應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)篩查LEOPARD綜合征患者致病基因一例

魯巧云 姜北雪 王 充 陽 芳

1湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院,襄陽市中心醫(yī)院皮膚科, 湖北襄陽,441021;2深圳市人民醫(yī)院(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院)皮膚科,廣東深圳,518020;3國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心建設(shè)單位,廣東深圳,518020

LEOPARD綜合征(LEOPARD syndrome,LS)是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病,屬于神經(jīng)-心-面-皮膚綜合征(neuro-cardio-facio-cutaneous syndromes, NCFCs)家族,該家族包括神經(jīng)纖維瘤病-1(NF1)、Noonan綜合征(NS)、Costello綜合征(CS)、心-面-皮膚綜合征、毛發(fā)生長初期毛發(fā)松散的Noonan樣綜合征和Legius綜合癥。這些疾病由編碼RAS-MAPK 細(xì)胞通路的蛋白質(zhì)的基因突變引起。不同綜合征的臨床異質(zhì)性和表型具有重疊性。LS表現(xiàn)出多發(fā)性黑子和先天性異常癥狀如眼距過寬、生殖器畸形、發(fā)育遲緩、耳聾等特征［1］。LS最常由蛋白酪氨酸磷酸酶非受體11型(PTPN11)基因突變導(dǎo)致［2］,我們報(bào)道了1例臨床診斷為LS的男性患者,經(jīng)基因檢測(cè)確定了PTPN11基因12號(hào)外顯子存在c.1415C>T(p.Thr472Met)的雜合突變。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 患者,男,30歲。因全身黑褐色斑疹26年就診。患者26年前開始出現(xiàn)全身黑褐色斑疹,無明顯不適癥狀,曾至外院皮膚科就診,診斷為“泛發(fā)性黑子”,未予治療。12年前曾因“漏斗胸”于我院住院行胸腔鏡Nuss漏斗胸矯正術(shù)治療。患者2021年診斷出甲狀腺癌,腫瘤檢測(cè)出基因BRAF V600E突變。家族中無類似疾病,父母非近親結(jié)婚,母親因肺癌去世。體檢:發(fā)育、聽力正常,心率齊,未聞及明顯病理性雜音,其余系統(tǒng)檢測(cè)無明顯異常。皮膚科情況:面部、軀干及四肢泛發(fā)直徑1～10 mm褐色至黑色斑疹、斑片,軀干、四肢可見數(shù)處大小不等、形狀不規(guī)則褐色斑疹,邊界清楚(圖1)。實(shí)驗(yàn)室檢查示血、尿常規(guī)、生化、出凝血時(shí)間均無異常。

圖1 LEOPARD綜合征患者臨床表現(xiàn):面部,軀干,四肢廣泛分布的泛發(fā)性黑子

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集 經(jīng)知情同意后,用EDTA抗凝管分別采集患者及其父外周血4 mL,-70℃保存。

1.2.2 全外顯子組高通量測(cè)序 簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)流程及方法如下:(1)應(yīng)用試劑盒提取外周血DNA,經(jīng)紫外分光光度儀器進(jìn)行純度及濃度檢測(cè),符合全外顯子組高通量測(cè)序質(zhì)檢要求。(2)將基因組DNA打斷后制備文庫。外顯子捕獲下來,經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢,合格即可進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)行Illumina HiSeq4000 PE150測(cè)序。(3)對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行注釋,注釋數(shù)據(jù)庫主要包括i)人口數(shù)據(jù)庫,如gnomAD (http://gnomad.broadinstitute.org/)、1000基因組計(jì)劃(http://browser.1000genomes.org)、Berrybig data人口數(shù)據(jù)庫、dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)等; ii)預(yù)測(cè)算法方面,如SIFT (http://sift.jcvi.org)、FATHMM (http://fathmm.biocompute.org.uk)、MutationAssesso r(http://mutationassessor.org)、CADD (http://cadd.gs.washington.edu)、SPIDEX(Xiong et al, Science 2015)等; iii)疾病和表型數(shù)據(jù)庫,如OMIM (http://www.omim.org)、ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)、HGMD (http://www.hgmd.org)、HPO (https://hpo.jax.org/app/)等。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)需要測(cè)序的DNA片段合成引物,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法進(jìn)行擴(kuò)增,用ABI3730xl測(cè)序儀(美國Applied Biosystems公司)以Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果采用Snap Gene Viewer軟件與Ensemble網(wǎng)站公布的DNA序列對(duì)比。

2 結(jié)果

全外顯子組高通量測(cè)序結(jié)果顯示:患者的PTPN11基因12號(hào)外顯子第1415位核苷酸發(fā)生c.1415C>T(NM _001330437.2,對(duì)應(yīng)GRCh37參考基因組物理位置:Chr12:112629270),導(dǎo)致第472號(hào)氨基酸由Thr變?yōu)镸et(p.Thr472Met),患者父親無異常(圖2)。該突變位點(diǎn)多次被報(bào)道導(dǎo)致LS,是最常見的突變位點(diǎn),致病性評(píng)級(jí)為“致病性”。

圖2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

LEOPARD綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,Zeisler和Becker在1936年第一次報(bào)道了本病,隨后Gorlin等在1969年根據(jù)其典型臨床表現(xiàn)的首字母縮寫命名,系多發(fā)性黑子(lentigines)、心電圖異常(electrocardiographic conduction defects)、眼距過寬(ocular hypertelorism)、肺動(dòng)脈瓣狹窄(pulmonary valve stenosis)、生殖器畸形(abnormalities of genitalia)、發(fā)育遲緩(retardation of growth)和耳聾(deafness)［1］。作為神經(jīng)-心-面-皮膚綜合征(NCFCs)的一種,這類疾病表現(xiàn)出顯著的遺傳和表型異質(zhì)性:同一基因的突變可能導(dǎo)致不同的綜合征,如PTPN11基因突變可導(dǎo)致Noonan綜合征和LS;另,RAS/MAPK 級(jí)聯(lián)不同水平的不同蛋白的功能障礙可導(dǎo)致類似的臨床表現(xiàn)。LS臨床表現(xiàn)與Noonan綜合征有重疊性,LS又常被稱作Noonan綜合征伴多發(fā)性黑子,臨床表型變異度很大［2］,LS被認(rèn)為是NS的一個(gè)變異型［3］。

LS皮損的典型表現(xiàn)為多發(fā)的扁平黑褐色斑點(diǎn),好發(fā)于面頸部和軀干上部,一般不累及黏膜,皮疹通常在患兒4～5歲時(shí)出現(xiàn),青春期數(shù)量可增加到數(shù)千個(gè)。70%～80%的LS患者皮膚有咖啡斑的表現(xiàn),皮損通常在患兒出生后數(shù)月內(nèi)出現(xiàn),常早于黑子出現(xiàn)［4］。少數(shù)人可出現(xiàn)局部色素減退斑及甲營養(yǎng)不良。其他臨床表現(xiàn)包括顱面畸形(上瞼下垂、外眥低于內(nèi)眥、低位或后旋耳、寬鼻根等),眼部疾病(高度遠(yuǎn)視),心血管系統(tǒng)疾病(肥厚性心肌病、肺動(dòng)脈狹窄、二尖瓣關(guān)閉不全等),骨骼疾病(漏斗胸、雞胸、肘骨外翻、脊椎畸形等)及血液系統(tǒng)疾病(血小板減少癥、白血病)等。目前LS的診斷標(biāo)準(zhǔn),患者有多個(gè)雀斑樣痣加上2個(gè)其他主要特征,即可診斷為LS［4,5］。本例患者有全身多發(fā)黑子及咖啡斑、漏斗胸及眼距增寬的臨床特征,臨床表現(xiàn)符合LS的診斷,分子診斷證實(shí)了該患者的診斷。

PTPN11、RAF1和BRAF是已知與 LS 相關(guān)的基因。85%的LS患者與PTPN11基因突變相關(guān),其他致病基因有RAF1、BRAF和MAP2K1［2］,PTPN11基因通過編碼蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)來調(diào)節(jié)RAS信號(hào)通路,SHP-2是各種生長因子、細(xì)胞因子、激素和整合素的細(xì)胞質(zhì)傳感器,從而最終產(chǎn)生LS的各種臨床表型。在一項(xiàng)對(duì)9例LS和2例伴有咖啡斑和PTPN11基因突變的NS患者的研究中,發(fā)現(xiàn)11例患者中有10例檢測(cè)出PTPN11基因7號(hào)或12號(hào)外顯子發(fā)生錯(cuò)義突變,這兩種突變影響了PTPN11基因磷酸酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域。有研究者提出LS和NS是等位基因疾病,獨(dú)特的分子和致病機(jī)制導(dǎo)致了NS的亞型LS具有特有的皮膚表現(xiàn)［6］。PTPN11基因突變會(huì)導(dǎo)致RAS/MAPK傳導(dǎo)通路發(fā)生改變,該信號(hào)傳導(dǎo)通路在各種癌癥的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用,還會(huì)增加白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及黑素細(xì)胞瘤等惡性腫瘤疾病的風(fēng)險(xiǎn)［7］。本例患者合并甲狀腺癌,腫瘤檢測(cè)出BRAF基因V600E突變,考慮PTPN11種系突變合并BRAF體系突變。BRAF基因廣泛表達(dá),編碼屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 RAF/mil 家族的蛋白(BRAF 蛋白),該蛋白在GTP結(jié)合的RAS結(jié)合后被激活并磷酸化,并激活絲裂原激活的蛋白激酶激酶MEK1和MEK2。因此,該蛋白在調(diào)節(jié)MAP激酶/ERK信號(hào)通路中發(fā)揮作用,從而影響細(xì)胞分裂、分化和分泌。BRAF體細(xì)胞突變與多種癌癥相關(guān),包括非霍奇金淋巴瘤、結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌和肺腺癌。

目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致LS的PTPN11基因的致病突變位點(diǎn)超過20個(gè),包括Tyr279Cys/Ser、Ala461Thr/Ser、Gly464Ala、Thr468Met/Pro、Arg498Leu/Trp、Gln506Pro及Gln510Glu/Pro［8-10］。85%的LS為7、12和13號(hào)外顯子發(fā)生突變,其中7號(hào)外顯子p.Tyr279Cys和12號(hào)外顯子p.Thr468Met錯(cuò)義突變的比例占65%。本例患者PTPN11基因12號(hào)外顯子c.1415C>T(p.Thr472Met)雜合錯(cuò)義突變,該位點(diǎn)和c.1403C>T(p.Thr468Met) 文獻(xiàn)實(shí)際為同一位點(diǎn),即SNP數(shù)據(jù)庫中的rs121918457,已被報(bào)道導(dǎo)致LS。PTPN11基因突變位點(diǎn)的不同導(dǎo)致具有不同臨床表型的等位基因疾病,這些突變會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)［11］。LS中矮小、耳聾和肥厚性心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)與p.Tyr279Cys突變有關(guān),雖然HCM不在LEOPARD縮寫中,但它是LS最常出現(xiàn)的一種心臟疾病,p.Tyr279Cys突變導(dǎo)致SHP-2失去催化活性,還可以使PI3K/AKT/mTOR通路過度激活,此通路過度激活與LS相關(guān)的HCM發(fā)病密切相關(guān),p.Tyr279Cys對(duì)Ras/MAPK(激活或抑制)的影響仍存在爭(zhēng)議［2,12］。Thr468Met突變?cè)贚S預(yù)后中似乎是一種保護(hù)因素,而非Thr468Met突變與猝死、短陣室速、室上速 、梗阻性心肌病等心血管不良事件相關(guān),有致死風(fēng)險(xiǎn)患者皆為非Thr468Met突變患者［13］。本例患者目前無心臟及腫瘤相關(guān)疾病表現(xiàn),但需要對(duì)患者進(jìn)行長期隨訪,定期篩查腫瘤疾病及心臟評(píng)估。

皮膚多發(fā)性黑子影響患者的美觀,是大多數(shù)LS患者主要關(guān)注的問題,如果皮損長時(shí)間受到創(chuàng)傷或外界刺激,可考慮手術(shù)、冷凍或激光去除,Kontoes等［14］報(bào)道了強(qiáng)脈沖光成功治療LS的案例,Nuha Alfurayh通過翠綠石激光治療且獲得了滿意的療效［2］,可嘗試使用該方法治療。