“黃芪-肉桂”藥對治療前列腺增生的分子機制探討*

胡芳，朱閩，張澤朝，楊青云，張禹姝

1 廣西中醫藥大學 廣西南寧 530000

2 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 廣西南寧 530000

BPH是中老年男性最常見的疾病之一[1]，因前列腺上皮和基質細胞的過度增殖導致腺體增大引起的下尿路癥狀是其主要臨床表現[2]。現代醫學治療BPH 的常用藥物是5α 還原酶抑制劑和α 受體阻滯劑，均需要長期用藥，且有一定的不良反應發生[3]。BPH 屬中醫“癃閉”“精癃”范疇，諸多古代文獻及現代研究表明，中醫藥治療本病有一定的優勢和潛力[4]。

腎虛血瘀證的BPH 最常見的臨床證型，以溫補腎陽、活血化瘀為治療原則[5]。肉桂-黃芪是張春和教授治療腎虛瘀阻的BPH 喜用藥對且是根據數據挖掘治療前列腺增生支持度最高的藥對[6]，有臨床研究發現用黃芪和肉桂配對使用的如前列通竅膠囊、補腎消癃方治療腎虛血瘀證的BPH 安全有效[7-8]。但當前黃芪和肉桂兩味配對治療BPH 的作用機制尚未完全清楚，因此本研究將應用網絡藥理學與分子對接揭示黃芪-肉桂治療BPH 的活性成分及藥效機制，為其臨床使用提供生物學信息支持和為后續基礎研究提供參考。

材料及方法

1 中藥化學成分與靶點的搜集

從TCMSP 平 臺（http：//lsp，nwu.edu.cn/tcmsp.php）中以及文獻補充檢索黃芪、肉桂，篩選條件設置為口服利用度（oral availability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness ，DL）≥0.18，再將篩選得到有效成分通過其MOL.ID 號搜尋單味藥成分作用靶點。剔除重復作用靶點后將靶點信息經Uniport 數據庫標準化。

2 構建“中藥-成分-靶點”網絡圖

利用Cytoscape 3.8.2 軟件將得到黃芪-肉桂有效成分和作用靶點的相互作用制作中藥“有效成分-靶點”網絡圖。

3 中藥與BPH 共有靶點的收集

以“Benignprostatichyperplasia”為 關 鍵 詞，分別 運 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、Durgback（https：//go.drugbank.com/）平臺檢索 BPH 相關靶點。將篩選得到的BPH 靶點刪除重復靶點后和黃芪、肉桂靶點 導 入Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）網站得到交集靶點。

4 PPI 網絡構建及網絡拓撲分析

將黃芪- 肉桂與BPH 的交集基因導入String（https：//string-db.org/）數據庫，設置對象為（homo sapiens）、取最高置信度0.900，隱藏游離基因節點，然后得到蛋白互作關系。結果導入Cytoscape3.8.2 軟件中，選擇”network Analyzer”，得到網絡拓撲學參數。介度中心值（Betweennesscentr ality.BC）最短路徑穿過單個節點的次數，緊密中心值（closeness centrality.CC）是節點間溝通的難易程度。把Degree 值的二倍中位數以上，BC 和CC 的中位數上作為衡量標準篩選養中藥與疾病的核心成分靶點，并制作PPI 網絡互做圖。

5 GO 和KEGG 富集分析

通過Metascape（http：//metascape.org/）平臺進行GO（gene ontology）功能、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，將所得交集靶點導入基因列表中，設置對象為”human”，選擇個性化分析，設置最小重疊為（Min Overlap）為3、P值取0.05、最低濃縮度為1.5。得到結果后，制作GO 富集分析圖和KEGG Pathway 通路圖。

6 分子對接

通 過Cytoscape3.8.2 軟 件 中”network Analyzer”功能分析得到degree 值和中間介度值排名第一的中藥成分選為中藥大分子受體。通過TCMSP 數據庫獲取成分小分子配體結構，并利用PDB（http：//www1.rcsb.org/）平臺獲取核心蛋白大分子受體結構。蛋白質 晶 體 結 構 由RCSB PDB 數據 庫（http：//www.rcsb.org/）獲取（PDB 編號：）。將大分子和小分子導入AutodockTools1.5.6 軟件中進行對接驗證。經過去水，加氫處理后，并進行受體結構準備工作。使用Open Babel 及Autodock vina 程序對小分子庫進行拆分等準備工作。最后導入pymol 進行對接結果的可視化。

結 果

1 黃芪、肉桂有效成分和靶點的獲取

從TCMSP 數據庫中，以OB ≥30%和DL ≥0.18為篩選條件，得到20 種符合條件的有效成分。通過文獻搜索肉桂有3 個成分，雖不符合篩選條件，但具有較好的抗前列腺增生的作用，也納入研究。黃芪-肉桂成分作用靶點經合并去重后得到206 個靶點。黃芪-肉桂有效成分基本信息見表1。

表1 黃芪-肉桂有效成分表格

2 構建中藥“有效成分-靶點”網絡圖及關鍵化合物篩選

采用Cytoscape3.8.2 軟件，繪制中藥“有效成分-靶點”網絡圖（見圖1），共221 個節點（Nodes），434 條邊（Edges）。根據Degree 值排序得到前3 的成分化合物為懈皮素、山柰酚、油酸。見表2。

圖1 中藥“有效成分-靶點”網絡圖

表2 前3 化合物Degree 值表

3 疾病和交集基因的獲取

經GeneCards、OMIM、Durgback 平 臺 獲 取BPH靶點4468 個，其中最大score 評分為94.51，最小評分為0.14。對所得數據卡兩次中位數和刪除重復值后得到3951 個疾病靶點。黃芪-肉桂與BPH 靶點取交集，得到交集基因165 個。韋恩圖見圖2。

圖2 中藥-疾病靶點韋恩圖

4 PPI 網絡制作和核心蛋白的獲取

經String 平臺分析隱藏游離節點后得到114 個節點，1721 條邊，平均節度點為9.28。下載TSV 文件導入Cytoscape3.8.2 后經網絡拓撲學分析，把Degree值的二倍中位數以上，BC 和CC 的中位數上靶點作為中藥復方的核心作用靶點，根據拓撲學參數分析，前五靶點基因為AKT1、IL-6、INS、TP53、TNF。隨著Degree 值和連接分數的增高，節點的形狀越大，顏色越鮮明、線條越粗，蛋白的地位也就越重要。見圖3。

5 GO 與KEGG Pathway 富集分析

經Metascape 平臺分析，GO分析結果顯示：生物過程（Biological Processes.BP）4172 條、分子功能（Molecularfunction.MF）503 條和細胞成分（Cellular Components.CC）共285 條。BP、MF 和CC 分別前10條見圖4。BP排名靠前的為活性氧代謝過程、對藥物的反應、對類固醇激素的反應、細胞對化學應激的反應等。MF 主要涉及核受體活性、配體激活的轉錄因子活性等。CC 主要由突觸后膜、受體復合體、細胞質核周區域、轉錄因子復合體等構成。提示黃芪-肉桂可能通過調控細胞核轉錄因子、參與脂多糖等反應來干預治療BPH。

圖4 GO 富集分析圖

為了探討黃芪-肉桂在BPH 治療中的信號通路機制，我們進行了KEGG 富集分析。如圖5 所示，顯示了前20 條信號通路，包括IL-17 信號通路、TNF 信號通路等。

圖5 KEGG Pathway 富集分析圖

6 化合物靶點-核心蛋白分子對接驗證

將篩選得到黃芪-肉桂的拓撲學參數排名第一的中藥化合物小分子槲皮素，PPI 核心蛋白拓撲學參數第一的大分子受體（AKT1、IL-6、INS、TP53、TNF）由AutodockTools1.5.6 軟件進行分子對接。化合物與蛋白質的對接結果見表3。結合能＜-1kcal.mol-1，提示具有結合活性。隨著結合能越低，受體與配體之間的親和力越高，構象越穩定。根據結果顯示，分子對接結合熱能都＜-1kcal.mol-1，說明自發間可以相互結合，其中槲皮素與TNF（-7.16）的結合熱能最低，表示結合活性較最好，導其入pymol 進行對接結果的可視化，結果見圖6。

圖6 槲皮素與TNF 的分子對接示意圖

表3 分子對接結果

討 論

BPH 是一種良性增生性疾病，在臨床上治療本病有癥狀復雜和纏綿難愈的難點[4]。現代醫學BPH 的發病機制尚未完全揭示，可能與激素、炎性反應、血管生長和細胞增殖與凋亡障礙有關[9]。然而，臨床上缺乏特殊的治療方法[10]。BPH 在中醫上屬“癃閉”“精癃”范疇，腎虛血瘀是其發病的基本病機也是臨床上最常見的證型[8]，以溫補腎陽，活血化瘀為治則。黃芪在《本草逢源》中記載黃芪有“補腎中氣不足”和“而能通調血脈，流行經絡”之效，因此其能益氣活血。肉桂有補火助陽，引火歸原，散下焦之陰寒，助膀胱氣化之功，因而黃芪和肉桂配合使用則能達溫補腎陽，活血化瘀之功。但黃芪-肉桂治療BPH 的現代醫學確切作用機制尚不明確。因此，有必要利用網絡藥理學和分子對接探索該藥對在BPH 治療中的作用機制。

通過對黃芪-肉桂“有效成分-靶點”網絡圖，我們得到黃芪-肉桂化合物治療BPH 的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、油酸等。槲皮素和山柰酚均屬于黃酮類藥物，都具有抗炎和抗氧化的功效[11]，研究表明，槲皮素可降低BPH 患者前列腺癥狀評分和提高尿流量[12]，山柰酚能明顯降低BPH 大鼠前列腺指數，改善BPH 大鼠的病理結構[13]。兩者都能減少前列腺上皮細胞的增殖，降低PSA 水平和AR 基因的表達[13-14]。油酸可抑制BPH 大鼠的LNCaP 增殖[15]和5a-還原酶活性（5AR）[16]。

在黃芪-肉桂對BPH 起治療作用的114 個靶點的PPI 網絡中，AKT1、IL6、P53、TNF 等是基于節點度前5 個靶點。根據分子對接也證明AKT1、IL6、P53、TNF 與黃芪-肉桂具有結合活性，因此這些靶點可能在黃芪-肉桂治療BPH 中發揮重要作用。上述靶點主要與細胞增生與凋亡、炎性反應有關。Akt1 是一種多功能蛋白質，與細胞生長，存活和增殖的調節有關[17]。Akt1 在正常的前列組織中有表達[18]，AkT-1 表達升高會增加BPH 患者的前列腺大小[19]。p53 蛋白是一種抗凋亡蛋白，在BPH 大鼠中p53 的mRNA 表達較正常組大鼠會下降[20]，p53 的表達下降會促進BPH 上皮細胞生長[21]。IL6 和TNF-α 是促進前列腺上皮細胞增生的促炎蛋白[14]，臨床上發現BPH 患者IL-6、TNF-α 的水平顯著升高[22]，并且有研究發現IL-6 水平與PSA、PSAD 表達[23]以及TNF-α 濃度與PV 、前列腺癥狀評分均呈正相關[24]。有研究表明肉桂中的肉桂醛可顯著降低BPH 大鼠IL-6、TNF-α 水平，降低前列腺增生指數和減輕前列腺結構組織病理學變化[25]。

根據KEGG 分析得到黃芪-肉桂治療BPH 主要途徑包括IL-17 信號通路、TNF 信號通路、HIF 1 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。在IL-17 信號通路[26]和TNF 信號通路[27]中，IL-17 和TNF-α 都是多功能促炎細胞因子，參與宿主防御、炎性反應疾病等過程。與健康患者相比，BPH 患者IL-17、TNF-α 表達明顯升高[28]。IL-17[29]和TNF-α[30]的表達升高可以通過刺激 IL-6 和 IL-8 的產生，從而促進BPH 中基質和上皮生長[29]。HIF-1 信號通路促進血管生成，它有助于包括BPH 在內的諸多增生性疾病的進展[31]。升高的HIF-1α 能上調BPH 大鼠前列腺組織中VEGF 和 bFGF 的表達進而誘導血管內皮誘導增殖、遷移、存活、發芽并最終擴展原始血管網絡[32]，為生長中的前列腺細胞的存活提供營養支持和氧化作用[7]。PI3K-Akt 信號通路有促進細胞增殖且抑制細胞凋亡的作用[33]，研究發現BPH 患者前列腺組織中P13 和AKT 表達水平升高，并與前列腺體積正相關[12]。MAPK 信號轉導通路在細胞生長、分化、凋亡等生物過程中發揮關鍵作用[34]。MAPK 信號通路分支包括ERK、p38 和JNK 等。其中ERK 激活主要控制細胞增殖和分化及抗細胞凋亡的功能，p38 和 JNK 激活往往與促細胞凋亡的作用相關[35]。實驗表明BPH條件下ERK 表達水平明顯升高，p-JNK 和p-p38 表達水平顯著下降[36]。p38 表達升高能抑制BPH-1 的生長并增加細胞凋亡[34]。

綜上所述，黃芪-肉桂中的槲皮素、山柰酚、油酸等有效成分可能通過作用于AKT1、IL6、P53、TNF 等靶 點，調 控IL-17、TNF、 HIF 1、MAPK 和PI3K-Akt等信號通路以影響可能會導致前列腺增生的原因如雄激素/AR 信號通路激活升高、炎性反應及血管增生來抑制前列腺體積的異常增大和改善BPH 患者臨床癥狀等作用。