開放實驗教學探索*
——以硫酸軟骨素的提取和分析鑒定為例

湯佳立 童玥

1 中國藥科大學生物制藥實驗教學中心 南京 211198 2 中國藥科大學生命科學與技術學院 南京 211198

0 引言

郭沫若說過：“教學的目的是培養(yǎng)學生自己學習，自己研究，用自己的頭腦來想，用自己的眼睛去看，用自己的手來做這種精神。”培養(yǎng)具有獨立實踐能力、學習主動性和創(chuàng)新能力的技術型人才是黨和人民賦予高校的歷史使命，具有創(chuàng)新意識的實驗室是培養(yǎng)大學生創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力的重要平臺。只有努力創(chuàng)造條件，給學生更多進入實驗室的機會，才能激發(fā)學生在實踐中參與創(chuàng)新的積極性，從而充分發(fā)揮實驗教學在本科生素質教育和創(chuàng)新能力培養(yǎng)中的作用。為此，圍繞培養(yǎng)和提高大學生創(chuàng)新意識和能力，各地高校從實驗室資源建設和運行機制等方面進行了大量有益的探索和實踐，并取得了一些經驗[1-2]。

從2006 年開始，筆者所在高校嘗試建立符合本校實際情況的開放式實驗教學模式，采取實驗項目開放、實驗室開放等多種形式[3]。開放實驗項目一般是在每個學期初由教師申報課題，學生和教師雙向選擇，學生主要利用課余時間完成指定的實驗內容，實驗開展期間指導教師需在實驗室準備和維護實驗儀器設備，進行現(xiàn)場管理指導，項目持續(xù)至該學期結束，最后由指導教師對學生實驗完成情況作出評價。經過十多年的實踐，整體效果較好，不僅調動了廣大學生參與實驗的積極性和主動性，而且還激發(fā)了學生敢于探索、勇于創(chuàng)新的想象力和創(chuàng)造力。但從學生和教師的反饋來看在實驗內容和開放方式等方面還可以進一步完善。

近20 多年來，現(xiàn)代生物技術發(fā)展迅速。60%以上的生物技術成果應用于醫(yī)藥行業(yè)，生物制藥產業(yè)也在崛起。傳統(tǒng)醫(yī)學得到了改進，特色新藥得到了開發(fā)[4]。與此同時，對生物制藥專業(yè)人才的需求也在逐年增加。這就對高校培養(yǎng)具有獨立思考和解決問題能力、實踐和創(chuàng)新能力的生物制藥人才提出了更高的要求。

筆者負責生物制藥實驗中心的實驗教學輔助工作。實驗室面向生物制藥專業(yè)、生物技術專業(yè)等開設生物制藥綜合、生物制藥工藝學、生物技術等實驗課程。在平時與學生的交流過程中發(fā)現(xiàn)，學生對于開放實驗有較高的熱情，希望在選題方面有更多的選擇、有更多的參與自主設計的機會。為此筆者和教研室教師一起設計了“硫酸軟骨素的提取和分析鑒定”的綜合性實驗作為開放實驗，并添加了翻轉課堂的理念。該實驗綜合了多糖的制備、含量測定、瓊脂糖電泳鑒定等生物制藥行業(yè)的基礎操作技能，適合本科生完成，融入翻轉課堂的形式后學生自主參與度更高，有利于培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維，提高學生自主學習和科研創(chuàng)新能力[5]。

1 實驗設計背景及意義

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是以蛋白聚糖的形式廣泛分布于動物的軟骨、肌腱、韌帶和血管壁等組織中的一種酸性粘多糖[6-7]。硫酸軟骨素作為一種天然產物，具有增強免疫力、抗關節(jié)炎、調節(jié)血管生成、降血脂、抗病毒、抗凝、抗腫瘤等多種生物活性[8-10]，還具有保水性、保膠性和高黏性[11]，已經被廣泛應用于醫(yī)藥、功能性食品、化妝品添加劑等領域，具有良好的市場前景。硫酸軟骨素的提取方法主要有：濃堿提取、稀堿濃鹽提取、酶提取法及超聲波法等。不同的原料，適用的提取方法也會有所差異。

2 將翻轉課堂融入開放實驗教學

近年來，翻轉課堂在理論課教學中逐漸成為一種熱門的教學方式，很好地突出了以學生為中心的理念。傳統(tǒng)的教學模式是由教師的課堂講解為主，學生被動接受，而翻轉課堂則是學生課前自主學習，課堂上師生深度互動，從而提高學生的學習效率[12]。

將翻轉課堂的形式融入開放實驗項目，可以更好地發(fā)揮學生的主觀能動性。具體實施方案是：教師先擬定課題，課題不宜太復雜，選擇兩位以上不同專業(yè)或不同年級的學生，以便學生之間協(xié)調時間，保證實驗持續(xù)進行。建立開放實驗的QQ 討論群或者微信群，讓學生查找實驗相關文獻資料、視頻或者多媒體資源等共享在群內，學生通過該預習過程可以對將要開展的實驗有所了解。然后由學生根據實際的實驗材料和本實驗室情況擬定實驗方案。隨后組織學生現(xiàn)場討論，教師進行必要的講解和答疑，最終形成較為完善的實驗方案，并安排實驗日程，對于某些不清楚的操作細節(jié)可以由教師針對性地回答與補充，不會操作的儀器設備由教師現(xiàn)場指導。

3 開放實驗的設計

3.1 實驗材料與儀器

實驗材料：新鮮牛軟骨，胰蛋白酶，D-葡萄糖醛酸，四硼酸鈉，咔唑，巴比妥鈉，甲苯胺藍，瓊脂糖，NaOH，鹽酸，濃硫酸，無水乙醇，溴酚藍。

儀器：電子天平，離心機，組織搗碎機，紫外分光光度計，水浴鍋，電熱鼓風干燥箱，電泳儀，電泳槽。

3.2 實驗實施過程

3.2.1 硫酸軟骨素的提取

取新鮮牛軟骨，在80 ℃熱水中洗滌，用刀刮除骨表面的結締組織等雜質，清洗干凈，用組織搗碎機打碎，稱取10 g，加入30 mL（三倍骨重量）的1 mol/L NaOH，40 ℃堿提2 小時，隨后用4 mol/L鹽酸調節(jié)pH 至7.0，雙層濾布過濾，收集濾液，用4 mol/L NaOH 調節(jié)pH 至8.5 ～9.0，加入1‰濾液量的胰蛋白酶，40 ℃水解2 h（水解過程中應不斷調節(jié)溶液pH 至8.5 ～9.0），水解液80 ℃加熱30 min，4 mol/L 鹽酸調pH 至3.0，靜置2 h，4 000 rpm，5 min 離心收集上清，用4 mol/L NaOH調pH 至6.5，緩慢攪拌加入兩倍體積無水乙醇，靜置2 h，4 000 rpm，5 min 離心收集沉淀，無水乙醇脫水，再次4 000 rpm，5 min 離心，去除上清，刮取沉淀于干燥器中常溫干燥，得到硫酸軟骨素粗品0.13 g。

3.2.2 含量測定及得率計算

1）試劑配制。

D-葡萄糖醛酸標準溶液：0.0200 g D-葡萄糖醛酸標準品用去離子水定容至100 mL。

硼砂—硫酸試劑：四硼酸鈉4.7671 g 用濃硫酸定容至500 mL。

咔唑試劑：0.125 g 咔唑用無水乙醇定容至100 mL，低溫保存。

2）實驗步驟。

稱取硫酸軟骨素粗品0.1 g，用1.0 mL 去離子水溶解，再分別稀釋200 倍和300 倍后，采用硫酸咔唑法，于530 nm 波長處測其吸光值。

分別取D-葡萄糖醛酸標準溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 用去離子水定容至10 mL，得到濃度分別為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL 的 D-葡萄糖醛酸標準溶液。將各裝有5 mL 硼砂—硫酸試劑的7 支試管，在冰浴條件下分別加入1.0 mL不同濃度的D-葡萄糖醛酸標準溶液，用去離子水做空白對照，注意避免出現(xiàn)沸騰。沸水浴10 min 后迅速冷卻至室溫，分別加入咔唑試劑0.2 mL，沸水浴15 min 后冷卻至室溫。530 nm 測定吸收值。根據吸光值（A）和 D-葡萄糖醛酸濃度（C）繪制其標準曲線。

根據標準曲線方程（A 為吸光值，C 為葡萄糖醛酸含量，檢測范圍為0 ～120 μg/mL），計算提取物中葡萄糖醛酸含量:

葡萄糖醛酸含量（%）=（m1/0.1）×100

式中，m1為0.10 g提取物中葡萄糖醛酸含量（g）。已知硫酸軟骨素中氨基己糖的含量為37.00%（w/w），而氨基己糖與葡萄糖醛酸的質量比為0.82 ∶1（w/w），因此硫酸軟骨素中葡萄糖醛酸含量為45.12%（w/w），據此可以計算出提取物中硫酸軟骨素的得率：

硫酸軟骨素得率（%）=（m1/45.12%/m2）×100

式中m1為提取物中葡萄糖醛酸含量（g），m2為牛軟骨質量（g）。

3.2.3 瓊脂糖電泳鑒定

1）試劑配制。

電極緩沖液（0.06 mol/L 巴比妥鈉溶液）：取巴比妥鈉12.4 g 溶于800 ml 水中，用2 mol/L HCl調pH 值至8.2，加水定容至1 000 ml。

甲苯胺藍染色液：取甲苯胺藍0.2 g，加入少量乙醇，于60 ℃水浴加熱，待顆粒全部溶解后加水定容至200 ml，濾紙過濾備用。

2）瓊脂糖電泳。精確稱取8.0 mg 標準品，用1 ml 雙蒸水溶解，配制成8 mg/ml 的溶液。各吸取50 μl 分別與溴酚藍溶液1 ∶1 混合均勻，放入4 ℃的冰箱待用。

將測定含量用0.1 g/mL 的樣品溶液用雙蒸水稀釋1 倍，配成0.05 g/mL 的溶液。各吸取50 μl分別與溴酚藍溶液1 ∶1 混合均勻，放入4 ℃的冰箱待用。

稱取瓊脂糖0.5 g，加熱溶于50 ml 電極緩沖液中，冷卻至60 ℃左右。制成厚度約為3 mm 的膠板（7 cm×9 cm）。設0.05 g/mL、0.1 g/mL 兩個樣品濃度，5 μl、10 μl 兩種上樣量進行比較，于負極端點樣后置電泳槽中；加入電極緩沖液，在100 V電壓下進行電泳。觀察指示劑的移動情況，待指示劑行至距凝膠前沿約2 cm 處，停止電泳。剝取凝膠，用甲苯銨藍染色液染色10 min，用水脫色過夜，觀察結果。

4 結果與討論

4.1 含量測定及得率計算結果

標準曲線如圖1 所示。

圖1 葡萄糖醛酸標準曲線

樣品測定結果如表1 所示。

表1 葡萄糖醛酸含量

選取樣品稀釋300 倍后的測定結果進行計算：

葡萄糖醛酸含量（%）=（m1/0.1）×100

式中m1為0.10 g提取物中葡萄糖醛酸含量（g）。

葡萄糖醛=84.33×300/106/0.1×100=25.30%

硫酸軟骨素得率（%）=（m1/45.12%/m2）×100

式中m1為提取物中葡萄糖醛酸含量（g），m2為牛鼻軟骨質量（g）。

得率（%）=（0.13g×25.30%/45.12%/10）×100=0.73%

4.2 瓊脂糖電泳結果

設置0.05 g/mL、0.1 g/mL 兩個樣品濃度5 μl、10 μl兩種上樣量進行瓊脂糖電泳結果如圖2所示。

圖2 瓊脂糖電泳結果

1）0.05 g/mL 上樣10 μl；2）0.05 g/mL 上樣5 μl；3）0.1 g/mL 上樣10 μl；4）0.1 g/mL 上樣5 μl；5）標準品上樣5 μl 與標準品比對，電泳條帶位置完全一致，且濃度較高，在以后的實驗中樣品可以選用0.05 g/mL 的濃度，5 μl 上樣量進行電泳。

5 結束語

本次開放實驗的設計，引入了翻轉課堂的形式，充分體現(xiàn)了以學生為主體的教學理念，增強了學生參與實驗的主動性和積極性，通過實驗學生很好地掌握了硫酸軟骨素的提取、含量測定、得率計算、瓊脂糖電泳鑒定等實驗及分析方法。在實驗開展前，學生通過獨立查閱大量的文獻，學習視頻資料、多媒體材料，對硫酸軟骨素研究背景和目前的研究進展有了初步的了解，初步制定了實驗流程，經過師生的討論，最終形成完善的方案，該過程能夠讓學生體會到實驗的完整性和嚴肅性；在整個實驗過程中，學生之間、師生之間在遇到問題時能通過多種途徑進行積極的討論，活躍了學生的思維，訓練了他們獨立分析問題和解決問題的能力；實驗結束后，每位學生都要撰寫實驗論文，對實驗結果進行分析。整個流程下來，培養(yǎng)了學生查閱資料、設計實驗、團隊合作、論文寫作等多方面的能力，訓練了學生嚴謹的科學思維，激發(fā)了學生參與創(chuàng)新的熱情，也為學生后期的就業(yè)、深造奠定了基礎。