消栓通絡片中三七莖葉及重金屬檢查*

盧旭波 周云峰 郭林峰 吳喆

消栓通絡片是由桂枝、木香等11味中藥組成的中藥制劑,具有活血化瘀、溫經通絡的功效[1,2]。方中含有三七,用藥部位為其干燥根和根莖[3]。然而三七屬于名貴藥材,不良商家為節約成本會將價格低廉的三七莖葉冒充三七進行投料生產[4-6],由于三七莖葉含有的化學成分與三七大致相同,這種違規行為一般難以發覺。另外,隨著中藥材野生資源日益枯竭,中藥材商業化栽培種植逐漸得到推廣,由于中藥材的生長習性和人工干預,有相當部分的中藥材出現重金屬殘留超標問題[7,8],這可能會引發質量風險,甚至將安全風險轉移至中藥制劑中,為了保證成品的療效和用藥安全,有必要對中藥制劑的重金屬進行限量檢查。基于查閱文獻幾乎無對消栓通絡片中三七莖葉和重金屬有害元素檢查研究的報道,本研究首次對消栓通絡片中三七莖葉和重金屬殘留量進行檢查分析,具體報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器及試劑CAMAG雙波長紫外觀察箱(瑞士卡瑪公司);Nexlon 305D 電感耦合等離子體質譜儀(美國PerkinElmer公司);Mars 6 微波消解儀(美國CEM 公司);KH-250DB超聲儀(昆山禾創超聲儀器有限公司);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)。正丁醇、醋酸、乙醚、甲醇為分析純,濃硝酸為優級純,水為蒸餾水。

1.2 試藥三七皂苷R1(批號:110745-201921)、三七對照藥材(批號:120941-201810)、三七莖葉皂苷對照提取物(批號:110871-202102)來自中國食品藥品檢定研究院;砷(As,批號:223004-2)、銅(Cu,批號:225017-7)的濃度均為1000 mg/L,來源于國家有色金屬及電子材料分析測試中心;汞(Hg,批號:B22100008)、鎘(Cd,批號:B21070285)、鉛(Pb,批號:B22060242)的濃度均為1000 mg/L,來源于壇墨質檢標準物質中心;金標準液(Au,批號:23-2AUY1)和鉍、鍺、銦、鋰、鈧、鋱、釔內標液(Bi、Ge、In、Li、Sc、Tb、Y,批號:CL51-249CRY1)購于美國PerkinElmer公司;消栓通絡片(15批,來源于7家企業,規格為0.38 g/片或相當于原藥材1.8 g/片,批號分別為1812120、191203、480713、480712、470545、470158、20200301、20191202、20191104、20191003、20190802、20190702、180504、180302、20190502)。

2 方法與結果

2.1 三七莖葉檢查

2.1.1 實驗方法取樣品5片,研細,加乙醚10 ml振搖10 min,濾過,棄去濾液,藥渣揮干后用5 ml水潤濕,加水飽和正丁醇10 ml,振搖提取10 min,浸泡2 h,取上清液,殘渣再加水飽和正丁醇10 ml,振搖提取,取上清液,與第1次提取的上清液合并,用60 ml正丁醇飽和的水洗滌,取正丁醇液,蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。 取三七莖葉皂苷對照物適量,加甲醇制成每1 ml約含10 mg的三七莖葉皂苷對照物溶液;取三七對照藥材1.0 g,加70%甲醇20 ml,加熱回流30 min,濾過,濾液濃縮至2 ml,作為三七對照藥材溶液;取三七皂苷R1適量,加甲醇制成每1 ml約含2 mg的三七皂苷R1對照品溶液。照薄層色譜法試驗[9],以正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)放置分層的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10 %硫酸乙醇溶液,在110 ℃加熱至斑點顯色清晰,分別置日光下和紫外燈光(365 nm)下檢視。

2.1.2 檢測結果編號1～15為15批次消栓通絡片供試品溶液,與三七對照藥材及三七皂苷R1對照品相比,各斑點亮度、顏色及位置等均較一致;編號16為三七莖葉皂苷對照物,其與三七對照藥材化學成分大致相同,如同樣含有三七皂苷R1,但與樣品和三七對照藥材相比均多出現1個明顯的斑點,能有效區分差異,說明該7家企業未出現三七莖葉冒充三七投料生產的違規行為。見圖1。

注:A:在日光下檢視;B:在紫外燈光365 nm下檢視,1-15 供試品,16三七莖葉皂苷對照物,17 三七對照藥材,18 三七皂苷R1對照品。圖1 TCL色譜圖

2.2 重金屬殘留量測定

2.2.1 對照品溶液的制備精密量取As、Cd、Cu、Pb、Hg標準物質適量,加5%硝酸溶液稀釋成含As(0.5、2、5、10、50 μg/L)、Cd(1、5、10、20、50 μg/L)、Cu(10、40、80、100、250 μg/L)、Pb(1、5、10、50、100 μg/L)、Hg(0.2、0.5、1、5、20 μg/L)的混合標準溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取本品細粉約0.5 g,精密稱定,置消解罐中,加入濃硝酸10 ml,靜置2 h,經微波消解后將消解液轉移至50 ml量瓶中,加入200 μl金元素標準溶液(1 μg/ml),加水稀釋至刻度,搖勻,離心,取上清液作為供試品溶液。

2.2.3 儀器參數霧化氣流量、等離子體氣流量分別為0.95 L/min、18 L/min;電感耦合等離子體射頻功率為1300 W;檢測器雙模式,Standard掃描模式;數據采集模式為跳峰模式,重復次數3 次;同位素202Hg 、208Pb 以209Bi 為內標,111Cd以115In 為內標,63Cu、75As 以89Y 為內標。

2.2.4 標準曲線 精密度與重復性采集一系列對照品溶液的響應計數值,以各標準物質與內標物計數值的比值為縱坐標(Y)、濃度為橫坐標(x),繪制曲線方程;取1份混合標準溶液,連續進樣6次,計算各標準物質與內標物計數值的RSD<4%;選擇1批樣品(樣品序號:6),平行稱取6份,按2.2.2項下方法處理,測定含量,各元素RSD<6%。見表1。

2.2.5 加標回收取樣品(樣品序號:6)約0.25 g,精密稱定,置于消解罐內,精密加入相當于樣品各元素含量100%的標準液,按2.2.2項下制備供試品溶液,平行制備 6 份,測定各元素的含量,各元素的回收率。見表2。

表2 加樣回收率

2.2.6 樣品測定消栓通絡片樣品中As、Cd、Hg、Cu和Pb的含量見表3。按照中國的重金屬有害元素限量[15]：Cu≤20 mg/kg、Pb≤5 mg/kg、As≤2 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg,樣品中有1批Hg超標,2批As超標。

表3 消栓通絡片中5種元素測定結果 (mg/kg)

2.2.7 風險評價重金屬進入人體易在皮膚、肝臟、腎臟等蓄積造成中毒損傷[10],從2.2.6項下測定結果可知,有部分樣品的重金屬含量超過限度值,這有必要對不同企業的15批樣品的整體安全風險進行評估。采用中國食品藥品檢定研究院發布的中藥中外源性有害殘留物安全風險評估技術指導原則(Guideline of risk assessment of exogenous harmful residues in traditional Chinese medicines, GRAEHRTCM)和美國環境保護署(Environmental Protection Agency,EPA)推薦的健康風險評估(Health risk assessment,HRA)2種模型對安全風險進行分析:(1)GRAEHRTCM模型:①HI=IR×C×EF×Ed×10/(AT×W×HBGV) ,式①中,IR為制劑每日服入最大值,為6.84 g;C 為所有樣品某重金屬含量的平均值(mg/kg);EF為中藥制劑的暴露頻率,指導值為90 d/年;Ed為中藥服用年限20年;AT為平均壽命天數,指導值為25550 d;W為人體體質量,成年人體質量以63 kg計;10為安全因子;HBGV為重金屬的健康指導值,As、Cu、Hg、Pb和Cd的HBGV 分別為2.1、50、0.57、3.6、0.83 μg/kg[10]。若HI>1,風險出現概率較高,需要關注。通過計算,Cu、As、Cd、Hg、Pb的HI分別為0.003、0.245、0.010、0.009、0.012,均小于1,且5種元素的HI疊加值為0.279,低于安全閾值[11]。(2) HRA模型:②HI=(F×C/BW)/ADI,式②中,F 為消栓通絡片每日服用量,同式①中的IR; C 為藥品某重金屬的殘留值,同式①;BW 是人體質量,此處采用國際通用標準成人為55.9 kg;ADI 同式①中的HBGV 。經算Cu、As、Cd、Hg、Pb的HI值分別為0.005、0.393、0.016、0.014和0.018。5種元素的風險大小順序依次為As>Pb>Cd>Hg>Cu,5種重金屬的疊加風險值HI為0.446,小于1,提示該品種殘留的5種重金屬元素產生的安全風險較小[12]。

3 討論

中國藥典以人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1[3]對消栓通絡片中的三七進行了定性定量控制,這對三七原料的質量控制起到了一定作用,然而相對于多年生的三七根資源,三七莖葉資源易得、價格便宜,且均含有三七根的上述3種成分[13,14],不法企業便有可乘之機,以三七莖葉冒充摻偽三七根投料生產,達到以假亂真、以次充好之效。為遏制這種不法行為,不少科研者對含三七的中藥制劑的三七莖葉檢查方法進行了研究,范可青等[15]采用HPLC法對復方丹參片中三七莖葉進行檢查,通過比對三七莖葉、三七根和制劑色譜峰的差異評估該制劑三七的摻偽情況。相比于HPLC法,薄層色譜法快速、簡便、檢測成本低,本研究首次采用薄層色譜法建立了消栓通絡片中三七莖葉的篩查法,該法也可有效區分三七與三七莖葉的差異,能準確判斷消栓通絡片中是否存在三七莖葉冒充三七投料行為,可作為該制劑質量控制補充檢驗方法的一種借鑒。

Hg、Pb中毒嚴重影響中樞神經系統[16],As、Cd具有明確的致癌、致畸及致突變作用[17-19],中藥制劑若重金屬含量過高,可能會良藥變成毒藥,這有必要對中藥制劑中多種重金屬有害元素殘留量進行監測。本研究采用ICP-MS法測定消栓通絡片中5種重金屬殘留量,并首次采用GARM和HRA 2種模型對其重金屬可能導致的安全風險進行分析,結果表明所抽取的樣品整體上重金屬殘留量較低,出現安全風險的概率較低。但需要注意的是有個別生產企業樣品重金屬殘留量超標問題,如A企業樣品(批號:1812120)中As的含量是限量值的44倍以上,這有可能會超過人體耐受值,造成中毒損傷。該制劑的現行標準中無重金屬檢查項,部分生產企業在該制劑生產過程中可能會忽視外源性重金屬帶來的污染,為有效降低重金屬所致的安全風險,建議在現行標準中補充重金屬檢查項。