基于網絡藥理學聯合轉錄組學研究大黃-天南星治療缺血性腦卒中的分子生物學機制*

張曉璐，潘賜明，沈德連，段浩榮

1 廣西壯族自治區江濱醫院 廣西南寧 530001

2 云南中醫藥大學 云南昆明 650500

急性缺血性腦卒中是臨床常見的危急病之一，救治不及時則嚴重危害患者生活質量，甚至喪失生命；中醫在《黃帝內經》就有相關記載，譬如《靈樞·九宮八風》[1]載：“其有三虛而偏中于邪風，則為擊仆偏枯矣”。秦漢時中風的病因主要為外邪入侵、臟腑經絡氣血虛衰、氣機乖戾、攝飲不當等[2]。漢·華佗首次明確提出中風運用下法，如《中藏經·論治中風偏枯之法》載：“人病中風偏枯……在中則瀉之……瀉，謂通其塞也”[3]。《金匱要略·中風歷節病脈證并治》中用風引湯“除熱癱癇”，暗含了下法治療“癱”的思想[4]。同時方中將大黃作為首藥，后世醫家不斷完善，在金元時期得到發展，及至明清下法在治療中風達到了成熟與頂峰[5]。

基于數據挖掘結果顯示，大黃、膽南星為治療中風的常用高頻次藥物[6-7]。系統聚類結果顯示，大黃、膽南星為治療卒中的常見組合，關聯規則分析膽南星-大黃的支持度高達72.88%，兩者相須為用，通腑滌痰[8-9]。有鑒于此，本研究利用生物信息技術，建立大黃-天南星藥對與缺血性腦卒中靶點治療網絡，預測大黃-天南星藥對有效成分治療缺血性腦卒中的作用機制。

方 法

1 化學成分篩選活性成分靶點預測

采用TCMSP 數據庫，分別檢索大黃、天南星的化學成分，將篩選條件限定為口服利用度OB ≥28%，創建txt 文檔，將符合條件的有效成分下載備用。

將候選活性成分導入TCMSP 平臺、ETCM 數據庫（http： //www.nrc.ac.cn： 9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）[10]及SymMap 數 據 庫（http：//www.symmap.org/）[11]，查詢候選化合物所有的潛在靶點。

2 網絡構建和分析

通 過 檢 索5 個 數 據 庫（GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、PharmGkb）檢索疾病相關基因，分別下載相關基因，再利用R 語言VennDiagram 數據包得出大黃-天南星藥對潛在靶點和缺血性腦卒中相關靶點交集，最終將交集核心靶點構建PPI 網絡[12]。

3 GO 及KEGG 富集分析

將關鍵共有靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto-Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，最終使用R 軟件繪制GO 功能富集分析氣泡圖、KEGG氣泡圖以及通路圖[13]。

4 核心靶點的微陣列芯片驗證

為檢驗核心靶點的可靠性，以“stroke”為關鍵詞，檢索美國國立生物技術信息中心（NCBI）的GEO 數據 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），篩 選stroke相關的微陣列芯片數據集。通過GEOquery 包從GEO數據庫中下載，去除掉一個探針對應多個分子的探針，當遇到對應同一個分子的探針時，僅保留信號值最大的探針，然后通過箱式圖查看樣本標準化的情況，通過PCA 圖以及UMAP 圖查看樣本分組間聚類情況接著利用limma 包進行兩組的差異分析，具體差異分析的情況見「結果情況」的差異分析。

結 果

1 活性化合物篩選

對大黃-天南星藥對在TCMSP 數據庫搜索化合物，按照OB ≥28%且DL ≥0.18 的標準篩選出共22個活性化合，其中大黃15、天南星7，見表1。

表1 活性藥物成分

2 疾病相關基因獲取

通過檢索5 個數據庫，即GeneCards（5545 個）、Drugbank（28 個）、PharmGkb（1 個）、TTD（34 個）、OMIM（個）數據庫檢索疾病相關基因，見圖1。

圖1 疾病相關基因合并圖

3 大黃-天南星藥對防治卒中靶點韋恩圖

利用R 語言VennDiagram 數據包得出大黃-天南星藥對潛在靶點和卒中相關靶點交集，共發現37 個 共 同 基 因，KCNH2、PTGS2、PGR、PTGS1、HSP90AA1、DRD1、CHRM1、SCN5A、ADRA1A、CHRM2、ADRA1B、ADRB2、CHRNA2、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、NR3C2、ADH1C、RXRA、ADRA2A、SLC6A2、SLC6A3、AKR1B1、PLAU、LTA4H、MAOB、MAOA、ADRB1。確定為大黃-天南星藥對治療卒中的靶基因，結果見圖2。將共有靶點輸入String 數據庫，選擇置信度≥0.40 作為篩選的標準以構建藥物與疾病蛋白相互關系網絡圖PPI 網絡，顏色越深，節點越大，表示該靶點與藥物和疾病的相關性越強。線條越多表示之間的關聯度越大，見圖3。使用R 軟件查找PPI 網絡核心靶點，其中CASP9、CASP3 和CASP8 靶標體現出較高的中心度。

圖2 核心靶點篩選韋恩圖

圖3 核心靶點蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖

4 大黃-天南星藥對靶點與卒中相互作用網絡

將大黃-天南星藥對的候選化學成分與缺血性腦卒中基因靶點通過Cytoscape 3.7.1 建立大黃-天南星藥對成分靶點-缺血性腦卒中靶點群網絡，青色三角形代表中藥潛在活性成分，外邊藍色菱形代表潛在的作用靶點，兩者的相互關系如圖所示，見圖4。

圖4 活性成分-靶點蛋白網絡圖

5 大黃-天南星藥對治療缺血性腦卒中的GO 功能與KEGG 富集分析

對3 個核心靶點進行GO 功能富集分析，選取最具有統計學意義的前30 條，結果見氣泡圖，圖5。富集結果顯示：①在BP 中主要涉及膜電位的調節（regulation of membrane potential）、腺苷酸環化酶調節G蛋白偶聯受體信號通路（adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway）、G 蛋白偶聯的受體信號通路，與神經遞質水平的環狀核苷酸第二信使調節相結合（G protein-coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger regulation of neurotransmitter levels）等；②在CC 中靶點涉及膜區（membrane region）；③在MF中靶點相關分子功能主要包括G 蛋白偶聯的胺受體活性（G protein-coupled amine receptor activity）、神經遞質受體活性（neurotransmitter receptor activity）、突觸后神經遞質受體活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）等。

圖5 GO 富集氣泡圖

KEGG 富集結果提示大黃- 天南星藥對干預缺血性腦卒中主要涉及神經活性配體- 受體相互作 用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、神 經變性的途徑- 多種疾病鈣信號傳導途徑（Pathways of neurodegeneration - multiple diseases Calcium signaling pathway）、血清素能突觸（Serotonergic synapse）、心肌細胞的腎上腺素信號傳導（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、人類免疫缺陷病毒1 感染（Human immunodeficiency virus 1 infection）、帕 金森綜合征（Parkinson disease）等；見圖6。

圖6 KEGG 富集氣泡圖

6 核心靶點微陣列芯片驗證結果

最終選定微陣列芯片數據集GSE97537。該數據集基于GPL1355[Rat230_2]Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array 陣列平臺，包括7 例腦卒中RNA 樣本和5 例正常RNA 樣本。由PCA 圖-樣本聚類情況可見（圖7），基因表達譜區分度良好，保證了后續差異表達分析的準確性。過濾后的分子總數為14378 個，其中滿足|log2（FC）|＞1 & p.adj＜0.05 閾值的ID 有223個，在這閾值下，在實驗組（分組2）中高表達（logFC為正）的數目有215 個，在參考組（分組1）中高表達（logFC 為負）的數目有8 個；滿足|log2（FC）|＞1.5 &p.adj＜0.05 閾值的ID 有79 個，在這閾值下，在實驗組（分組2）中高表達（logFC 為正）的數目有79 個，在參考組（分組1）中高表達（logFC 為負）的數目有0 個；滿足|log2（FC）|＞2 & p.adj＜0.05 閾值的ID 有34 個，在這閾值下，在實驗組（分組2）中高表達（logFC 為正）的數目有34 個，在參考組（分組1）中高表達（logFC為負）的數目有0 個；如圖8 所示，樣本分開并且PC1和PC2 的比例高，說明分組間差異明顯，后續差異分析有意義的結果可能會比較多；經典差異分析-火山圖，當前閾值為|logFC|＞1 & 圖中P值＜0.05，見圖9。DEGs 與核心靶點取交集后得到3 個交集基因CASP3、CASP9 和CASP8，證明了上述分析的可靠性。

圖7 腦卒中數據集主成分分析

圖8 腦卒中樣本DEGs 火山圖

圖9 GSE97537 交集基因CASP3、CASP9 和CASP8表達量柱狀圖

7 交集基因CASP3、CASP9 和CASP8 表達量分析

首先，我們對微陣列芯片數據集GSE97537 中交集基因的達量進行了統計分析，如圖9 所示；從統計描述表中可以看到：在Casp3 組中，實驗組的平均水平為（9.067±0.475）對照組的平均水平為（8.087±0.028）；在Casp9 組中，實驗組的平均水平為（7.887±0），對照組的平均水平為（7.888±0）；在Casp8 組中，實驗組的平均水平為（6.764±0.102），對照組的平均水平為（6.53±0.068）；獨立樣本T 檢驗結果顯示：在Casp3 組中，對照組低于實驗組的平均水平，兩組的差值為-0.98（-1.46 ～-0.499），差異具有統計學意義（t= -4.540，P= 0.001）；在Casp9 組中，對照組低于實驗組的平均水平，兩組的差值為0（-0），差異具有統計學意義（t= 4.857，P= 0.001）；在Casp8 組中，對照組低于實驗組的平均水平，兩組的差值為-0.234（-0.351 ～-0.116），差異具有統計學意義（t= -4.431，P= 0.001）。

討 論

近15 年我國缺血性腦卒中患者由1044/10 萬上升至1256/10 萬，現患人數高居世界首位，而且具有高發病率、高復發率、高致殘率和高病死率的特點[14]。中風發作期多見實證，其中痰、瘀是主要病理因素[15-16]。因此在發作期治療則急則治標，《金匱要略》[17]“夫病痼疾加以卒病，當先治其卒病，后乃治其痼疾也”。金元時期強調中風“內傷”學說，強度火、虛、痰等致病因素[18]。朱丹溪特別重視痰邪這一致病因素，如《丹溪心法·中風》[19]載：“中風大率主血虛有痰，治痰為先”。力倡治痰在中風病治法中的指導作用[20]。筆者認為，中風可以是由郁到痰瘀的過程，先有無形之郁，此時氣機阻止，久則有形之邪內生，痰瘀則為代表。黃元御從“土濕陽衰，木郁侮土”立論治療中風，著重調整臟腑氣機[21]。臨床所見，閉證多而脫證少，初起即出現脫證者更少[22]。對于發作期患者，標實是當務之急，因此，通腑法作為中風病急性期的常用治法受到臨床普遍重視和廣泛應用[23]。中風治法中通、調最為關鍵，其次補之[24]。

通腑瀉濁法能夠減輕痰瘀、增強胃腸蠕動，調節腦腸肺軸功能，進一步減輕中樞神經系統損傷，改善患者神經功能缺損[25]。生大黃逐瘀通經、瀉熱通腸，《神農本草經》載：“味苦，寒。主下淤血，血閉，寒熱，破癥瘕積聚，留飲，宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調中化食，安和五臟”[26]。通過內服、保留灌腸均具有較好的臨床療效[27-28]。大黃提取物通過降低炎癥水平，進一步抑制缺血側腦細胞凋亡，最終發揮腦保護作用[29]。大黃的作用機制已經得到了實驗驗證。膽南星祛風化痰，李中梓的《雷公炮制藥性解》載：“味苦、辛，性平，有毒，入脾、肺二經。主中風牙關緊閉，痰盛麻痹，下氣破堅積，消癰腫，利胸膈，散血墮胎，搗敷疥癬瘡毒并蛇蟲咬傷。沸水泡七次，以牛膽汁收其末入膽，久懸風處更佳”[30]。缺血性中風痰瘀阻絡則貫穿本病始終，故治療清熱祛痰為著力點，膽南星清熱化痰以通腑，能夠快速減輕病癥，防治繼續發展[31]。膽南星為天南星炮制品，專主風痰，清火化痰作用較強[32]。大黃成分類型和藥理作用主要有蒽醌類：抗病毒；蒽酮類：抗氧化、抗炎和調節機體免疫等；吡喃酮類：抗氧化；二苯乙烯類：清除自由基、抗衰老等；本丁酮類：抗炎鎮痛；酰基糖苷類：促進細胞免疫；萘苷類：雌激素樣作用。膽南星成分類型和藥理作用主要有發揮性物質：抗菌、抗病毒等；膽汁酸類：解熱、抗菌、抗炎及抗病毒等[33]。本研究發現治療缺血性腦卒中的大黃-天南星藥對活性成份主要有大黃素、β-谷固醇、谷甾醇、托拉內酯、大黃酸等，大黃素和大黃酸具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等生物活性，同時能夠增加斑塊的穩定性[34]。

PPI 網絡表明，靶標體現出較高的中心度有CASP9、CASP3 和CASP8；同時這三個基因是GEO數據庫中轉錄組學微陣列芯片數據集GSE97537 中交集基因，微陣列芯片數據集GSE97537 同步驗證了CASP9、CASP3 和CASP8 在腦卒中組和健康組的表達量對比有差異。

CASP3 基因編碼的蛋白質是一種半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在細胞凋亡的執行階段起著核心作用。編碼的蛋白質在裂解和激活甾醇調節元件結合蛋白以及半胱天冬酶6，7 和9 的同時，裂解和失活聚（adp -核糖）聚合酶。這種蛋白質本身由caspase 8，9和10 處理。它是參與淀粉樣β 4A 前體蛋白裂解的主要半胱天冬酶，該蛋白神經元死亡有關。

CASP9 和CASP8 基因編碼半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的成員。連續激活的caspases在細胞凋亡的執行階段起著核心作用。半胱天冬蛋白酶作為非活性的前酶存在，在保守的天冬氨酸殘基上經過蛋白質水解過程產生大大小小的兩個亞基，它們二聚形成活性酶。CASP9 蛋白可經過細胞色素c和凋亡肽酶激活因子1 的蛋白復合物凋亡小體的自蛋白水解處理和激活；這一步被認為是caspase 激活級聯中最早的一步。這種蛋白質被認為在細胞凋亡和腫瘤抑制中起著重要作用CASP8 蛋白參與Fas 和各種凋亡刺激引起的程序性細胞死亡。該蛋白的n端類FADD 死亡效應域提示其可能與fas 相互作用蛋白FADD 相互作用。這種蛋白質在亨廷頓病患者受影響的腦區不溶性部分中被檢測到，但在正常對照組中沒有檢測到，這暗示了它在神經退行性疾病中的作用。CASP 參與細胞凋亡，是調節細胞凋亡的中心環節[35]。

CASP3 在小膠質細胞中表達活躍，而活躍的CASP3 表達僅限于Ⅱ/Ⅲ層，CASP3 被認為在發育過程中參與神經元凋亡，被認為是腦缺血、創傷性腦損傷、脊髓損傷和腦出血后細胞死亡的關鍵介導因子，CASP3 也被證明在細胞增殖和分化中發揮非凋亡作用[36]。CASP3 在腦卒中恢復過程中的非凋亡作用。一項研究顯示，由缺血腦培養的新生神經元前體細胞表達的裂解CASP3 抑制了其自我更新；同時神經原性小龕中局部上調裂解CASP3 對新生神經元前體細胞的增殖、遷移和成熟非常重要，抑制CASP3 活性可以改善腦卒中后的功能恢復[37]。CASP9 是caspase 蛋白酶家族的一員，是caspase 蛋白酶凋亡的啟動者，是腦缺血神經退行性變的調節因子，也是促進腦卒中細胞死亡CASP6 激活的早期中介因子[38]。

CASP8 在大多數皮質神經元中均可檢測到組成性表達，CASP8 表達主要在V 層，且早在永久性大腦中動脈閉塞致大鼠局灶性卒中后6h，就發現蛋白水解過程產生活性形式的CASP8[39]。在人缺血性中風受試者死后組織中的小膠質細胞/巨噬細胞中激活CASP8 和CASP3，CASP8 激活后裂解下游的caspase并導致細胞凋亡[40]。

綜上，本研究運用網絡藥理學和GEO 數據庫轉錄學驗證的方法分析了大黃-天南星治療缺血性腦卒中的作用機制，得出的結論是：大黃-天南星對藥可能是通過抑制CASP3，CASP8 和CASP9 通路進而抑制細胞凋亡而發揮治療缺血性腦卒中作用。