補陽還五湯浸膏制備過程中指紋圖譜變化及美拉德反應研究*

趙佳柱，祝雨辰，鄧俊林，賀福元,3，楊巖濤,3

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中醫藥超分子機理與數理特征化實驗室，湖南 長沙 410208）

中藥作為一種多組分體系，中藥指紋圖譜可檢測其復方及其制劑加工過程中多組分整體量變規律。同時高效液相色譜（HPLC）、高效毛細管電泳（HPCE）、氣相色譜（GC）、高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）、GC-MS、紅外光譜（IR）[1-5]等技術能建立二維、三維圖譜，標示其化學特征。總量統計矩法系運用總量零階矩（AUCT）、總量一階矩（MCRTT）、總量二階矩（VCRTT）等參數來描述一張完整的指紋圖譜[6]，并在指紋圖譜總量統計矩分析法的基礎上，通過兩指紋圖譜正態曲線下重疊面積之和，運用正態分布曲線的計算原理，計算補陽還五湯浸膏制備過程，分析不同樣品指紋圖譜間的相似度[7]，從而考察其成分在此過程中的變化情況。

美拉德反應是一種非酶促反應，是羰基化合物（還原糖及脂質等）和氨基化合物（氨基酸及蛋白質）間的反應，廣泛應用于食品加工過程中[8-10]。同時這些化學成分在中藥中廣泛存在，中藥材在煎煮過程中會發生美拉德反應。加熱可使原來的化學成分結構改變而得到新物質，或將某些結合在植物體內的成分解析出來，重新組裝形成大分子或直接以小分子形式存在于藥液中。物理相互作用和化學反應的共同作用使微粒之間的結合方式更為多樣，結構更為復雜。美拉德反應產物的還原性能是其多種基本生理特性之一。因此本研究嘗試以樣品液還原性能作為考察指標，以驗證中藥浸膏制備過程中存在美拉德反應。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 高效液相色譜儀，配備Breeze色譜工作站、Waters 2487雙波長檢測器（美國Waters公司）；SP-756型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；TP-1200C型電子天平（湘儀天平儀器設備有限公司）；苦杏仁苷（批號：110820-200403，純度≥98%）、芍藥苷（批號：110736-200629，純度≥98%）、川芎嗪（批號：110817-200305，純度≥98%）、阿魏酸（批號：0773-9910，純度≥98%），均購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

補陽還五湯，處方組成：黃芪60 g，當歸9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，紅花9 g，地龍9 g。以上中藥材均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，經劉塔斯教授鑒定分別為：豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.Var. mongho-kicus（Bge.）Hsiao]干燥根；傘形科植物當歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根；傘形科植物川芎[Iigusticum chuanxiong Hort.]的干燥根；菊科植物紅花[Carthamus tinctorius L.]的干燥花；毛莨科植物芍藥[Paeonia lactlora Pall.]的干燥根莖；薔薇科植物桃[Prunus persica（L.）Batsch]的干燥成熟種子；環節動物門鉅蚓科動物參環毛蚓[Pheretima aspergillum（E. perrier）]的干燥主體。

1.2 樣品溶液的制備

1.2.1 待測樣品溶液的制備 按處方比例稱取藥材，加8倍量蒸餾水，回流提取2次，每次1 h，合并濾液，濃縮，待濃縮至800 mL，精密移取藥液1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，制得1號樣品溶液；繼續濃縮至400 mL，精密移取藥液1 mL，稀釋1倍，過0.45 μm微孔濾膜，制得2號樣品溶液；繼續濃縮至200 mL，精密移取藥液250 μL，加蒸餾水定容至1 mL后，過0.45 μm微孔濾膜，制得3號樣品溶液；繼續濃縮至100 mL，精密移取藥液125 μL，加蒸餾水定容至1 mL后，過0.45 μm微孔濾膜，制得4號樣品溶液；繼續濃縮至40 mL，精密移取藥液50 μL，加蒸餾水定容至1 mL后，過0.45 μm微孔濾膜，制得5號樣品溶液；繼續濃縮后置于真空干燥箱中制得干浸膏，取適量浸膏加水制備成與前5號樣品等處方濃度的藥液，過0.45 μm微孔濾膜，制成6號樣品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取苦杏仁苷、川芎嗪、阿魏酸對照品19.810 0、10.970 0、13.410 0 mg，用甲醇定容至10 mL；精密稱取芍藥苷對照品7.332 0 mg，定容至1 mL。分別精密吸取上述各對照品溶液500 μL，混合，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，制成每1 mL含苦杏仁苷0.495 2 mg、芍藥苷1.833 0 mg、川芎嗪0.274 2 mg、阿魏酸0.335 2 mg的混合對照品溶液。

1.3 色譜條件 色譜柱：MLtimate-XB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）∶水（B，含1%乙酸）；梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，0%A；10～25 min，0%A～7%A；25～35 min，7%A～12.5%A；35～45 min，12.5A%～18%A；45～55 min，18%A～25%A；55～65 min，25%A～30%A；65～70 min，30%A～32.5%A；70～71 min，32.5%A～37%A；71～80 min，37%A～40%A；80～100 min，40%A～80%A；100 ～115 min，80%A～100%A；115 ～120 min，100%A～0%A；流速：1 mL/min；波長：264 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

1.4 樣品溶液還原能力（Fe3+→Fe2+）測定[11]1～6號樣品稀釋40倍后，取1mL置于5mL離心管中，加入1mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH值6.6）和1 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，置50 ℃水浴中20 min，取出，再加入1 mL質量分數為10%的三氯乙酸溶液，混勻，迅速冷卻。取1 mL混合溶液置于5 mL離心管，加入1 mL超純水和0.2 mL質量分數為0.1%的三氯化鐵溶液，迅速混勻，測定溶液在700 nm的吸光度值（A）。平行測定3次。

2 方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜測定方法學考察

2.1.1 指紋圖譜積分條件的確定 精密吸取10 μL空白樣品，進樣測得圖1中S7，以儀器最小的積分門檻值進行積分得空白甲醇指紋圖譜參數，再考慮進行梯度洗脫時，流動相的比例改變，甲醇雜質產生的穩定空白對照峰后，提高最小峰面積再次進行積分，結合總量統計矩加合原理[12-13]，以信噪比3∶1確定該指紋圖譜的積分閾值：半峰寬為35s，響應率為67mAu/s，面積總量為6000 μAu·s，峰高為280 μAu。

圖1 混合對照品、甲醇空白、補陽還五湯樣品溶液指紋圖譜

2.1.2 線性關系考察 依次精密吸取混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用甲醇稀釋并定容至1 mL，按“1.3”項下色譜條件進樣10 μL。以對照品質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得到各對照品的回歸方程。結果顯示各對照品在所取濃度范圍內線性關系良好。對照品溶液的標準曲線、線性范圍、最低檢測限見表1。

表1 對照品溶液標準曲線、線性范圍、最低檢測限表

2.1.3 精密度試驗 取供試品液，按“1.3”項下色譜條件連續進樣6次，每次10 μL，根據其指紋圖譜計算其總量統計矩各參數，可得指紋圖譜的總量零階矩、一階矩、二階矩的RSD分別為2.60%、3.20%和3.70%，均小于5%。

2.1.4 穩定性試驗 取同一份供試品，放置0、2、6、12、24 h后按“1.3”項下色譜條件分別進樣10 μL，得其總量零階矩的RSD為0.57%，總量一階矩的RSD為0.82%，總量二階矩的RSD為3.10%。

2.1.5 重復性試驗 取同一供試品溶液，連續進樣5次，每次10 μL，可得其總量零階矩的RSD為3.50%，總量一階矩的RSD為4.20%，總量二階矩的RSD為1.60%。

2.2 樣品的測定 取按“1.2”項下方法制備的1～6號樣品溶液，按“1.3”項下色譜條件，各進樣10 μL，得指紋圖譜S1、S2、S3、S4、S5、S6，空白甲醇樣品指紋圖譜S7，混合對照品溶液指紋圖譜S8。（見圖1）

2.3 指紋圖譜總量統計矩參數及相似度計算 按“2.1.1”項下方法對指紋圖譜積分，依法計算各指紋圖譜的總量統計矩參數。（見表2）

表2 補陽還五湯樣品液指紋圖譜總量統計矩參數

依據計算所得各指紋圖譜總量統計矩參數，按總量統計矩相似度法計算各指紋圖譜間相似度。結果見表3。

表3 各樣品液指紋圖譜相似度

2.4 樣品溶液還原能力（Fe3+→Fe2+） 以700 nm波長下樣品溶液的吸光度值來表征產物的還原能力，1～6號樣品溶液還原能力測定結果見圖2。

圖2 各樣品溶液還原能力

3 討論

中藥復方成分眾多，并且在煎煮、濃縮、干燥等一系列制備加工過程中存在各類化學反應發生的可能[14]，如柴胡-白芍藥對在煎煮后出現了16種新成分[15]。濃縮和干燥過程中長時間高溫條件下成分也會發生較大的變化。這都會影響中藥復方藥效物質基礎，也是造成中藥復方物質基礎難以闡明的原因之一。因此，在尊重原方的基礎上，將中藥復方開發成制劑，以提高中藥復方臨床順應性，則有必要對中藥復方制劑制備過程中相關化學反應的發生進行研究。美拉德反應已被證實存在于中藥復方制備過程中。美拉德反應產物還原性的變化可證實美拉德反應的發生[16]。前期研究[17-19]表明，水是美拉德反應的重要溶劑。若含水量低于3%，反應則會受到抑制；當含水量為0%時，反應幾乎不能進行；若含水量較高，則會明顯稀釋反應劑的濃度，也會降低反應速率；含水量為10%～15%，有利于化學成分分子擴散，推動反應進行。而作為中藥普通煎煮提取溶劑的水，在浸膏制備的過程中，其含量是在不斷發生變化的。隨著濃縮過程的進行，水分含量不斷降低。當水分降低到合適范圍時，湯劑中的氨基化合物與羰基化合物之間將會發生美拉德反應[20]。

因此，本研究以補陽還五湯浸膏制備過程中指紋圖譜的變化情況為例，嘗試探討此過程中美拉德反應的發生。在補陽還五湯浸膏的制備過程中，1～6號樣品溶液間指紋圖譜零階矩的RSD為8.02%，一階矩的RSD為16.12%，二階矩的RSD為21.34%，說明指紋圖譜的總量統計矩參數隨浸膏制備過程的進行產生了顯著性變化。在濃縮過程中，各成分之間可能因為“吸附”“沉淀”等過程而改變其溶出率；也可能在高溫狀態下，物質之間發生絡合、水解等反應，而引起中藥化學成分及功效等多方面的變化，進一步導致各樣品溶液指紋圖譜信息發生了顯著變化。

相似度計算結果顯示，在補陽還五湯浸膏的制備過程中，1～6號樣品溶液間的指紋圖譜相似度也發生了明顯的變化，基本呈現逐漸減小的趨勢，說明在浸膏制備過程中，隨著濃縮過程的進行，樣品中成分的類別、相對濃度等均發生了一定的變化。尤其是濃縮到一定程度后，相似度降低到了0.85以下，說明相似度的降低與水分的減少有著極大的關聯。補陽還五湯復方藥材中的氨基和羰基的化合物可作為美拉德反應物，如君藥黃芪中有11種含有氨基的化合物、54種含有羰基的化合物；臣藥當歸中有9種含有氨基的化合物、63種含有羰基的化合物。且制備過程營造了較高的水分含量及較高的溫度等美拉德反應發生的良好條件[21]。因此補陽還五湯制備過程中會發生復雜的美拉德反應，從而造成中藥浸膏復方化學成分發生變化，導致指紋圖譜相似度降低。

在補陽還五湯浸膏的制備過程中，1～6號各樣品溶液的還原性能呈現逐漸增大的趨勢，說明隨著濃縮程度的增加，浸膏水分含量不斷減少的同時，樣品的還原性能在不斷增大，而美拉德反應產物的還原性能有可能是造成樣品溶液還原能力不斷增強的原因之一。還原性作為美拉德反應產物的一種基本特性，其還原性增加又從另一個角度證明了在中藥復方浸膏的制備過程中美拉德反應的發生和美拉德產物的不斷增多。這表明補陽還五湯浸膏在制備過程中具有較好的研究開發價值。

由于美拉德反應，食品會產生特殊的香味與顏色，故其在食品工藝上有著非常重要的價值[22]。這些變化在中藥制劑加工過程中也十分常見，且某些變化已經被證實屬于美拉德反應[23-25]。伴隨美拉德反應的發生，中藥復方產生的美拉德反應產物，將會改善中藥的口感，改變中藥復方的組成和活性成分。已有研究[26]證明美拉德反應產物具有多種多樣的生物活性。其存在也將對中藥復方的色澤與氣味、藥效及毒性產生影響，進而影響中藥復方劑量。就制劑過程來說，選擇不同劑型，則需要不同的制備加工條件。美拉德反應的類別和程度也將有所區別，也將直接影響復方制劑的臨床使用。因此，闡明中藥復方制劑加工過程中美拉德反應的機理及其產物種類將為中藥復方的物質基礎、配伍、劑型及加工工藝帶來重大的影響。