混菌固態發酵米糠產谷維素的工藝及抗氧化活性評估

夏欣欣林 海楊谷良彭 霞賀辛樂

(1. 國家黑茶產品質量檢驗檢測中心〔湖南〕,湖南 益陽 413000;2. 益陽市產商品質量監督檢驗研究院,湖南 益陽 413000;3. 中南林業科技大學食品科學與工程學院,湖南 長沙 410004;4. 湖南省農產品加工研究所,湖南 長沙 410125)

米糠作為稻谷加工中的副產物,在中國年產量高達1 000萬t。米糠營養豐富,是稻谷產業中的重要組成部分[1]。谷維素又叫米糠素,是一種阿魏酸酯混合物,在非皂化性米糠油中,谷維素的含量為0.9%～2.9%[2]。谷維素作為米糠中最重要的抗氧化活性物質之一,有著優越的熱加工穩定性[3]。研究表明,谷維素具有多種生理功能,如降低血脂[4]、減少肝臟脂質水平[5]、抗氧化[6]、調節胃腸道功能[7]等。

目前制備米糠谷維素的方法有弱酸取代法、多溶劑浸提法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法[8]等。其中,弱酸取代法具有操作簡單、成本低、產品質量好的優點,但是甲醇損耗大,得率低[9];多溶劑浸提法制備的谷維素得率和純度較高,但是工藝復雜,成本較高[10];超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法具有提取效率高,純度高的優點,但是存在操作復雜、設備成本高、能耗高等不足[11-12]。微生物可利用環境中的碳水化合物等產生纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等多種酶系,通過催化特定化學鍵的斷裂,從而將活性成分從植物基質中釋放出來[13]。微生物發酵能促進米糠中氨基酸[14]、活性多肽[15]24-25、γ-氨基丁酸[16]、可溶性膳食纖維[17]等功能成分的滲出,改善米糠功能活性和品質。已有研究[18]56-57[19]21-25表明,枯草芽孢桿菌、紫紅曲霉通過發酵米糠、苦蕎碎米富集谷維素含量為1.59～4.51 mg/g,用時48～216 h。糙米經釀酒酵母發酵后,其谷維素含量明顯高于未發酵糙米[20]。說明微生物處理是富集米糠谷維素的一種現實可行的方法,但是現有技術制備提取米糠谷維素得率偏低,用時偏長。

固態發酵因成本低、操作簡單、反應條件溫和、適合規?；a而受到青睞。研究擬先篩選適宜米糠固態發酵的菌株,再對其固態發酵工藝進行優化,對發酵提取物的抗氧化活性進行評價,并通過掃描電鏡(SEM)分析混菌固態發酵對米糠結構的影響,旨在為米糠谷維素的高效、綠色富集工藝及產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮米糠:2022年8月購于湖南益陽;

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum):湖南省微生物研究院;

黑曲霉(Aspergillusniger)、平菇曲霉(Aspergillushiratsukae)、冠突散囊菌(Eurotiumcristatum):中南林業科技大學食品科學與工程學院保藏;

谷維素標準品:純度為99.5%,日本TCI公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS):上海麥克林生化科技有限公司;

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、MRS培養基、LB培養基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YEPD)培養基:廣東環凱微生物有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

精密恒溫培養箱:BPH-9162型,上海一恒科學儀器有限公司;

超凈化工作臺:SW-CJ-1F型,蘇州安泰空氣技術有限公司;

液相色譜儀:LC-20AB,日本島津公司;

立式壓力蒸汽滅菌鍋:LDZX-50KBS型,上海申安醫療器械廠;

旋轉蒸發儀:YRE-2000B型,鞏義市予華儀器有限責任公司;

超聲波清洗器:DS-2510DTH型,上海奧析科學儀器有限公司;

臺式低速離心機:CFG-4.5D型,濟南中天生物科技有限公司;

掃描電子顯微鏡:Hitachi Regulus8100型,日立科學儀器(北京)有限公司;

濺射鍍膜儀:Quorum SC7620型,英國Quorum公司。

1.2 方法

1.2.1 固態發酵米糠

(1) 菌液制備:取保存的6株菌種各一環接種到相應的試管斜面培養基中,其中植物乳桿菌(MRS培養基)和枯草芽孢桿菌(LB培養基)于37 ℃培養24 h,釀酒酵母(YEPD培養基)于30 ℃培養24 h,黑曲霉、平菇曲霉和冠突散囊菌(PDA培養基)于30 ℃培養96 h,待各菌種長滿斜面后,適量無菌水洗滌,用接種環輕輕將菌種刮下,收集菌懸液。其中,釀酒酵母、黑曲霉、平菇曲霉和冠突散囊菌用血球計數板計數,植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌用平板計算法計數,調整各菌懸液含菌數為1.0×107CFU/mL。

(2) 發酵基質制備:將新鮮米糠過20目篩,稱取適量新鮮米糠于發酵袋中,加入一定比例的水,充分潤濕均勻,套好封口,121 ℃下滅菌30 min,冷卻,備用。

(3) 固態發酵:將準備好的菌懸液分別接入發酵袋中,充分混勻,放入適宜溫度的培養箱中,每隔24 h翻料和補水(3 mL)一次,發酵結束,放入60 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒重,備用。

1.2.2 菌種篩選 設定裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發酵溫度37 ℃,固定其他條件,分別考察植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌發酵時間(0,12,24,36,48,72 h)對米糠谷維素含量的影響;設定裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發酵溫度30 ℃,固定其他條件,考察釀酒酵母發酵時間(0,12,24,36,48,72 h)對米糠谷維素含量的影響;設定裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發酵溫度30 ℃,固定其他條件,考察黑曲霉、平菇曲霉和冠突散囊菌發酵時間(0,1,3,5,7,9 d)對米糠谷維素含量的影響。

1.2.3 發酵條件單因素試驗 設定釀酒酵母與枯草芽孢桿菌菌液體積比1∶1,發酵裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發酵時間24 h,發酵溫度37 ℃,固定其他條件,分別考察發酵時間(12,24,36,48,72 h)、發酵溫度(28,30,33,37,40 ℃)、接種量(3%,6%,9%,12%,15%)、含水量(35%,40%,45%,50%,55%)對米糠谷維素含量的影響。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上,采用Box-Behnken設計響應面試驗。

1.2.5 固態發酵提取物制備 準確稱取發酵米糠1 g,加入5 mL的甲醇,采用超聲波進行提取,15 min/次,提取結束,5 000 r/min離心10 min,收集上清液,重復提取3次,減壓濃縮,定容至25 mL后待測。

1.2.6 溶劑浸提法樣品制備 在Kumar等[12]方法的基礎上進行微小調整,準確稱取干燥至恒重的米糠1 g,加入5 mL的甲醇,于38 ℃水浴鍋中浸提60 min,5 000 r/min離心10 min,收集上清液,重復提取3次,減壓濃縮,定容后待測。

1.2.7 未發酵樣品制備 準確稱取干燥至恒重的米糠1 g,加入5 mL的甲醇,后續提取方法參照1.2.5。

1.2.8 HPLC檢測 根據Zhang等[20]的方法修改如下:色譜柱為InertSustain C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為乙酸—乙腈—甲醇(V乙酸∶V乙腈∶V甲醇=3∶44∶53),流速1.0 min/mL,波長326 nm,分析時間50 min。

通過表1可以得出模型階數越高,殘差越小,相應的AIC準則越小,但階數越高計算越繁瑣,綜合考慮該文取AR(2)模型作為陀螺隨機誤差模型。具體模型如下:

1.2.9 抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力:參照韋濤等[21]的方法。

(2) ABTS自由基清除能力:參照伍蓉等[22]的方法。

1.2.10 掃描電鏡(SEM)分析 米糠經不同方法處理后烘干,取微量樣品粘到導電膠上,使用濺射鍍膜儀噴金,噴金為10 mA,在加速電壓為3 000 V下使用掃描電子顯微鏡拍攝樣品形貌,放大2 000倍進行觀察。

1.2.11 數據處理方法 通過Design-Expert 11、SPSS軟件、Excel軟件和GraphPad Prism 8.0.1進行試驗設計、數據分析及繪圖,各試驗均重復3次,結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種對米糠中谷維素含量的影響

如圖1所示,隨著發酵時間的延長,米糠中谷維素含量整體呈先升后降的趨勢。其中,釀酒酵母和植物乳桿菌在發酵48 h時谷維素含量達到最大值;枯草芽孢桿菌在發酵24 h時谷維素含量達到最大值;黑曲霉在發酵3 d時谷維素含量達到最大值;平菇曲霉和冠突散囊菌在發酵7 d時谷維素含量達到最大值。在3種霉菌中,黑曲霉活性相對較強、繁殖較快,但研究發現黑曲霉在一定條件下可代謝產生阿魏酸酯酶,谷維素在此酶作用下會發生降解[23]。冠突散囊菌能促進茶葉、豆類、谷物中多酚、總黃酮及多糖含量的增加[24]。但是冠突散囊菌和平菇曲霉發酵米糠制備谷維素的研究鮮有報道,試驗過程中發現,冠突散囊菌和平菇曲霉具有促進米糠中谷維素釋放的作用,但對谷維素的富集用時相對偏長。以上結果可以看出,不同菌種處理對谷維素的含量存在一定的差異,同一菌種不同發酵時間對谷維素含量的影響差異顯著,可能與其生長速度、所產酶系等因素有關。綜合考慮谷維素富集效果和發酵時間,選取釀酒酵母和枯草芽孢桿菌進行后續試驗。枯草腸桿菌與產朊假絲酵母混合發酵豆粕(菌液體積比1∶1)時,糖化酶、β-淀粉酶、蛋白酶活力最高值明顯高于單一菌種[25]。因此,選取釀酒酵母(1.0×107CFU/mL)菌液和枯草芽孢桿菌(1.0×107CFU/mL)菌液體積比為1∶1,接種量6%,含水量50%,發酵時間24 h,發酵溫度33 ℃,谷維素含量為(6.786±0.160) mg/g,高于單一菌種發酵制備的谷維素含量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 發酵條件對米糠中谷維素含量影響的單因素試驗

由圖2可知,隨著發酵時間、發酵溫度、接種量和含水量的增加,米糠中谷維素含量均呈先升高后下降的趨勢。這是因為釀酒酵母和枯草芽孢桿菌達到對數生長期需要一定的時間,當其充分生長繁殖時才能利用發酵基質分泌大量的代謝物,如纖維素酶等,從而作用于植物細胞壁,促進活性物質的釋放[20,26]。當發酵時間過長時,發酵體系營養物質消耗,其他有害物質過度積累,細胞可能出現缺氧現象,致使谷維素氧化或降解[27]。發酵溫度直接影響微生物的生長速度,溫度過低或過高都不利于菌種的繁殖和代謝。釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的接種量越多,分泌的纖維素酶、果膠酶等越多,發酵效率越高,但是發酵基質是固定的,當接種量過多時,每個細胞所獲得的營養物質會減少,細胞生長受到抑制,同時供氧不足也會導致好氧菌產酶下降?；炀虘B發酵時,發酵基質中的含水量直接影響發酵效率,含水量偏低不能滿足釀酒酵母和枯草芽孢桿菌自身代謝所需,含水量偏高時,發酵體系中通氣性較差,枯草芽孢桿菌作為好氧菌生長受到抑制[18]8。因此,選取發酵時間36 h,發酵溫度33 ℃,接種量9%,含水量40%進行后續試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應面試驗

2.3.1 試驗設計 基于單因素試驗結果,選擇發酵時間、發酵溫度和接種量進行三因素三水平響應面優化,各因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 試驗設計因素與水平表

表2 響應面試驗設計及結果

2.3.2 響應面模型建立與方差分析 通過Design-Expert 11對響應面試驗結果進行分析,得到谷維素含量與各因素的二次多項式方程:

Y=7.77+0.21A+0.30B+0.15C-0.02AB+0.10AC+0.03BC-0.21A2-1.07B2-0.36C2。

(1)

由表3可知,模型P=0.000 2<0.01,極顯著;失擬項P=0.398 3>0.05,不顯著,表明該回歸方程擬合較好。模型中A、B、B2、C2的P值均小于0.01,對谷維素含量的影響極顯著;C和A2的P值均小于0.05,對谷維素含量的影響顯著。各因素對谷維素含量的影響從大到小依次為發酵溫度>發酵時間>接種量。

表3 響應面二次模型方差分析結果?

由圖3可知,發酵溫度和發酵時間、發酵溫度和接種量、發酵時間和接種量均相互影響但交互作用不顯著。

圖3 各因素交互作用對米糠中谷維素含量的影響

2.3.3 實驗驗證 根據響應面分析得到最優發酵工藝:發酵時間43.8 h、發酵溫度33.9 ℃、接種量9.7%,此條件下谷維素含量預測值為7.866 mg/g。為了方便操作,將最優發酵工藝調整為發酵時間44 h,發酵溫度34 ℃,接種量10%,含水量40%,在此條件下制備的發酵米糠中谷維素含量為(7.816±0.038) mg/g,與預測值接近,說明模型擬合較好,工藝可行。

苗圃[18]56-57采用枯草芽孢桿菌固態發酵米糠120 h,經發酵條件優化后,谷維素含量由未發酵的2.76 mg/g提高到4.51 mg/g。采用紫紅曲霉固態發酵苦蕎碎米9 d,測得谷維素含量最高為1.59 mg/g[19]24。馮海燕[28]利用枯草芽孢桿菌XZI125改善米糠營養價值,通過固態發酵72 h,測得其谷維素含量分別為4.48 mg/g,而原米糠中谷維素僅為2.38 mg/g。而采用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發酵,谷維素含量由未發酵米糠4.152 mg/g增加到7.816 mg/g,增加了1.9倍,且用時更短。

2.4 固態發酵對抗氧化活性的影響

2.4.1 DPPH自由基清除能力 為了評估混菌固態發酵法對抗氧化活性的影響,考察了溶劑浸提法、未發酵法和混菌固態發酵法對DPPH自由基清除能力的影響。從圖4可以看出,在米糠提取物質量濃度為0.015 6～1.000 0 mg/mL時,隨著提取物濃度的升高,提取物對DPPH自由基清除率逐漸上升,后趨于平緩。其中,混菌固態發酵樣品制備的提取物清除DPPH自由基活性顯著強于溶劑浸提法和未發酵樣品制備的提取物,其IC50值分別為(0.220±0.007),(0.389±0.013),(0.308±0.058) mg/mL。這可能與混菌固態發酵法制備的提取物中抗氧化活性成分尤其是谷維素含量更高緊密相關。郭利娜[15]53-66采用枯草芽孢桿菌發酵小米糠,經體內外抗氧化試驗證明,發酵小米糠對DPPH自由基清除率顯著高于谷胱甘肽,小鼠經發酵小米糠處理后,體內丙二醛含量明顯下降,超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活力顯著提高。Le等[29]研究發現,米糠經各乳酸菌發酵后,其發酵物(質量濃度為2 mg/mL)最高可清除88.64%的DPPH自由基,是未發酵米糠的1.2倍。說明混菌固態發酵法對促進抗氧化活性成分釋放,增強抗氧化活性效果顯著。

圖4 混菌固態發酵對DPPH自由基清除率的影響

2.4.2 ABTS自由基清除能力 從圖5可以看出,在米糠提取物質量濃度為0.015 6～1.000 0 mg/mL時,隨著提取物濃度的升高,ABTS自由基清除率逐漸增強。其中,混菌固態發酵樣品制備的提取物清除ABTS自由基活性要顯著高于溶劑浸提法和未發酵樣品制備的提取物,其IC50值分別為(0.409±0.014),(0.842±0.022),(0.678±0.032) mg/mL。發酵米糠提取物質量濃度為0.500 0 mg/mL時,混菌固態發酵法、溶劑浸提法和未發酵樣品制備的提取物對ABTS自由基清除率分別為57.50%,27.83%,41.13%。將紅曲菌和枯草芽孢桿菌對燕麥進行連續發酵,發酵后的樣品清除ABTS自由基活性也顯著高于未發酵樣品[30]。該試驗結果與DPPH自由基清除結果趨勢一致,進一步說明與溶劑浸提法和未發酵米糠相比,混菌固態發酵米糠抗氧化活性更強。

2.5 掃描電鏡分析

為了從宏觀上觀察混菌固態發酵法對米糠的影響,研究采用掃描電鏡分析對米糠形態進行觀察。從圖6可以看出,新鮮米糠組織結構致密,表面上附著一層泛有光澤的油脂。溶劑浸提后,米糠組織表面的油脂大大減少,但組織結構基本保持完整。未發酵米糠因超聲波處理后,米糠組織表面的油脂大大減少,且組織結構出現了一定程度的破碎。而固態發酵米糠組織表面油脂幾乎消失,且在超聲波處理下組織結構出現嚴重的破碎,有利于米糠中活性成分的釋放。

圖6 不同處理方式下米糠的掃描電鏡圖

3 結論

枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有富集谷維素的能力,這與纖維素酶、果膠酶等的活性相關。因此,篩選高水平表達纖維素酶、果膠酶的菌株,是高產米糠谷維素的有效途徑。試驗表明,釀酒酵母與枯草芽孢桿菌固態發酵富集米糠谷維素的最優工藝為發酵時間44 h,發酵溫度34 ℃,接種量10%,含水量40%,此條件下谷維素含量為(7.816±0.038) mg/g,是未發酵米糠中谷維素含量的1.9倍。但是,研究還未闡明不同培養條件下,枯草芽孢桿菌和釀酒酵母中該酶的活性差異,在后續研究中,將聚焦這方面的研究。