Box-Behnken響應面法優化連翹揮發油的膠體磨包合工藝*

張娜娜，孫 艷，莊華青，王竣楠，郇旭升，張 麗，莊建林，關永霞

（1.魯南制藥集團股份有限公司中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006）

連翹為木犀科植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahls]的干燥果實[1-2]，主要分布于我國山西、陜西、河南、湖北、山東等地。其素有“瘡家圣藥”之稱，有清熱解毒、疏肝行氣等功效[3-5]。現代藥理學研究表明，連翹具有抗菌、抗病毒、抗氧化及抗衰老等多種作用[6-8]。連翹中含有揮發油類、苯乙醇苷類、木脂素類、有機酸類和萜類等化合物。2020年版《中華人民共和國藥典》一部[1]規定連翹的含量測定成分為揮發油、連翹苷和連翹酯苷A，因此這3種成分對于連翹發揮藥理作用具有至關重要的意義。連翹揮發油含有烯類、烷類、醇類、醛類、酯類等化合物，具有廣譜的抑菌、抗氧化、解熱抗炎等藥理活性，是連翹發揮藥理作用的主要物質基礎之一[9-11]。

桑菊感冒片是由桑葉、菊花、連翹等8味中藥組成的中藥復方制劑，具有疏散風熱、宣肺止咳的功效，常用于治療風熱感冒。桑菊感冒片的原生產工藝中會將提取的連翹揮發油直接噴灑在物料上，然而揮發油的穩定性較差，易揮發；且成品制劑具有刺激性氣味，導致患者口服依從性差；并且片劑制備過程中，易造成物料流動性差，很難壓片。因此，根據生產過程中出現的問題，本研究用β-環糊精包合來提高連翹揮發油的穩定性，并改善制劑口感等[12-13]。目前揮發油包合方法有飽和水溶液法、超聲法、膠體磨研磨法等。本研究通過包合方法的對比實驗篩選出膠體磨研磨法包合連翹揮發油，此法具有包合效率高、操作簡單、適合大生產的優勢[14-15]。本研究以連翹揮發油包合率、包合物得率及綜合評分為指標，采用Box-Behnken響應面法[16-22]，優選了連翹揮發油膠體磨研磨法包合的最佳工藝參數，為含連翹揮發油制劑的工藝改進提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 Ml6002T型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；XL-250型兩級膠體磨（溫州制藥機械設備廠）；GZX-9140MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；ALPHA型紅外掃描儀（布魯克公司）。

1.2 試藥與試劑 連翹藥材（批號：20220829）購于哈爾濱福順堂藥材有限公司，由魯南制藥集團股份有限公司中藥制藥共性技術國家重點實驗室范建偉高級工程師鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》規定；β-環糊精（β-CD）（批號：20190201）購于孟川市華興生物化工有限公司；蒸餾水、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 連翹揮發油的提取 稱取連翹藥材28.0 kg，投入芳香油提取罐中，加入6倍量水，采用水蒸氣蒸餾法提取連翹揮發油，開啟加熱，待提取罐內沸騰后，調節蒸汽閥，提取3 h，至揮發油的油量不再增加，停止加熱，讀取揮發油量（323 mL），開啟揮發油收集器活塞，收集揮發油。于揮發油中加入等體積的無水乙醇制成揮發油乙醇溶液（揮發油與無水乙醇體積比為1∶1），放入冷庫保存，備用。

2.2 空白回收率的測定 參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部項下揮發油含量測定法（通則2204）甲法，精密吸取“2.1”項下揮發油乙醇溶液4 mL，共3份，分別置于圓底燒瓶中，加水600 mL，沸石數粒，保持沸騰5 h，待揮發油測定器中油量不再增加時，停止加熱，讀取揮發油量，計算得到平均空白回收率為91.32%。

2.3 評價指標 精密稱取揮發油包合物（總質量的1/5），分別置于圓底燒瓶中，加水600 mL，沸石數粒，保持沸騰5 h，待揮發油測定器中油量不再增加時，停止加熱，讀取揮發油量，分別計算包合率和包合物得率。以β-CD揮發油包合率和包合物得率的綜合得分Y作為評價指標。根據實際生產經驗，賦予包合率權重為80%，包合物得率權重為20%。包合率（%）=包合物中揮發油的含量/（揮發油加入量×空白回收率）×100%；包合物得率（%）=包合物量/（β-CD加入量＋揮發油加入量）×100%；Y（綜合得分）=（包合率/包合率max×80%+包合物得率/包合物得率max×20%）×100。

2.4 包合方法比較

2.4.1 飽和水溶液法 稱取β-CD 90 g，加入純化水1 440 mL，水浴加熱，攪拌，升溫至50 ℃，待β-CD完全溶解后，溫度降至40 ℃，用分液漏斗緩慢滴加揮發油乙醇溶液20 mL，不斷攪拌（200 r/min），滴加完畢，恒溫包合2 h，入庫冷藏（0～8 ℃）過夜，減壓抽濾，抽濾結束后，取上層揮發油包合物，用95%乙醇沖洗吸附的揮發油，40 ℃烘干，得干包合物。

2.4.2 超聲法 稱取β-CD 90 g，加入純化水1 440 mL，超聲，水浴加熱，攪拌，升溫至50 ℃，待β-CD完全溶解后，溫度降至40 ℃，用分液漏斗緩慢滴加揮發油乙醇溶液20 mL，不斷超聲攪拌，滴加完畢，恒溫包合2 h，入庫冷藏（0～8 ℃）過夜，減壓抽濾，抽濾結束后，取上層揮發油包合物，用95%乙醇沖洗吸附的揮發油，40 ℃烘干，得干包合物。

2.4.3 膠體磨研磨法 稱取β-CD 90 g，加入純化水360 mL，玻璃棒攪勻，置膠體磨中研磨，設置轉速為2 880 r/min，乳化細度為20 μm，用分液漏斗緩慢滴加揮發油乙醇溶液20 mL，滴加完畢，研磨包合20 min，入庫冷藏（0～8 ℃）過夜，減壓抽濾，抽濾結束后，取上層揮發油包合物，用95%乙醇沖洗吸附的揮發油，40 ℃烘干，得干包合物。

由表1可知，膠體磨研磨法的包合率、包合物得率、綜合評分（Y）均高于飽和水溶液法和超聲法。

表1 包合方法的比較

2.5 連翹揮發油研磨法包合單因素考察

2.5.1 連翹揮發油與β-CD的投料比對包合工藝的影響 按“2.4.3”項下方法，固定β-CD與水的投料比為1∶5，研磨時間為20 min，考察連翹揮發油與β-CD的投料比對包合工藝的影響。選擇連翹揮發油與β-CD的投料比為1∶6、1∶9、1∶12、1∶15。按“2.3”項下方法進行揮發油包合率與包合物收率的測定，并計算綜合得分（Y）。由表2可知，連翹揮發油與β-CD的投料比超過1∶12時Y基本不變，故后續Box-Behnken響應面優化中選擇連翹揮發油與β-CD的投料比為1∶6、1∶9、1∶12。

表2 連翹揮發油與β-CD 的投料比對包合工藝的影響

2.5.2 β-CD與水的投料比對包合工藝的影響 按“2.4.3”項下方法，固定連翹揮發油與β-CD的投料比為1∶9，研磨時間為20 min，考察β-CD與水的投料比對包合工藝的影響。選擇β-CD與水的投料比為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9。按“2.3”項下方法進行揮發油包合率與包合物收率的測定，并計算綜合得分（Y）。由表3可知，β-CD與水的投料比超過1∶7時Y基本不變，故后續Box-Behnken響應面優化中選擇β-CD與水的投料比為1∶3、1∶5、1∶7。

表3 β-CD 與水的配比對包合工藝的影響

2.5.3 研磨時間對包合工藝的影響 按“2.4.3”項下方法，固定連翹揮發油與β-CD的投料比為1∶9，β-CD與水的投料比為1∶5，考察研磨時間對包合工藝的影響。選擇研磨時間為10、20、30、40 min。按“2.3”項下方法進行揮發油包合率與包合物收率的測定，并計算綜合得分（Y）。由表4可知，研磨時間30～40 min包合效果相差不大，因此后續Box-Behnken響應面優化中選擇研磨時間為10、20、30 min。

表4 研磨時間對包合工藝的影響

2.6 Box-Behnken響應面法優化連翹揮發油研磨法包合工藝 根據上述連翹揮發油研磨法包合單因素考察試驗結果，選取用揮發油與β-CD的投料比（A）、β-CD與水的投料比（B）和研磨時間3個因素，用Box-Behnken響應面法進行因素水平設計與試驗，試驗因素水平見表5，試驗設計及結果見表6～7。

表5 連翹揮發油包合工藝試驗因素水平

表6 連翹揮發油包合工藝Box-Behnken響應面試驗設計及結果

表7 連翹揮發油包合工藝響應面二次回歸方程方差分析結果

采用Design-expert8.0.6軟件對試驗結果進行分析，得到回歸方程：Y=95.48+5.68A+3.65B+2.34C+0.069AB-2.66AC-2.17BC-5.76A2-0.27B2-3.73C2，r=0.975 7；建立的回歸整體模型P＜0.01。失擬項P=0.146 1＞0.01，模型成立。其中A、B、C、A2、C25個因素差異極顯著（P＜0.01），AC、BC差異顯著（P＜0.05），各因素對揮發油包合工藝綜合得分（Y）的影響大小順序為A＞B＞C。3個因素對Y的交互影響見圖1～3，由圖可知，響應曲面表現均較為平滑。連翹揮發油包合工藝綜合得分（Y）隨揮發油與β-CD的投料比、β-CD與水的投料比和研磨時間的增加呈現出先升高再緩慢降低的趨勢，在一定的范圍達到最大值。

圖1 因素A 和B 對連翹揮發油包合工藝的影響

圖2 因素A 和C 對連翹揮發油包合工藝的影響

圖3 因素B 和C 對連翹揮發油包合工藝的影響

2.7 連翹揮發油包合工藝驗證 根據模型分析結果可以確定連翹揮發油包合最佳工藝：揮發油與β-CD的投料比為1∶10.59，β-CD與水的投料比為1∶6.84，研磨時間為18.7 min。結合生產實際及節能減排的原則，確定最佳提取工藝：揮發油與β-CD的投料比為1∶10，β-CD與水的投料比為1∶6，研磨時間為20min。根據此工藝重復3次試驗，包合率平均值為89.52%，包合物得率平均值為93.98%，綜合得分（Y）為90.41，RSD為1.21%，說明此工藝穩定可靠。

2.8 連翹揮發油包合物的鑒定

2.8.1 薄層色譜（TCL）鑒別 量取連翹揮發油1 mL，加無水乙醇20 mL，混勻得樣品1；量取包合物中回收的揮發油1 mL，加無水乙醇稀釋至20 mL，混勻得樣品2；稱取連翹揮發油β-CD包合物10 g，加入無水乙醇20 mL，超聲后過濾，取續濾液，得樣品3；稱取連翹揮發油β-CD包合物10 g，加無水乙醇20 mL，振搖使溶解，濾過，取續濾液，得樣品4；取β-CD 10 g，加無水乙醇20 mL，振搖使溶解，濾過，取續濾液，得樣品5。從左到右依次點于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結果樣品1、2、3在相同位置呈現明亮斑點，說明包合過程未改變連翹揮發油的化學成分，樣品4、5沒有斑點顯示，說明包合物制備完成。（見圖4）

圖4 薄層色譜鑒別圖

2.8.2 紅外光譜法鑒別 將β-CD、連翹揮發油、連翹揮發油β-CD包合物3個樣品分別采用衰減全反射法（ATR）在4 000～400 cm-1范圍內進行IR掃描，測定結果見圖5～7。由圖可知，連翹揮發油在2 921 cm-1和1 642 cm-1有吸收尖峰，而連翹揮發油β-CD包合物在2 920 cm-1僅有較弱吸收，在1 642 cm-1無吸收。這是由于連翹揮發油和β-CD形成相互作用，連翹揮發油β-CD包合物制備完成。

圖5 β-CD 紅外圖譜

圖6 連翹揮發油紅外圖譜

圖7 連翹揮發油β-CD包合物紅外圖譜

3 討論

本研究選擇了飽和水溶液法、超聲法、膠體磨研磨法對連翹揮發油包合效果進行比較，結果顯示膠體磨研磨法較其他兩種包合方法具有包合率高、包合物得率高、操作簡單等優勢，且可以用作大規模工業化生產。本研究由此在單因素試驗基礎上結合Box-Behnken響應面法確定了連翹揮發油膠體磨研磨法包合工藝的最優條件為：揮發油與β-CD的投料比為1∶10，β-CD與水的投料比為1∶6，研磨時間為20 min。驗證試驗結果表明，該包合工藝穩定可行，且通過薄層鑒別和紅外光譜鑒別試驗結果顯示包合物已成功形成。該法可充分掩蓋揮發油的刺激氣味，減少揮發油的揮發，有利于連翹揮發油藥效成分的控制和相關制劑工藝的改進。