蒙醫(yī)針刺療法治療干眼癥模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究*

吳薩日娜，李常勝，吳斯琴畢力格，嘎拉臺(tái)，新吉夫，桂 芝，劉 彬，何宇紅

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

干眼癥是一種常見(jiàn)的眼部疾病，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]，病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多種多樣。病情發(fā)展到一定程度，可明顯降低人的視覺(jué)，影響患者工作和生活[2]。美國(guó)的一項(xiàng)研究表明，全球有10%～15%的成人患有干眼癥，其中日本的發(fā)病率為17.0%，澳大利亞為10.3%。目前我國(guó)還沒(méi)有確切的干眼癥流行病學(xué)資料，根據(jù)我國(guó)的衛(wèi)生狀況和環(huán)境狀況，干眼的患病率要高于美國(guó)[3]。已有研究[4-5]顯示，干眼癥的發(fā)生與患者自身免疫疾病、激素分泌水平降低、細(xì)胞過(guò)度自噬、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)。一項(xiàng)研究[6]表明，過(guò)度的炎癥應(yīng)激反應(yīng)是引起干眼癥的重要原因。

根據(jù)干眼癥的臨床癥狀，蒙醫(yī)將其歸屬于“寒風(fēng)赤眼癥”范疇。蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人體是由三根（赫依、希拉、巴達(dá)干）與七素相互依賴所構(gòu)成的整體，三根失去平衡是一切疾病發(fā)生的根本原因。干眼癥是體內(nèi)因赫依偏勝，并與希拉、巴達(dá)干相博，侵襲肝和白脈系統(tǒng)，引發(fā)肝、眼血行障礙，阻塞白脈之傳導(dǎo)所致。蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為，干眼癥病位在于肝和白脈，肝位于希拉區(qū)，也是赫依的主要竄行之道。因此，本課題選取赫依穴、希拉穴和肝穴，而不是干眼癥發(fā)作密切相關(guān)的眼部穴位。蒙醫(yī)針刺療法具有鎮(zhèn)赫依、調(diào)節(jié)三根、鎮(zhèn)痛、疏通白脈、調(diào)整臟腑功能，可以達(dá)到抗干眼效果。本研究采用蒙醫(yī)針刺療法干預(yù)阿托品誘導(dǎo)的干眼癥模型大鼠，觀察針刺對(duì)角結(jié)膜炎癥因子的干預(yù)作用，闡述“調(diào)節(jié)三根，精充目明”的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量210～230 g，合格證號(hào)：110324210106503772，由蘇州西山生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物進(jìn)駐動(dòng)物房后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間自由食水，溫度（24±2）℃，濕度48%，12 h光照、12 h黑暗。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 1%硫酸鹽阿托品眼用凝膠（批號(hào)210801）、玻璃酸鈉滴眼液（批號(hào)：ID210502）均由沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司生產(chǎn)。Anti-IL-1β antibody（批號(hào)：ab234527）、Anti-IL-6 antibody（批號(hào)：ab281013）、Anti-TNF-α（批號(hào)：2150188）均購(gòu)自Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZB-2301），Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG（thermos fisher 公司，批號(hào)：R37115）。

1.3 模型制作與針刺干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)表法進(jìn)行分組，分為正常組、模型組、玻璃酸鈉滴眼液組、蒙醫(yī)針刺療法組，每組15只，雌雄各半。除正常組外，其他3組以1%硫酸阿托品眼用凝膠滴眼，每日4次（08:00、12:00、16:00、20:00）、每次每眼5 μL，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共4周。滴藥3 d后進(jìn)行淚液分泌量及淚膜破裂時(shí)間（tear break-up time,BUT）檢測(cè)判斷大鼠成模情況，剔除不合格大鼠。成模后，模型組不做處理；玻璃酸鈉滴眼液組給予玻璃酸鈉滴眼，3次/d，共4周；蒙醫(yī)針刺療法組則根據(jù)全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)研究學(xué)術(shù)會(huì)制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜”選取相當(dāng)于人體解剖部位的相應(yīng)穴位，取大鼠赫依穴（第1胸椎下凹正中）、希拉穴（第2胸椎下凹正中）、肝穴（第9胸椎下凹正中）行針刺，1次/d，共4周。

1.4 對(duì)淚液質(zhì)量的影響

1.4.1 淚液分泌量 造模后，使用淚液分泌試紙進(jìn)行淚液分泌量（Schirmer test，SIT）[7]檢測(cè)，判斷是否成模。針刺后第2、4周再次檢測(cè)淚液分泌量，判斷針刺對(duì)大鼠淚液分泌的影響。

1.4.2 淚膜破裂時(shí)間測(cè)定 造模后，采用熒光素染色法觀察大鼠淚膜破裂時(shí)間（BUT）[8]，判斷是否成模。針刺后第2、4周再次檢測(cè)BUT，判斷針刺對(duì)大鼠淚液分泌的影響。

1.5 HE染色法判斷大鼠角膜形態(tài)學(xué)變化 末次針刺2 h后，以過(guò)量麻醉法（過(guò)量水合氯醛）處死。4 min內(nèi)，在手術(shù)顯微鏡下與鞏膜分離，并完整取下大鼠右眼角膜，4%多聚甲醛固定。對(duì)前固定的角膜30%蔗糖脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，以備進(jìn)行HE染色，洗片后滴加蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，最后使用鹽酸酒精分化后封片觀察。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)大鼠角膜組織白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β mRNA、IL-6 mRNA、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a, TNF-α）mRNA表達(dá)水平 采用4組20 mg左右的冰凍角膜。用液氮將試樣粉碎，加入1 mL Trizol，在室溫下放置2 min，將Trizol轉(zhuǎn)到?jīng)]有RNA酶的EP管內(nèi)。添加200 μL的氯仿，大力搖動(dòng)15 s，室溫放置15 min，然后離心（4 ℃，12 000×g，15 min）。離心后，將液體分成三層，取上部無(wú)色液體至新的EP管中。加入等體積的異丙醇，將其上下混合，在室溫下放置5 min，然后離心（4 ℃，12 000×g，10 min）。去上清，沉淀，加入1 mL 75%的酒精，稍搖15 s，然后離心（4 ℃，7 500×g，5 min）。注意清除上清液，將管道中的沉淀置于超凈臺(tái)中，吹氣靜置3～5min。提取上清后，用50 μL的DEPC溶解，用UV測(cè)定，-80 ℃冷藏。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的指示進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-q PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism-6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并且繪制統(tǒng)計(jì)圖表。計(jì)量資料用（）表示，采用One-way ANOVA 及T-test進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺干預(yù)前后各組SIT檢測(cè)結(jié)果 阿托品滴眼3 d后，與正常組比較，模型組、玻璃酸鈉滴眼液組、蒙醫(yī)針刺療法組大鼠淚液試紙長(zhǎng)度明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預(yù)后2周時(shí)，與模型組比較，蒙醫(yī)針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯增長(zhǎng)（P＜0.01）；與蒙醫(yī)針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預(yù)后4周時(shí)，與模型組比較，蒙醫(yī)針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯增長(zhǎng)（P＜0.01）；與蒙醫(yī)針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯縮短（P＜0.01）；與正常組比較，蒙醫(yī)針刺療法組大鼠SIT無(wú)明顯改變（P＞0.05）。蒙醫(yī)針刺療法組4周與蒙醫(yī)針刺療法組2周比較，SIT明顯增長(zhǎng)（P＜0.01）；玻璃酸鈉滴眼液組4周與玻璃酸鈉滴眼液組2周比較，SIT無(wú)明顯改變（P＞0.05）。（見(jiàn)圖1、表2）

圖1 SIT 評(píng)分交互效應(yīng)輪廓圖

表2 干預(yù)前后各組SIT 比較 （，mm）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=431.2，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=129.5，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=61.98，P交互效應(yīng)=0.000。

?

2.2 針刺干預(yù)前后各組BUT檢測(cè)結(jié)果 阿托品滴眼3 d后，與正常組比較，模型組、玻璃酸鈉滴眼液組、蒙醫(yī)針刺療法組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預(yù)后2周時(shí)，與模型組比較，蒙醫(yī)針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯增長(zhǎng)（P＜0.01）；與蒙醫(yī)針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預(yù)后4周時(shí)，與模型組比較，蒙醫(yī)針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯增長(zhǎng)（P＜0.01）；與蒙醫(yī)針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.01）；與正常組比較，蒙醫(yī)針刺療法組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.05）。蒙醫(yī)針刺療法組4周與蒙醫(yī)針刺療法組2周比較，BUT明顯增長(zhǎng)（P＜0.01）；玻璃酸鈉滴眼液組4周與玻璃酸鈉滴眼液組2周比較，BUT無(wú)明顯改變（P＞0.05）。（見(jiàn)表3、圖2）

圖2 BUT 評(píng)分交互效應(yīng)輪廓

表3 干預(yù)前后各組BUT 比較 （，s）

表3 干預(yù)前后各組BUT 比較 （，s）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=280.3，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=61.89，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=23.27，P交互效應(yīng)=0.000。

?

2.3 HE染色法觀察大鼠角膜細(xì)胞形態(tài) 正常組角膜上皮細(xì)胞發(fā)育良好，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠的角膜上皮細(xì)胞增殖，基底層細(xì)胞的排列不整齊，表面有凹凸不平的感覺(jué)，而蒙醫(yī)針刺療法組則表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的增殖和基底層的排列紊亂；但與模型組相比，增殖程度仍存在一定的差別，蒙醫(yī)針刺療法組明顯好于模型組，而玻璃酸鈉滴眼液組則可見(jiàn)上皮細(xì)胞的增殖，胞索間的排列紊亂。（見(jiàn)圖3）

圖3 各組大鼠角膜HE 染色照片 （×40）

2.4 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)水平 針刺干預(yù)后2周，與模型組比較，蒙醫(yī)針刺療法組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與蒙醫(yī)針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。針刺干預(yù)后4周，與模型組比較，蒙醫(yī)針刺療法組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與蒙醫(yī)針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與正常組比較，蒙醫(yī)針刺療法組大鼠IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)無(wú)明顯改變（P＞0.05）。蒙醫(yī)針刺療法組4周與蒙醫(yī)針刺療法組2周比較，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；玻璃酸鈉滴眼液組4周與玻璃酸鈉滴眼液組2周比較，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)無(wú)明顯改變（P＞0.05）。（見(jiàn)表4）

表4 干預(yù)后各組IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNT-α mRNA 比較 （）

表4 干預(yù)后各組IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNT-α mRNA 比較 （）

?

3 討論

干眼癥是一種由各種原因?qū)е碌臏I液質(zhì)或數(shù)量的異常，或者由于動(dòng)態(tài)變化而導(dǎo)致的淚膜穩(wěn)定性降低，同時(shí)還伴有眼部不適，以及/或眼表組織的損傷[9-10]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，約75%的40歲及以上的成人患有干眼癥，其中女性更容易患干眼癥[11-12]。目前，臨床上治療干眼癥一般采用人工淚液，玻璃酸鈉滴眼液作為一種優(yōu)質(zhì)的人工淚液，具有加快角膜細(xì)胞修復(fù)、改善眼角膜保濕能力的作用[13-14]，能有效改善患者癥狀，但患者易出現(xiàn)依賴現(xiàn)象，綜合臨床效果有待提升。

阿托品是一種常見(jiàn)的副交感神經(jīng)受體阻斷劑，可使淚腺乙酰膽堿含量減少，導(dǎo)致淚液分泌明顯下降，繼發(fā)角膜細(xì)胞出現(xiàn)鱗狀上皮細(xì)胞化生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。研究[15]表明，采用阿托品滴眼液局部滴眼3 d能夠誘導(dǎo)出比較穩(wěn)定的干眼癥模型，用藥后1周左右干眼體征最為明顯。與單純的淚腺切除術(shù)比較，阿托品干眼模型具有可逆、合理、簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用阿托品誘導(dǎo)的大鼠模型進(jìn)行淚液分泌和淚膜破裂時(shí)間的測(cè)定，結(jié)果表明阿托品能有效地誘發(fā)干眼癥。應(yīng)用蒙醫(yī)針刺對(duì)阿托品誘發(fā)的干眼癥大鼠進(jìn)行干預(yù)后，角膜細(xì)胞活動(dòng)旺盛，上皮細(xì)胞擴(kuò)張飽滿，BUT明顯降低，淚液分泌增加。研究表明針刺可通過(guò)促進(jìn)角膜代謝及調(diào)節(jié)神經(jīng)反射敏感性以增加淚液分泌，說(shuō)明蒙醫(yī)針刺對(duì)阿托品引起的干眼大鼠具有良好的療效。

由于干眼癥的發(fā)病率逐年升高，并且趨于年輕化，有關(guān)干眼癥的研究成果也頗為豐富。研究表明，干眼癥的發(fā)病機(jī)制包括激素分泌水平降低、維生素缺乏[16]、自身免疫疾病、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)異常、細(xì)胞過(guò)度自噬、細(xì)胞凋亡[17]和炎癥反應(yīng)等，其中炎癥反應(yīng)是主導(dǎo)環(huán)節(jié)和起始因素[18-20]。炎癥反應(yīng)以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，伴有多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與。淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞在體內(nèi)炎癥反應(yīng)高時(shí)，會(huì)分泌大量的細(xì)胞因子IL-2、CRP、TNF-α等，而TNF-α是引起腫瘤細(xì)胞在炎癥過(guò)程中死亡的重要因素[21]。同時(shí)，IL-2和CRP能促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集、活化、炎癥介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致局部的炎癥反應(yīng)。LIN X T等[22]通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行IFN-γ和TNF-α的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一定程度的炎癥反應(yīng)對(duì)免疫功能有影響，說(shuō)明血清相關(guān)因子能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而降低機(jī)體的免疫功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在大鼠模型中，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA均有較高的表達(dá)，說(shuō)明在干眼癥的發(fā)病過(guò)程中，存在與炎癥有關(guān)的基因表達(dá)。經(jīng)過(guò)蒙醫(yī)針刺治療后，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的含量明顯下降，表明蒙醫(yī)針刺療法對(duì)阿托品誘導(dǎo)的干眼大鼠有抑制炎癥發(fā)生的作用。

蒙醫(yī)認(rèn)為眼與全身其他臟器之間的聯(lián)系，要依靠白脈為之連接貫通。眼不斷得到白脈輸送的氣、血的濡養(yǎng)，才能維持正常的功能。針刺調(diào)節(jié)三根，陣痛，疏通白脈，調(diào)整臟腑功能，可以達(dá)到抗干眼效果。綜上，本研究結(jié)果顯示蒙醫(yī)針刺療法的調(diào)節(jié)三根，疏通白脈的作用可通過(guò)調(diào)控炎癥因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。但現(xiàn)階段也存在一定的局限性，蒙醫(yī)針刺療法如何從更深層次的分子機(jī)制調(diào)控干眼癥的發(fā)生還需要進(jìn)一步研究。