增加PGC-1β蛋白的表達來調節巨噬細胞的代謝,重編程促進腫瘤進展的巨噬細胞表型,從而促進腫瘤進展。LIU等[10]研究表明,DLBCL釋放的外泌體促進巨噬細胞極化成M2型,M2型巨噬細胞釋放的外泌體又進一步促進DLBCL進展,也進一步印證了本研究的結論,即M2型巨噬細胞來源的外泌體能夠促進人DLBCL細胞系U2932細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制其凋亡。

綜上所述,巨噬細胞來源的外泌體能夠促進人DLBCL細胞系U2932細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制其凋亡。本研究未進行巨噬細胞來源的外泌體對人DLBCL細胞系U2932細胞促進作用的具體機制研究,但通過對DLBCL生物學行為的觀察,為進一步研究巨噬細胞來源的外泌體在DLBCL發生和發展中的相關機制提供了一定的理論基礎。