預知子提取物對卒中后失眠模型大鼠海馬PI3K/Akt信號通路的影響*

劉景峰，宋偉偉，李寶棟，王雅榮，白德龍，趙學棟，宋 佳，張玉曼，霍 青

（1.河北省滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061000；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011）

卒中是導致人類死亡的3大疾病之一，中國每年約有200萬新發腦卒中患者[1]。卒中后引發的睡眠障礙是該病的常見并發癥，臨床上主要表現有失眠、嗜睡、睡眠呼吸障礙等[2]。研究發現大約有20%～40%的腦卒中患者會并發睡眠障礙；有數據顯示，95%的腦血管病患者存在睡眠障礙[3]。據悉，在卒中后睡眠障礙患者中失眠最為常見。國外報道腦卒中后患者發生失眠的概率為20%～56%，腦卒中急性期甚至高達56.7%～67.7%[4]。盡管在過去幾十年中卒中的治療效果取得了很大進展，但有效的醫療或外科治療仍有待確定。因此，找到一種有效的治療方式，對于疾病的治療具有重要意義。預知子（Foreknowledge）為木通科植物，別名八月札，其果實具有疏肝理氣、散瘀消結等功效[5]。預知子為夜交藤預知子湯方中主藥之一，目前已有研究證實，預知子提取物（FAE）具有抗抑郁功效，可有效治療腦卒中后引發的認知功能障礙，并且與單胺類神經遞質轉運蛋白具有高親和力[6]，提示FAE可能作用于相關神經遞質，從而導致機體神經功能的轉變。PI3K/Akt是控制細胞分裂、自噬、存活和分化等多種細胞過程的重要途徑之一。且參與了缺血性腦卒中的病理過程[7]。有研究發現，PI3K/Akt信號通路的激活與機體炎癥反應存在密切相關性，PI3K/Akt信號通路的激活可引起腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子表達異常，從而引起機體炎癥反應[8]。但是目前關于FAE在卒中后失眠中的具體作用機制還不清楚，因此通過建立卒中后失眠大鼠模型，并采用FAE進行干預，以探討FAE的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，購自重慶陸軍軍醫大學，體質量（200～220）g。動物生產許可證號：SCXK（渝）2019-0009；動物使用許可證號：SYXK（渝）2019-0069；動物合格證：20191254。本實驗動物于SPF級動物房中進行飼養，飼養條件為：20～25 ℃，環境濕度：40%～60%，模擬動物光照環境（晝12 h/夜12 h），各組大鼠飲水飲食自由，本實驗通過河北省滄州中西醫結合醫院倫理委員會審批，符合動物倫理標準。

1.2 藥物與試劑 預知子提取物（南京建成生物工程研究所，純度：99.99%，批號：20168491）；艾司西酞普蘭（大連美侖生物技術有限公司，純度：99.99%，批號：202036491）；TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海優寧維生物有限公司，批號：SA-6548，FS-9848，CS-6845）；RT-qPCR試劑盒（南京建成生物有限公司，批號：961241）；蛋白定量試劑盒（南京建成生物有限公司，批號：323215）；PI3K、Akt、β-actin蛋白抗體（美國，abcam公司，批號：AB-6154，AB-3325，AB-0013）。

1.3 主要儀器 BX53顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；ZS-Morris水迷宮視頻跟蹤系統（北京眾實科技有限公司）；伯樂1681130 imark全自動酶標儀（美國伯樂公司）；伯樂Mini-PRO TEAN電泳儀（美國伯樂公司）；JD-CW96熒光定量PCR儀（山東競道光電科技有限公司）；LAS 4000成像系統（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.4 造模與分組 選取健康SD大鼠60只，適應性喂養7 d后，根據隨機數字表法將大鼠隨機分成假手術組、模型組、陽性對照組（艾司西酞普蘭，10 mg/kg），以及預知子提取物低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組，其中預知子提取物各劑量組藥物均以預知子提取物質量計算，每組10只[9]。大鼠禁食、禁水12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/kg）麻醉，消毒大鼠頸部皮膚，手術刀沿頸部正中線切開皮膚，暴露大鼠頸總動脈，假手術組直接縫合傷口，其余各組夾閉頸總動脈近心端，實現大腦動脈阻塞，造成卒中模型，然后縫合創口，并注射青霉素預防大鼠感染死亡，建模24 h后采用改良神經功能缺損嚴重程度（mNSS）量表對大鼠進行評分，mNSS評分≥2分即表示建模成功[10]。

1.5 實驗給藥 建模成功后，預知子各劑量組和陽性對照組大鼠分別灌胃相應的藥物，模型組和假手術組灌胃相同體積的生理鹽水，持續21 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 Morris水迷宮實驗 實驗前準備一個2 m×2 m的水池，將水池分成4個象限，并放置一個平臺，隨機將本實驗的大鼠放在水池內，記錄每只大鼠游到平臺上的用時，若用時大于60 s，則直接將這只大鼠放置在平臺上10 s。本實驗連續進行5 d，每天進行兩次，取平均值為當日大鼠的逃逸時間。

1.6.2 大鼠腦組織病理結構觀察 實驗末期，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后取大鼠腦組織，將其中一半放入福爾馬林溶液中浸泡48 h，浸泡后制作組織蠟塊并切片，最后應用HE染色法進行染色，顯微鏡下觀察。

1.6.3 大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平檢測 實驗末期，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，采用非抗凝管取大鼠全血3 mL，4 ℃，2 500 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上清液于一支新的離心管中，置于-80 ℃保存，備用。采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，根據ELISA試劑盒說明書，對血清樣本進行處理后，采用全自動酶標儀在450 nm波長處檢測樣本吸光度，并根據標準曲線來計算樣品中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.6.4 總RNA提取及RT-qPCR 根據RNA提取試劑盒提取海馬組織總RNA，然后反轉錄生成cDNA并在-80 ℃冰箱保存備用。配置體系：引物2.25 μL，cDNA3.0 μL，SYBR Green qPCR SuperMix 17.25 μL，去酶水7.5 μL，每個樣品設置6各復孔。PCR條件：94 ℃，12 min；96 ℃，12 s；62 ℃，25 s；72 ℃，40 s；共35個循環。采用2-ΔΔct法進行計算，并分析mRNA表達。引物序列，PI3K：5’-ATGCACCGCGACTGATAGTCGC-3’，5’-TTCGCGTAGTGC TGATGCA-3’；Akt：5’-GCGGCTAGTGCTGATGTGCTGTA-3’，5’-CGTGATGTAGCTATGCTAGG-3’；GAPDH：5’-ATGCGTTT GAGAGCTCAGG-3’，5’-TTCAGCTGCATCGACGAT-3’。計算各組大鼠海馬組織PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達量。

1.6.5 大鼠PI3K、Akt蛋白水平檢測 處死大鼠步驟同上，取一側大鼠海馬組織放入玻璃研磨器中，配置蛋白酶K溶液（1 mL PBS加入100 μL蛋白酶K），加入1 mL蛋白酶K溶液充分研磨，3 000 r/min 4℃條件下離心20min（離心半徑10 cm），上清轉移至1.5mL EP管，采用蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量，并使每管蛋白濃度為3 μg/mL后進行電泳，經SDS-PAGE電泳分離、轉模和封閉后用特異性抗體PI3K、Akt和β-actin（抗體稀釋濃度1∶5000）在4 ℃條件下孵育12 h，孵育后的條帶清洗3次（1%吐溫），加入二抗（山羊抗兔，稀釋濃度1∶1 000）孵育2 h，LAS 4 000成像并觀察結果。

1.7 統計學方法 實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行分析，計量資料符合正態分布以“均數±標準差”（）表示，多組比較采用單因素方差分析，并采用LSD-t法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預知子提取物對大鼠Morris水迷宮實驗結果的影響 與假手術組比較，模型組大鼠逃逸時間顯著增加（P＜0.05）；在給予預知子提取物和艾司西酞普蘭干預后，與模型組比較，陽性對照組和預知子提取物各劑量組大鼠逃逸時間顯著降低（P＜0.05），且預知子提取物各劑量組具有劑量依賴性（P＜0.05）；預知子提取物高劑量組大鼠逃逸時間與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠逃逸時間比較 （，s）

表1 各組大鼠逃逸時間比較 （，s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05；與預知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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2.2 大鼠腦組織病理結果 假手術組大鼠腦組織未見明顯異常，模型組大鼠腦組織伴有大量炎癥細胞浸潤，細胞變形，邊界不清，鏡下發現部分區域有出血點，在給予大鼠預知子提取物和艾司西酞普蘭干預后，以上病理狀態均有所緩解，其中陽性對照組和預知子提取物高劑量組最為明顯。（見圖1）

圖1 各組大鼠腦組織病理切片圖 （HE，×200）

圖2 各組大鼠PI3K、Akt 蛋白表達Western blotting 圖

2.3 預知子提取物對大鼠血清炎癥因子的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和預知子提取物各劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著降低（P＜0.05），且預知子提取物各劑量組具有劑量依賴性；預知子提取物高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比較（，pg/mL）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比較（，pg/mL）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05；與預知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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2.4 預知子提取物對大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和預知子提取物各劑量組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA均顯著降低（P＜0.05），且預知子提取物各劑量組具有劑量依賴性；預知子提取物高劑量組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA表達水平比較（，2-ΔΔCT）

表3 各組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA表達水平比較（，2-ΔΔCT）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05;與預知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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2.4 預知子提取物對大鼠PI3K、Akt蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠PI3K、Akt蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和預知子提取物各劑量組大鼠PI3K、Akt蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），且預知子提取物各劑量組具有劑量依賴性；預知子提取物高劑量組大鼠PI3K、Akt蛋白表達與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠PI3K、Akt 蛋白表達水平比較 （，2-ΔΔCT）

表4 各組大鼠PI3K、Akt 蛋白表達水平比較 （，2-ΔΔCT）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05；與預知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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3 討論

卒中的部位、性質、患者年齡、性別、機體健康狀況、家庭等均是卒中后失眠發生的重要影響因素[11]。目前對卒中后失眠的患者的研究調查普遍認為神經內分泌系統紊亂會導致卒中患者失眠的風險增加[12]。而炎癥反應的發生可能是引起機體神經內分泌系統紊亂的重要因素之一[13]。先前的研究[14]表明，中藥治療可以抑制機體炎癥反應，降低炎癥因子表達水平，如TNF-α、IL-1β和IL-6，逆轉了海馬線粒體功能障礙并抑制了炎癥反應發生。此外，中藥治療可減少卒中大鼠海馬區的凋亡細胞數量，從而緩解卒中引起的神經功能損傷，有利于疾病的恢復[15]。本研究中筆者基于預知子提取物的神經調節作用，采用其作為卒中后失眠大鼠的干預藥物，結果顯示，在構建卒中后失眠大鼠模型后，通過mNSS評分發現大鼠出現了神經功能損傷，同時通過水迷宮實驗結果發現大鼠的學習和記憶功能均受到了一定程度的損傷。在給予大鼠預知子提取物治療后，可顯著改善大鼠神經功能受損情況，同時大鼠學習和記憶能力也得到了大幅改善，提示預知子提取物對于卒中后失眠大鼠神經功能具有較好的治療作用，同時可有效提高其學習記憶能力，這可能與預知子提取物能有效提高神經遞質蛋白親和力，改善神經系統功能有關。

炎癥反應是大多數疾病的主要影響因素，因此本研究檢測了各組大鼠血清的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6。TNF-α是體內一種重要的促炎性細胞因子，在多種生理反應中起著至關重要的作用，如炎癥介質的合成和釋放、中性粒細胞在肺部的積聚和補體激活[16]。IL-6是免疫調節重要的影響因子。研究表明，IL-6的表達水平可反映機體炎癥反應程度，具有催化和放大炎癥反應的作用，因此臨床常作為急慢性炎癥診斷指標[17]。IL-1β是一種重要的炎癥因子，可誘導產生和釋放多種炎癥因子[18]。本研究結果顯示，當大鼠發生卒中后，其血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著升高，提示此時大鼠炎癥反應加劇，在給予預知子提取物治療后，血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著降低，同時結合各組大鼠病理結果，發現預知子提取物各劑量組大鼠腦組織炎癥細胞浸潤明顯減少，表明預知子提取物可通過降低機體血清TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平，減緩炎癥反應，從而達到恢復大鼠神經功能的功效。

眾所周知，PI3K/Akt通路在包括細胞增殖、遷移和凋亡等生物學過程中具有重要作用[19]。此外，它還與許多人類炎癥疾病有關，PI3K/Akt通路的激活，可引起炎癥基因轉錄上調，從而導致大量炎癥細胞因子的產生，如TNF-α、IL-1β和IL-6，提示PI3K/Akt通路在機體炎癥發展中具有重要作用[20]。本研究構建了卒中后失眠大鼠模型，根據PCR和蛋白免疫印跡結果發現PI3K/Akt信號通路被激活，而預知子提取物的治療抑制了PI3K/Akt信號通路，同時機體炎癥反應減弱，提示預知子提取物可能通過抑制PI3K/Akt信號通路蛋白相關表達，降低機體炎癥反應，達到治療效果。

綜上所述，預知子提取物可有效改善卒中后失眠模型大鼠的神經功能損傷，其機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路，下調炎癥因子表達，減弱機體炎癥反應有關。