程 靜李麗嬋汪少蕓余立揚余 劼蔡茜茜
(1. 福州大學生物科學與工程學院,福建 福州 350108;2. 福建光陽蛋業股份有限公司,福建 福清 350301)
皮蛋作為中國特有的傳統食品,具有歷史源遠流長,入口爽滑,回味綿長,營養健康等特點。因皮蛋腌制過程中蛋白質和脂肪更多地被分解成易于人體消化吸收的小分子肽、氨基酸和脂肪酸,其營養價值也得以提升[1],并具有多種生物活性,如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[2-4]。中醫認為皮蛋性涼,可治眼疼、牙疼、高血壓、耳鳴眩暈等疾病。但由于傳統皮蛋加工工藝繁瑣、場所受限、重金屬鉛的使用,限制了其推廣和食用。
皮蛋的制作原理是強堿穿透蛋殼后,使得蛋清蛋白逐步變性展開暴露出內部的巰基和疏水基團,經物理或化學作用力聚合交聯形成凝膠;隨堿液向蛋黃的逐漸滲入,蛋黃蛋白在強堿誘導下發生變性,隨后發生一系列的變化,最終通過化學作用力聚集形成致密均勻的蛋黃凝膠網絡結構[5-6]。皮蛋的加工方法較多,但基材基本一樣,都是用堿、鹽、金屬化合物、茶葉、水等加工而成。腌制期間,禽蛋內部結構主要發生4個變化:化清、凝固、轉色和成熟。
目前,有關皮蛋加工工藝和理化特性的變化規律的研究尚未見報道。文章擬對皮蛋的傳統加工工藝,以及新興加工工藝以及皮蛋形成過程中pH、水分、游離氨基酸、蛋白質、礦物元素等的變化規律進行全面綜述,以期為改進皮蛋加工技術、研究皮蛋品質形成機理與質量控制、產品開發提供依據。
在傳統加工工藝中,滾粉法主要用來生產硬心皮蛋。其主要步驟為:將CaO放入容器中,加入適量水得到CaO粉末,將其與Na2CO3、NaCl混合,得到加工皮蛋所用粉末。將煮熟的紅茶水與泥土混勻,挑選新鮮鴨蛋,涂上一層薄薄的泥漿,于上述制得的粉末中滾動后逐個放入陶罐中,并用泥漿封口,室溫下靜置20~30 d。該方法的缺點是成品蛋很難檢驗、泥漿不可重復利用、生產周期長、不符合衛生檢疫等要求,難以實現工業化生產。
涂布法通常用來生產溏心皮蛋,其主要步驟為:將CaO、Na2CO3和茶葉放入容器中,加入沸水后使其自然冷卻,加入研磨成粉的PbO(現已棄用)和鹽,攪拌溶解,加入干土和草木灰混合均勻。挑選新鮮鴨蛋,清洗干燥后涂上泥漿,于稻殼上滾動(防止鴨蛋間的相互粘連),然后逐個放入陶器罐中,并用泥漿封口。涂布法腌制周期較長,夏季一般需腌制40 d,冬季需要50 d以上,其缺點同滾粉法。
浸泡法是將所有適量的成分混合在一起制備成腌漬液,然后將完整新鮮的鴨蛋放入腌漬液中一定時間,浸泡期間定期檢查樣品蛋。浸泡法是目前常用的皮蛋加工方法。包歡歡等[7]使用浸泡法研究了溫度對皮蛋凝膠特性的影響,采用的腌制料液配比為CuSO40.4%、 NaOH 4.5%、 NaCl 4%、紅茶2%,溫度為15~35 ℃。結果表明,當腌制溫度為15 ℃時,皮蛋內的總巰基含量相對最小,而二硫鍵含量相對最高,因而證明該溫度可以促進化學鍵的生成,如離子鍵和二硫鍵,從而使皮蛋具有更好的凝膠性能。
傳統皮蛋加工方法中腌漬的料液或者泥漿不可重復使用,會導致資源浪費、環境污染。此外,傳統的皮蛋加工方法還存在加工周期長、加工過程復雜、難以符合食品安全生產標準等問題,嚴重限制了皮蛋及皮蛋相關產品的發展。
呂峰等[8]在傳統浸泡法的基礎上采用梯度控溫技術來加工皮蛋,在加工過程中的前、中、后期分別設置了不同的腌漬溫度(25,23,20 ℃)。此法能使NaOH快速穩定地滲入蛋內,加速蛋清著色和蛋清凝膠的形成,并保持適宜的凝膠強度。同時,皮蛋的成品率可提升12.5%,腌漬周期也可縮短15 d左右。
超聲波處理已被廣泛應用于食品行業各個領域,主要有無損檢測、超聲提取、超聲殺菌等[9-11]。應用于皮蛋腌制過程中,超聲波可通過機械效應和空化作用加速腌漬液的擴散(圖1)。使用超聲波處理可以使料液中的NaOH、金屬離子和鹽均勻滲透到禽蛋內部,促使蛋白質凝固,防止料液滲透不勻[12]。吳勛維等[13]研究了超聲波對皮蛋成熟期的影響,確定超聲波處理可以加速料液滲透,使禽蛋內部的pH迅速上升,同時增加了皮蛋的硬度、彈性和咀嚼性。并確定了超聲時間為60 min/d、腌制時間為20 d的加工工藝。與未使用超聲處理組的皮蛋組相比,腌制周期縮短了50%。

圖1 超聲波輔助加工技術
真空減壓技術是一種將真空技術應用于腌制行業的加工方法,目前常用于肉類、水果和蔬菜的腌制、浸漬[14-15]。真空減壓法制備皮蛋是在負壓條件下,促進料液快速進入到蛋殼內,以提高皮蛋制作效率,縮短皮蛋制作周期。該方法主要利用了流體動力學機制、變形松弛現象、勒夏特列原理和分子熱運動活化能增大的原理來加快皮蛋的腌制速度[10]。在真空條件下,皮蛋內部的氣體和部分水分蒸發,導致壓力降低,在壓差的作用下,可促進料液進入皮蛋內部。此外,真空狀態下皮蛋的內容物會發生膨脹,有利于腌制液向蛋內擴散。腌漬液在真空狀態下活化能力增加,沸點降低,從而引起分子熱運動的增大。在這些機制的共同作用下,腌漬液進入皮蛋內部的速率大幅度提升,從而有效縮短了皮蛋的腌制周期[17-19]。
用于腌制皮蛋的真空設備包括真空泵、密閉容器(腌制罐)、真空壓力計、控制閥和其他部件。圖2為真空減壓設備組件和加工原理。真空技術可使咸蛋腌制周期縮短50%[20],皮蛋腌制時間縮短約2/3,真空腌制會導致皮蛋清的快速變化[17-18]。在腌制的第5天大多數皮蛋清蛋白質會消失,該方法顯著快于傳統的腌漬方法,且傳統方法和真空減壓方法加工的皮蛋在風味上無顯著差異。真空腌制速度比超聲波輔助技術的快,當前真空腌制設備的性能相當可靠,其由不銹鋼制成,結構緊湊,噪音低,易于操作。但該技術要實現工業應用,腌制的均勻性仍需要改進。真空處理過程中,應精確調節真空度、真空持續時間和真空減壓速度,以避免蛋殼破裂。

圖2 真空減壓技術加工皮蛋機理示意圖
利用脈動壓力加工技術加工皮蛋,是將待加工的禽蛋置于壓力容器內,在數秒內通過氣泵向壓力容器施加固定壓力,并保持一段時間后,在數秒內迅速將壓在容器內的壓力降低至常壓,并保持固定的時間,其加工原理和工藝流程如圖3所示。加壓階段,滲透壓增加以加速液體滲透到蛋內;壓力釋放階段,禽蛋內部的壓力高于外部壓力,加速禽蛋內部的氣體和水向外部遷移,為加壓時高濃度溶液的滲透提供了空間[21]。Yuan等[22]發現脈沖壓力能通過改變殼和膜的微觀結構以及水的分布促進氣體和鹽的滲透。郭策等[23]優化了脈動壓皮蛋加工工藝:加壓幅值135.00 kPa、加壓時間7.80 min、常壓時間20.03 min。王俊鋼等[24]在高壓幅值122.20 kPa、 NaOH濃度7.56%、腌制時間86.70 h的條件下,成功制備出品質優良的皮蛋,極大地縮短了腌制時間。

圖3 脈動壓加工技術
近年來,有研究者[22,25]嘗試將脈沖壓力技術與其他技術結合來腌制皮蛋,如超聲波脈沖壓力技術。與單一脈沖壓力處理相比,這種方法減少了蛋清和蛋黃之間的滲透壓差異,腌制蛋的味道得到了改善。后續可以結合不同的腌制方法以更快的效率、更低的成本獲得高質量的皮蛋。
皮蛋主要分為蛋清、蛋黃和蛋殼。蛋清又稱蛋白,是全蛋的主要組成部分之一,含有84%~89%的水分,10%~11%的蛋白質,約0.2%的脂肪和0.8%的灰分。腌制過程中,皮蛋受到強堿的作用,pH顯著增加,蛋清從原來的半透明液體逐漸形成凝膠[26]。腌制過程中皮蛋清中水分和pH變化原理如圖4所示,隨著腌制時間的增加,皮蛋清中的含水量顯著降低,pH值先增加后降低,這是由于腌漬初期,浸漬液中的強堿穿過蛋殼滲透到蛋清中,導致蛋清的pH值在短期內快速升高。腌制后期,pH值會降低,是由于重金屬離子的“堵孔”效應導致堿滲透速率降低,同時,蛋清中的堿液不斷滲透到蛋黃中,導致蛋清pH在后期略有降低[27-28]。皮蛋清中的含水量顯著低于鮮蛋清,一方面可能是堿處理導致蛋清變性成凝膠,部分水分流失;另一方面可能是腌制過程中,皮蛋內外存在滲透壓,導致水分從蛋清轉移到腌制液中[28]。

圖4 皮蛋清和皮蛋黃中水分和pH的變化
經過腌制,皮蛋黃變硬,特別是在卵黃膜附近,成為外蛋黃;而內部為黏稠的液體蛋黃,成為內蛋黃。外部蛋黃在腌制前期水分含量顯著下降,隨后保持穩定,水分的減少主要是因為蛋清和蛋黃之間的滲透壓差,導致水分從蛋黃遷移到了蛋清。內部蛋黃含水量逐漸增加可能是由于外部蛋黃凝固導致部分水分向內部蛋黃遷移,也可能是由于堿性條件下蛋黃蛋白交聯脫水,而外部蛋黃的凝固導致水被累積在內部蛋黃中[6,29],從而使內部蛋黃的水分增加。最終皮蛋內部和外部蛋黃的含水量發生很大差異,主要源于堿浸潤程度不同。腌制前期,外部蛋黃逐漸形成較厚的一層凝膠,可以一定程度上防止堿的進一步滲透,與內部蛋黃相比,外部蛋黃具有更高的pH,外部蛋黃的pH先增加后略有下降,這種現象主要是由于內部蛋黃、外部蛋黃以及蛋清之間的滲透壓差引起的。pH增加主要是由于蛋清的堿液向蛋黃滲透,隨著“堵孔”效應的發生,腌漬液中堿液滲透到蛋清的速度降低,當蛋清滲透到外部蛋黃的堿液小于外部蛋黃滲透到內部蛋黃中時,外部蛋黃pH降低,而內部蛋黃的pH仍呈持續上升趨勢,但由于外部蛋黃凝膠的形成會阻礙堿液向內部蛋黃滲透,因此最終外部蛋黃的pH顯著高于內部蛋黃。
綜上,腌漬過程的腌漬液、蛋清、內部蛋黃和外部蛋黃之間由于滲透壓差導致堿液和水分的遷移,而金屬離子的“堵孔”效應、蛋清凝膠和外部蛋黃凝膠的形成會阻礙堿液和水分的遷移。這些因素共同作用調節堿液和水分的遷移,最終導致蛋清pH先增加后降低,水分逐漸降低;外部蛋黃pH先增加后降低,水分逐漸降低;內部蛋黃的pH和水分逐漸增加。
Zhao等[30]利用SDS-PAGE電泳技術研究了腌制過程中蛋清蛋白組成的變化,結果發現鴨蛋清中主要含有卵轉鐵蛋白、卵黏蛋白、卵清蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶[圖5(a)]。隨著腌制時間的增加,卵黏蛋白、卵轉鐵蛋白和卵類黏蛋白消失,卵清蛋白條帶變淺。這可能是卵黏蛋白、卵轉鐵蛋白和卵類黏蛋白含量太少,在堿性環境下易被降解。而卵清蛋白占蛋清蛋白的54%,在堿的作用下條帶變淺但未完全消失,表明卵清蛋白在堿性環境下并未被完全降解。
新鮮鴨蛋黃中大部分蛋白條帶分布在15~200 kDa。鴨蛋中的脂質和蛋白質結合可以形成脂蛋白,主要包括高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)[6]。LDL、HDL的理論分子量分別為100~180,47~80 kDa。新鮮蛋黃通過簡單的離心可以得到顆粒和蛋黃漿兩部分。蛋黃漿是一種由85%的LDL和15%的蛋黃球蛋白混合而成的復合物,而顆粒則由70%的HDL、16%的卵黃球蛋白和12%的LDL組成[31]。Xue等[1]研究表明,HDL在外蛋黃凝膠的形成中起主要作用,而LDL在內蛋黃的形成中發揮主要作用。有研究[32]表明,顆粒狀脂蛋白由于具有球狀結構比較穩定,而蛋黃漿蛋白穩定性較差,因此,蛋黃漿蛋白更容易降解。相反,圖5(b)的內蛋黃的蛋白和新鮮鴨蛋黃相似但略有降低,表明內蛋黃降解量少[31]。而外部蛋黃在堿性環境下幾乎完全消失[圖5(c)],表明外部蛋黃發生了較大程度的降解,且在分離膠頂部可以看到較強的條帶,說明在堿性環境下蛋黃蛋白發生聚集形成了高分子量的交聯蛋白。此外,外蛋黃蛋白主要條帶分布于15 kDa左右,可能是因為外部蛋黃蛋白降解為小分子量肽和氨基酸[6]。外部蛋黃的降解大于內部蛋黃,可能是由于外部蛋黃的堿濃度大于內部蛋黃。
綜上,皮蛋在形成過程中,蛋清蛋白的5種主要蛋白在堿性環境下逐漸降解。內部蛋黃蛋白降解度較低,外部蛋黃發生較大程度的降解并伴隨高分子量蛋白的形成。
鴨蛋中的蛋白質在堿溶液下會降解成肽和氨基酸[33]。皮蛋組成的最重要參數之一是游離氨基酸,其能顯著影響皮蛋的營養價值。此外,它還可以與還原糖發生美拉德反應產生一系列揮發產物,從而影響食品的整體風味[34]。由表1可知,腌制前后的皮蛋清中都含有游離的Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp和Val。腌制后的蛋清中游離氨基酸含量均高于新鮮禽蛋的,說明堿處理可以將蛋白質降解為游離氨基酸[27]。
游離氨基酸是腌制蛋黃的重要風味成分,也是揮發性化合物的主要組成部分,蛋黃中共檢測到15種游離氨基酸,除Asp外,其他游離氨基酸和氨基酸總量在腌制后均逐漸下降。Asp含量顯著增加,可能是堿誘導的蛋白質分解引起的[35]。Gao等[35]檢測了皮蛋黃中可溶性肽的變化,從總游離氨基酸和肽含量變化來看,總游離氨基酸含量降低,可溶性肽含量增加,表明在整個腌制過程中蛋黃蛋白質分解成很多微小肽。此外,在整個腌制過程中產生的游離氨基酸中也發生了脫氨、脫羧和美拉德反應,造成游離氨基酸含量逐漸降低。
綜上,腌制過程中,由于強堿導致皮蛋清蛋白降解產生游離氨基酸,皮蛋清中游離氨基酸含量顯著增加;而蛋黃中的蛋白質大多降解為可溶性肽,且部分游離氨基酸發生脫氨、脫羧和美拉德反應,導致游離氨基酸含量顯著降低。
硬度和彈性是反映皮蛋清凝膠的重要因素并常被用于表征其結構特性[36]。如果皮蛋腌制不當,蛋清可能會部分或完全液化,從而影響皮蛋清凝膠的硬度和彈性。Guo等[28]從腌制第7天開始檢測皮蛋清的硬度和彈性(第7天開始形成凝膠),結果如圖6所示。腌制第7天,皮蛋的硬度最弱,之后隨著腌制時間的延長而逐漸增大,且在第42天達到最大值,表明凝膠形成了更穩定的結構。這可能由于隨著堿溶液的滲透,蛋白質發生變性,皮蛋清中的疏水基團的相互作用以及二硫鍵的相互作用逐漸增加,導致皮蛋清凝膠硬度增加。此外,腌制過程中水分含量的降低也會增加蛋白與蛋白之間的相互作用。腌制過程中,皮蛋清凝膠的彈性一直保持在較高水平,而彈性反映的是皮蛋凝膠的內部網絡結構[37]。當蛋白質的變性率高于聚集率時,可形成高彈性的凝膠網絡[38],且堿溶液可以引起蛋白質相互作用,從而增加彈性[39]。這說明從皮蛋清凝膠開始形成時,在堿的作用下,皮蛋清蛋白的變性率大于聚集率,蛋白分子間形成較穩定的分子間作用力。

圖6 腌制過程中皮蛋質地的變化
由于蛋黃蛋白的共價交聯聚集[40],外部蛋黃硬度在腌制7~35 d時逐漸增加[圖6(b)]。腌制35 d后硬度略有下降,可能是堿性條件下,帶負電蛋白質之間的排斥力的作用。由圖6(b)可知,外部蛋黃的彈性在腌制過程中會逐漸增大,然后保持不變。這是由于堿性條件下,蛋黃蛋白進行交聯形成緊密的網絡結構;其次,維持蛋黃凝膠結構的靜電相互作用力和疏水相互作用達到穩定,使彈性在此期間保持穩定。內聚力代表凝膠維持完整網絡結構的能力,內聚力高,表明凝膠網絡結構的強度好。腌制7~21 d,外部蛋黃的內聚力增加,可能是堿性作用下,蛋白分子間作用力增加;腌制28~35 d,內聚力先下降后保持不變[6]。這可能是由于隨著堿的不斷滲透,蛋白質聚集體的結構將被弱化。此外,蛋清凝膠可以“保護”外部蛋黃,在腌制第28天能夠保持蛋黃凝膠的穩定狀態。綜上,腌制過程中,蛋清凝膠的質地和外部蛋黃質地的變化可能與其分子結構和成分有關。
綜上,蛋清凝膠在腌制過程中硬度逐漸增大,且始終保持較高的彈性。外部蛋黃凝膠在腌制過程中,硬度和彈性逐漸增加。外部蛋黃的內聚力雖然在后期略有降低,但整體呈上升趨勢,說明其形成了較穩定的凝膠結構。
礦物質元素會隨著腌漬液滲透到皮蛋內部,研究皮蛋中礦物質元素的變化對研究皮蛋形成機制和安全性具有重要作用。皮蛋腌制過程中蛋殼、蛋清和蛋黃的礦物元素變化如表2。蛋殼由約95%的CaCO3和1.0%的基質蛋白組成[41]。除Ca外,蛋殼中含量最多的是Mg、P和Na, 其中Mg、P和Ca與新型蛋殼相似,但由于腌制混合物中存在鹽和NaOH,因此皮蛋中Na是原來的兩倍多。與新鮮蛋殼相比,由于腌漬液和紅茶中含有重金屬元素,一些金屬化合物會與蛋白降解產生的H2S反應生成金屬硫化物沉積在蛋殼的表面,因此皮蛋殼中還含有較高水平的微量元素Al、Cu、Zn、Fe和Mn。而蛋殼中的鋁含量是新鮮蛋的20倍,這可能來自紅茶中含有的礦物質。

表2 腌制前后蛋殼、蛋清和蛋黃中無機元素的變化[41-42]?
新鮮蛋清中的主要礦物元素為S、K、Na、P、Ca和Mg,皮蛋清中的K和Ca濃度與新鮮蛋清的相似。然而,皮蛋清中的Na、P和Mg分別高出新鮮蛋清的4,10,1.3倍。蛋黃中磷脂的降解與遷移會引起皮蛋清中P的增加[41];腌漬液中含有的Na會引起蛋清中Na的增加;蛋黃和蛋殼中的Mg遷移會引起蛋清Mg的增加[1]。新鮮蛋黃中礦物元素的比例約為1%[41],主要礦物元素為P,其中61%存在于磷脂中。除P外,新鮮蛋黃中還含有Ca、Na、K、S、Mg和Mn等其他礦物質,還包括微量的其他礦物元素。腌制后,蛋黃內的Na、Al、Cu、Fe、K和Mn元素也會增加。由于蛋黃磷脂降解產生的Mg和P擴散到蛋清中,導致皮蛋黃中的Mg和P減少。蛋黃中大部分無機元素的含量高于蛋清,因此皮蛋黃可作為礦物質補充劑。腌漬液中Cu、Fe和Zn等金屬元素會擴散到皮蛋的可食部分,但只有單獨使用Cu的腌漬液(含0.4%硫酸銅)得到的皮蛋中的Cu含量接近每天83%的建議攝入量(表3)。Tan等[43]使用0.2%硫酸銅腌漬液得到的皮蛋中,每個皮蛋含銅為207 μg,遠小于銅的每日攝入量。

表3 食用皮蛋的蛋黃和蛋白時銅、鐵和鋅的攝入量比較?
凝膠化是變性蛋白質分子形成連續網絡的過程,當蛋白質經歷物理或化學變化時就會發生凝膠化。有研究[26]表明,一些動物蛋白,如β-乳球蛋白、卵清蛋白、乳清蛋白和牛血清白蛋白可以通過非共價鍵和聚集的作用形成凝膠結構。通過非共價鍵相互作用,蛋白質可以自組裝形成聚集體或超分子結構。熱誘導的蛋白質凝膠在低離子強度條件下,或遠高于或遠低于蛋白質的等電點水平下可以形成具有較好線性纖維狀的網絡結構,而在高離子強度下或在接近等電點下則可聚集形成粗糙的顆粒狀的網狀結構[26]。由于皮蛋是由強堿腌制而成,蛋清處于較高的pH,因此凝膠網絡具有較好的線性纖維網絡結構。Totosaus等[44]表明如果蛋白質或多肽鏈的聚集速率小于蛋白質的變性速率,傾向于形成規則和半透明的凝膠結構。如圖7(a)所示,隨著腌制的進行,皮蛋清凝膠的網絡結構變得更加規整和致密,且會隨含水量的變化而變化。
由圖7(b)和圖7(c)可知,內蛋黃和外蛋黃由很多圓形小球組成。腌制0~14 d,內部蛋黃的微觀結構與新鮮鴨蛋黃的相似,高度致密且均勻。隨著堿處理時間的增加,內蛋黃蛋白會形成聚集體,這些均勻的聚集體聚集并相互黏附,可能是由于堿誘導脂蛋白釋放或暴露脂質。由于內蛋黃的pH處于等電點附近[6],所以形成的微觀結構是球形顆粒鏈的網絡結構[25]。與新鮮鴨蛋黃相比,外蛋黃具有不規則的三維網絡結構,且隨著腌制時間的增加逐漸變得粗糙、致密。腌制過程中,強堿導致外蛋黃蛋白質展開或降解,隨后逐漸交聯形成凝膠網絡,導致其具有致密的網絡結構。與內部蛋黃相比,外部蛋黃凝膠表面具有空隙,致密性和表面粗糙度更高,使得外部蛋黃具有較高的硬度和彈性。
綜上,隨著腌制時間的增加,皮蛋清凝膠網絡呈現出較好的纖維網絡結構。內蛋黃和外蛋黃的微觀結構具有顯著差異,是因為外蛋黃的堿性作用比內蛋黃的強。隨著腌制時間的增加,外部蛋黃逐漸形成較厚的凝膠網絡結構,而內蛋黃在腌制初期與新鮮蛋黃相似,隨腌制時間的延長形成具有球形顆粒鏈的網絡結構。
皮蛋是中國特有的傳統食品,在保持皮蛋原有特殊風味的基礎上,追求更高的安全性、更短的腌制時間和更強的功能活性,對于皮蛋產業的發展至關重要,未來皮蛋的發展方向有:① 通過添加天然活性物質提高皮蛋的功能活性。② 通過在腌漬液中添加促進凝膠形成和色澤形成的物質,在保持皮蛋原有風味條件下生產無重金屬皮蛋。③ 聯合使用多種新興加工工藝以縮短皮蛋的加工周期。