電針百會、神庭對脂多糖誘導的抑郁樣小鼠行為及海馬NOD樣受體蛋白3炎癥小體的影響※

楊柳笛 李紅蕾

(1.西安外事學院醫學院,陜西 西安 710077;2.西安外事學院精準抗衰健康產品研發與轉化陜西省高校工程研究中心,陜西 西安 710077)

抑郁癥是一種以情緒障礙為特征的常見病,具有高死亡率、高發病率的特點,以絕望、快感缺乏和反復出現自殺念頭為特征,影響到全世界約3.22億人,是造成全球疾病負擔的重要因素[1]。越來越多的證據表明,神經炎癥與抑郁癥的病因學有關[2],研究發現重度抑郁癥患者的血液和腦脊液中白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的水平顯著升高[3-4],炎癥的增加會導致異常的神經元變化并誘發抑郁樣行為[5]。

NOD樣受體蛋白3(NLRP3)是先天性免疫系統的重要組成部分,NLRP3炎癥小體的活化觸發半胱天冬酶-1(Caspase-1)的激活,Caspase-1介導促炎細胞因子IL-1β、IL-18的產生[6],增加GSDMD的切割啟動一種快速的細胞死亡焦亡,進而引起機體的焦亡和炎癥反應。研究發現NLRP3炎癥小體的異常激活與抑郁癥的發生發展有關[7]。臨床證據表明,重度抑郁癥患者的外周血單個核細胞或血清樣本中,炎癥小體成分(NLRP3和Caspase-1)和炎癥小體產物(IL-1β)的水平顯著增加,并且血清中IL-1β、IL-18水平與Beck抑郁量表(BDI)評分呈正相關[8]。此外,在慢性應激性抑郁小鼠模型中,海馬NLRP3蛋白水平顯著升高,給予Caspase-1的選擇性抑制劑VX-765可顯著改善抑郁樣行為[9]。因此,NLRP3炎癥小體被認為是治療抑郁癥的潛在新靶點。

針灸是中國傳統醫學的一部分,作為一種替代非藥物輔助治療抑郁癥方法,療效確切。諸多研究表明電針能夠顯著降低抑郁大鼠血清以及海馬炎性細胞因子的水平[10-11],并顯著改善動物抑郁樣行為。雖然一些研究討論了針灸抗抑郁作用的潛在機制,但其作用機制仍未完全了解。因此本研究采用腹腔注射脂多糖(LPS)建立急性抑郁小鼠模型,觀察電針對LPS誘導抑郁樣小鼠行為學及NLRP3炎癥小體的影響,探討電針抗抑郁作用是否與抑制炎癥反應有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡C57BL/6雄性小鼠32只,體質量20～25 g,由中國人民解放軍空軍軍醫大學實驗動物中心提供,許可證號SCXK(陜)2019-001。小鼠統一飼養于室溫22～24 ℃,濕度50%～60%,12 h/12 h的光暗周期的標準實驗室的條件下。在實驗前,動物適應實驗室的條件至少1周,實驗期間保證動物自由的進水、進食。

1.1.2 試劑及藥品 NLRP3一抗(英國Abcam公司,貨號:ab214185);Caspase-1一抗(美國Santa Cruz公司,貨號:SC-541);IL-1β一抗(Cell Signaling Technology公司,貨號:#12426);β-actin 一抗(Abcam公司,貨號:ab6276);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:P0013B);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(Loading Buffer)(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:P0015L);SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:AR0138);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:PC0020);蛋白酶抑制劑(Cocktail)(Cell Signaling Technology公司,貨號:5871S);苯甲基磺酰氟(PMSF)(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:ST506);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京索萊寶科技有限公司,貨號:HY-108331);蛋白預染分子量marker(賽默飛世爾科技公司,貨號:26616);增強型化學發光檢測試劑盒(上海雅酶生物醫藥科技有限公司,貨號:SQ101);脂多糖(LPS)(北京索萊寶科科技有限公司,貨號:L8880);氟西汀(禮來蘇州制藥有限公司,貨號:4501A)。

1.1.3 儀器 EPS300電泳儀、Tanon4200發光成像系統(上海Tanon公司);Bio-Rad 680酶標儀(美國Bio-Rad公司);Centrifuge5415R高速低溫離心機(德國Eppendorf公司);大鼠敞箱實驗分析系統(上海吉量公司);強迫游泳實驗分析系統(江蘇賽昂斯生物科技有限公司);恒溫搖床(上海宇騰科技有限公司);華佗牌SDZ-V電針儀、華佗牌一次性針灸針(蘇州醫療用品有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模 動物適應性喂養1周后,將C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、電針組與氟西汀組,每組8只。除對照組外,模型組、電針組和氟西汀組小鼠腹腔注射LPS 1 mg/kg,每日1次,連續注射5天,給藥容積10 mL/kg,建立急性抑郁模型[12],對照組小鼠注射等容積0.9%氯化鈉注射液,每日1次,連續5天。然后對各組小鼠進行行為學測試,檢驗模型是否建立成功,曠場實驗觀察到小鼠中央區域停留時間顯著減少,不動時間顯著增加視為建模成功。

1.2.2 干預方法 電針組小鼠在每日LPS注射1 h后接受電針治療,參照《動物針灸穴位圖譜》選取“百會”(位于頂骨正中)和“神庭”(位于前正中線上,在額頂骨縫交界線前方處)。選用0.25 mm×13 mm一次性使用無菌針灸針進行針刺,百會穴向后斜刺2 mm,神庭穴向上斜刺2 mm,連接電針儀,電針參數:1 mA,2 Hz,疏密波,刺激時間20 min,每日1次,連續5天。氟西汀組按照20 mg/kg給予氟西汀,將藥物溶于0.9%氯化鈉注射液中配制,灌胃容積10 mL/kg,每日1次,連續5天。對照組、模型組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃,每日1次,連續5天。

1.3 觀察指標及方法 評估動物抑郁的行為學測試將在第5天干預結束1 h后開始,按照曠場實驗在前,強迫游泳實驗在后的順序進行。

1.3.1 曠場實驗 曠場實驗在由聚丙烯制成的不透明敞箱(80 cm × 80 cm × 60 cm)中進行,敞箱的底部被均勻分成25個方塊,測試時提前將小鼠放在行為室適應30 min,確保環境安靜。開始測試后,將小鼠放置在箱底的中央,進行15 min自由探索活動,并且通過敞箱上方的立體攝像裝置來跟蹤和記錄每只小鼠的運動總路程以及在中央區域的活動時間。每只小鼠測試后及時除去小鼠的排泄物,然后用75%乙醇徹底清洗該裝置,排除氣味對測試結果的影響。

1.3.2 強迫游泳實驗 用于評估動物絕望行為,是使用最廣泛的抗抑郁作用測試之一。實驗時小鼠被單獨放置在一個透明容器(高25 cm,直徑10 cm)中,在溫度為23～25 ℃,水深11 cm的透明容器中強迫持續游泳6 min,在小鼠適應2 min后,開始記錄接下來4 min內的不動時間占比(以小鼠停止游泳,保持不動,只做必要的動作以保持頭部露出水面為準)[13]。

1.3.3 NLRP3炎癥小體信號通路相關蛋白的表達 采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測。行為學測試結束后,將小鼠以2%戊巴比妥鈉麻醉,然后脫頸處死,立即放置冰上快速分離海馬左側和右側,分別放入做好標記的1.5 mL離心管中,將海馬組織稱質量,用Cocktail和10 mM PMSF的RIPA組織裂解液裂解,在冰上超聲粉碎勻漿組織后,在低溫高速離心機12 000轉/min,4 ℃離心20 min收取裂解液上清,采用BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度,加入loading buffer混勻后,放入沸水中煮10 min,樣品制備完畢放入-80 ℃保存。分別配置9%和12%分離膠和3%濃縮膠,每孔上樣50 μg,先用80 V恒壓電泳,待嗅酚藍進入分離膠后,電壓改為100 V,恒壓120 min,完成電泳后,以100 V恒壓轉移100 min,將蛋白轉移至PVDF膜上。按照蛋白預染marker裁剪條帶,將條帶放入5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h,按照比例配制一抗:β-actin(1∶10000)、NLRP3、CASP-1(1∶1000),IL-1β(1∶2000),4 ℃孵育過夜。次日,PBST漂洗(10 min×3)。配制二抗,室溫孵育1 h,PBST漂洗(10 min×3),配置發光液,均勻涂抹條帶,使用Tanon4200發光成像系統進行曝光并拍照,采用Image J軟件定量分析條帶的蛋白表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠曠場實驗結果比較 各組小鼠的總運動總路程比較差異無統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組小鼠中央區域停留時間明顯縮短(P<0.05);與模型組比較,電針組、氟西汀組小鼠中央區域停留時間均明顯延長(P<0.05);與電針組比較,氟西汀組小鼠中央區域停留時間延長(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠曠場實驗結果比較

2.2 各組小鼠強迫游泳實驗結果比較 與對照組比較,模型組小鼠不動時間明顯延長(P<0.05);與模型組比較,電針組、氟西汀組小鼠不動時間均縮短(P<0.05);與電針組比較,氟西汀組小鼠不動時間縮短(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠強迫游泳實驗結果比較

2.3 各組小鼠海馬NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達比較 與對照組比較,模型組海馬NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達均升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、氟西汀組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達均降低(P<0.05)。電針組與氟西汀組組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組小鼠海馬NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達

表3 各組小鼠海馬NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達結果

3 討論

抑郁癥是一種常見的精神疾病,據世界衛生組織統計,預計到2030年抑郁癥占全球疾病負擔的近4.3%[14],隨著抑郁癥的發病率不斷上升,預防和治療抑郁癥成為人們關注的焦點。傳統的抗抑郁藥物通常需要連續用藥數周或數月才能達到顯著的治療效果,因此,尋找快速有效的抗抑郁治療方法迫在眉睫。針灸作為一種補充替代醫學的重要治療方式,已被證實可改善抑郁癥患者的抑郁癥狀,發揮抗抑郁的作用。在一項8周的臨床對照試驗中,與選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)治療相比,針灸治療顯著改善患者焦慮和抑郁情緒[15]。此外,針灸對抑郁行為改善的有效性也得到了動物研究的支持[11,16-18]。中醫學認為,腦為元神之府,督脈入絡腦,百會為督脈要穴,可通督導氣,調神解郁,而督脈神庭穴可鎮靜安神,清散頭風,兩穴合用被廣泛用于抑郁癥的治療。因此本研究選取電針百會、神庭,觀察對LPS誘導抑郁小鼠的抗抑郁作用,探討電針在抑郁治療中的潛在作用。

海馬體是抑郁癥研究中最常被研究的大腦區域。從結構的角度來看,海馬體是邊緣系統的一部分,并與情感相關的大腦區域(如前額葉皮質和杏仁核)建立神經纖維連接。此外,海馬體含有高水平的糖皮質激素受體和谷氨酸,調節下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA),使其更容易受到壓力和抑郁。應激對海馬的突觸可塑性有著深刻的影響,在動物模型中,抑郁可以下調海馬長時程增強(LTP)所需的突觸蛋白和生長因子,而電針可逆轉長時程抑制(LTD)增強引起海馬CA1突觸的損傷[19],緩解抑郁樣行為。因此,本研究選擇海馬部位進行研究。

LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分,大量研究表明,LPS可誘導促炎細胞因子產生、膠質細胞激活以及活性氧(ROS)生成相關的中樞炎性反應,并可引起時間依賴的行為改變,在LPS刺激2 h后,促炎細胞因子的釋放達到峰值,24 h之后則可誘導抑郁樣行為[20-21]。抑郁樣行為的特征是在實驗動物體內LPS誘導全身感染后出現的絕望、快感缺失以及放棄求生本能等表現。因此LPS被廣泛應用于炎癥相關急性抑郁的研究。為了進一步研究電針的抗炎和抗抑郁作用機制,本實驗采用腹腔注射LPS誘導小鼠急性抑郁模型。

神經炎癥是抑郁癥發病的關鍵機制[22],臨床研究發現抑郁癥患者血液中的促炎細胞因子IL-1β、IL-18水平顯著升高[23],抗抑郁藥物治療顯著減輕抑郁癥狀,同時降低血清中IL-1β水平。抗抑郁藥和抗炎治療對感染疾病伴抑郁樣癥狀的治療效果進一步支持了神經炎癥與抑郁之間的因果關系[24]。有研究假設炎癥小體是應激引起的神經炎癥反應的關鍵中介,重度抑郁癥患者血細胞中NLRP3和Caspase-1基因表達增加,血清中IL-1β和IL-18水平增加,三環抗抑郁藥阿米替林治療能夠降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的水平,減輕抑郁癥狀[8]。本研究針對NLRP3信號轉導通路方面提出電針抗抑郁機制研究假設,驗證電針是否能通過調節NLRP3信號通路的蛋白表達發揮抗抑郁作用。

本研究采用曠場實驗和強迫游泳實驗評估電針是否能改善LPS誘導的急性抑郁樣行為。結果顯示,模型組小鼠中央區域停留時間明顯縮短(P<0.05),不動時間明顯延長(P<0.05),說明LPS誘導的神經炎癥可導致動物呈現抑郁樣狀態,提示模型建立成功。此外本研究選擇氟西汀作為陽性對照藥,結果表明,氟西汀能改善LPS誘導的小鼠抑郁樣行為,進一步證明該模型建立成功;數據顯示,與模型組比較,電針治療可明顯延長小鼠中央停留時間(P<0.05),縮短不動時間(P<0.05),表明電針能顯著改善LPS誘導的小鼠急性抑郁樣行為。

Western Blot測量小鼠海馬NLRP3信號通路相關蛋白的表達水平。結果顯示,模型組海馬NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達在LPS刺激下顯著增加,表明LPS可刺激NLRP3的活化,誘導神經炎癥。在經過電針治療后,NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著減少(P<0.05)。提示電針可能通過抑制海馬NLRP3炎癥小體的活性,減少炎癥因子的表達,對LPS誘導急性抑郁模型有顯著的抗炎效果,從而發揮抗抑郁作用。

綜上所述,電針百會、神庭穴可顯著改善LPS誘導小鼠的急性抑郁樣行為,作用機制可能與抑制海馬NLRP3信號通路的活化有關,提示電針是一種有效輔助治療抑郁癥的方法。由于在本研究中未使用NLRP3抑制劑進行驗證,存在研究的局限性,因此電針在分子水平上的作用機制還需要進一步的研究來完全理解其作用。但目前的研究結果為電針在急性全身炎癥抑郁模型中的抗炎作用機制提供了新的思路,為電針在臨床治療抑郁癥中的廣泛應用提供了依據。