牛蛙歪頭白內障病的病原鑒定和藥敏試驗

趙婧，林旭埜，*，陳漢鍶，鄒偉斌

[1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510630；2.海泰達生物科技（廣州）有限公司，廣東 廣州 510630]

牛蛙（Rana catesbeiana）屬于脊索動物門，兩棲綱，蛙科，蛙屬，原產北美，是世界上最著名的大型食用蛙類[1]。牛蛙具有易養、適應性強、繁殖快、生長速度快、食性雜、餌料易解決等特點，養殖利潤相當可觀[2]。隨著養殖規模的擴大和放養密度的提高，各種病害相繼發生，并成為牛蛙養殖業發展的一個重大障礙[3]。蛙類病害主要分為細菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲性疾病[4]。細菌性疾病主要有由腦膜炎敗血伊麗莎白菌引起的蛙腦膜炎敗血金黃桿菌病；由嗜水產氣單胞菌引起的蛙紅腿病；由鏈球菌引起的鏈球菌病；由腸型點狀氣單胞菌引起的蛙腸胃炎病等。真菌性疾病主要有由多種水霉引起的水霉病等；寄生蟲性疾病主要有蛙車輪蟲病、纖毛蟲病等。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）為革蘭陰性菌，屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（klebsiella），分3 個亞種：肺炎亞種（subsp.pneumoniae）、鼻炎亞種（subsp.azaenae）和鼻硬結亞種（subsp.rhinoscleromatis）。由Friediander 于1893年從患大葉性肺炎病人的肺組織中首次分離到[5]。兼性厭氧，氧化酶為陰性[6]，能夠引起動物肺炎、腸炎、腦膜炎和敗血癥等嚴重疾病，也是一種重要的人獸共患病原菌[7]。

米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola, EMI）為屬于黃桿菌綱（Flavobacteria）黃桿菌目（Flavobacteriales）黃桿菌科（Flavobacteriaceae）伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia）細菌，該屬下還有腦膜炎敗血伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica, EME）、按蚊伊麗莎白菌（Elizabethkingia anophelis, EAN）和植物內生伊麗莎白菌（Elizabethkingia endophytica, EEN）。米爾伊麗莎白菌（EMI）于2003 年在和平空間站冷凝水中被首次發現，為革蘭陰性非發酵細菌[8]。

近期，江門市某牛蛙養殖場流行一種疾病，患病蛙出現頭向一側歪斜、運動遲緩、在水中旋轉、眼睛表面出現白色薄膜、食欲廢絕等癥狀，甚至死亡。為探明牛蛙病因，現通過分離鑒定患病牛蛙的病原，觀察致病菌感染牛蛙后的組織病理學變化，并對分離菌株的耐藥性和致病性進行試驗，以期為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2023 年4—5 月，試驗地位于廣州市天河區暨南大學科技產業大廈四樓。

1.2 材料

從廣東省江門市某牛蛙養殖場，取有歪頭白眼等癥狀的病蛙，帶回實驗室后立即解剖，對病原菌進行分離培養。再選擇80 只健康牛蛙，開展動物感染試驗。

1.3 試劑和儀器

血瓊脂平板（自廣州環凱微生物有限公司）、生化編碼鑒定盒（環凱微生物有限公司）、抗生素藥敏片（杭州微生物試劑有限公司）。

2 試驗方法

2.1 病原菌的分離、純化培養

在生物安全柜中進行細菌分離。隨機選取具有典型癥狀的病蛙，解剖前用75%乙醇消毒全身。將剪刀加熱消毒處理后，用剪刀背面烙烤嚴重病變組織表面，再用剪刀剪開組織，將無菌接種環伸入切口，輕輕轉動，蘸取病蛙的腦和內臟組織，劃線于血瓊脂平板上，培養箱中37 ℃培養24～48 h，觀察分離細菌的菌落形態。挑取優勢菌落，進一步純化培養，用于形態學觀察、生理生化分析、分子鑒定和動物回歸試驗。

2.2 形態學觀察

將分離得到的各菌株，分別進行革蘭染色，并在顯微鏡下觀察、記錄下菌落的形態特點。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 基因分子鑒定

分別提取分離得到的優勢菌基因組的DNA，對菌株進行16S rRNA 基因PCR 擴增。16S rRNA 基因上游引物為：5’-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物為：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。反應條件：95 ℃1 min；98 ℃15 s；55 ℃30 s；72 ℃2 min；35 個循環；72 ℃10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證為目的片段大小后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司純化和測序。測序得到的基因序列在NCBI 中進行BLAST 分析比對，從數據庫獲得相關屬種的16S rRNA 基因序列，找到相似性較高的菌株，用MEGA11.0 軟件構建系統發育進化樹。

2.3.2 生理生化鑒定

分離得到的菌株生理生化指標，采用生化編碼鑒定盒進行檢測。檢測項目為山梨醇、纖維二糖、棉籽糖、蛋白胨水、西蒙氏檸檬酸鹽、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、半固體瓊脂、葡萄糖、硫化氫、乳糖、尿素、七葉苷、甘露糖、阿拉伯糖、氰化鉀生長試驗管，觀察試驗結果。生化編碼鑒定盒均購自環凱微生物有限公司，操作方法詳見該試劑盒說明書，參照常見細菌系統鑒定手冊[9]中細菌生理生化指標進行確認。

2.4 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散法，檢測菌株藥物敏感性。首先將分離得到的菌株，分別接種于LB 液體培養基，28 ℃振蕩培養24 h 后，于8 000 r/min 離心10 min 沉淀菌體，用無菌PBS 稀釋菌體至0.5 mcf，取20 μL 菌懸液均勻涂布于LB 固體平板上，待菌液被吸收后，向培養基貼不同抗生素藥敏紙片，置于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h，測量抑菌圈直徑，并根據杭州微生物試劑有限公司藥敏試劑判斷標準來判定結果。

2.5 動物感染試驗

選擇80 只健康牛蛙，試驗前在養殖箱里暫養2 周，每天換1 次水，水溫保持在25～28 ℃，正常投喂商品飼料，設置4 框，每框20 只。將純化后分離得到的菌株，分別接種到LB 液體培養基中培養12 h，離心收集菌體，用無菌生理鹽水將菌株配置成1×106cfu/mL 的菌懸液。

將牛蛙隨機分為3 個感染組和1 個陰性對照組，每組20 只。將分離得到的菌株的菌懸液和分離得到的菌株的混合菌懸液，分別注射到3 個感染組的健康牛蛙腹腔，劑量為0.2 mL/只，每組注射20 只，陰性對照組則腹腔注射無菌PBS緩沖液（0.2 mL/只）。每日觀察，記錄牛蛙發病和死亡情況，連續觀察20 d。

3 結果與分析

3.1 病原菌的分離、純化培養及形態學觀察

將感染的病蛙樣品，接種于血瓊脂培養基上培養24 h 后，從病蛙體內不同組織處取樣，均分離到2種形態的優勢菌落，見圖1（a）（b）。

圖1 病料接種在培養基培養24 h 后的形態學觀察結果

由圖1 可見，一種菌落呈淡黃色，圓形至橢圓形不等，略隆起，表面光滑，另一種菌落呈灰白色，多突起、質地黏稠，挑起時更易呈拉絲狀。將分離菌進行革蘭染色后，于普通光學顯微鏡油鏡下觀察，結果見圖2（a）（b）。

圖2 分離細菌革蘭染色鏡檢結果

由圖2 可見，菌體均呈紅色，可初步判斷分離細菌均為革蘭陰性菌；一種分離菌呈短桿狀比較分散的排列，另一種分離菌呈兩端較鈍的短粗球桿狀較連續的排列。將分離菌均接種于常見的細菌分離培養基中連續培養7 d，未見其他微生物生長。將純化后的細菌命名為JM2023A 株和JM2023B 株。

3.2 病原菌鑒定

3.2.1 基因序列分析與系統發育樹的構建

用細菌通用引物擴增JM2023A 株和JM2023B株的16S rRNA 基因，擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，擴增出1 600 bp 左右的目的條帶（圖3），將PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果與NCBI 數據庫進行比對，用JM2023A 株與GenBank 中同源性比較高的米爾伊麗莎白菌屬的16S rRNA 序列構建進化樹，再用JM2023B 株與GenBank 中同源性比較高的克雷伯菌屬的16S rRNA 序列構建進化樹結果見圖4、圖5。JM2023A 株與米爾伊麗莎白菌聚為一支，JM2023B株與肺炎克雷伯菌聚為一支。

圖3 JM2023A 株和JM2023B 株的擴增結果

圖4 JM2023A 株的16s rRNA 基因序列系統發育樹

圖5 JM2023B 株的16s rRNA 基因序列系統發育樹

3.2.2 生理生化鑒定

利用細菌微量生化鑒定管，對分離株JM2023A株和JM2023B 株進行生化指標測定，結果見表1。數據比對見細菌系統鑒定手冊[9]。由表1 可見，分離株JM2023A 株的生化指標與米爾伊麗莎白菌一致，分離株JM2023B 株的生化指標與肺炎克雷伯菌一致。結合JM2023A 株和JM2023B 株的理化特性與基因分析結果，綜合判定JM2023A 株為米爾伊麗莎白菌，JM2023B 株為肺炎克雷伯菌。

表1 JM2023A 株和JM2023B 株的生化鑒定結果①

3.3 藥敏試驗

對30種藥物進行藥敏試驗，結果見表2。由表2可見，JM2023A 株對多黏菌素B 敏感；對多西環素、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢拉定、哌拉西林中度敏感；對其他抗生素表現為耐藥。JM2023B 株對頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林中度敏感；對其他抗生素表現為耐藥。

表2 JM2023A 株和JM2023B 株的藥敏試驗結果 mm

3.4 動物回歸試驗

將注射JM2023A 菌懸液的命名A 組，注射JM2023B 菌懸液的命名B 組，注射JM2023A 和JM2023B 混合菌懸液的命名C 組，注射無菌PBS 緩沖液的命名D 組。試驗中，A、B、C 3 組的牛蛙均出現不同程度死亡，A 組蛙出現皮膚變黑、頭向一側歪斜、在水中旋轉、眼睛表面出現白色薄膜、食欲下降等癥狀，死亡率70%；B 組蛙出現眼睛表面出現白色薄膜、厭食懶動，應急能力差、身體失去平衡等癥狀，死亡率15%；C 組蛙出現皮膚變黑、眼睛表面出現白色薄膜、厭食懶動、游動時身體打轉、應急能力差等癥狀，死亡率90%；而D 組未見患病蛙或者死亡蛙，試驗結果見表3。從A 組感染發病牛蛙組織中再次分離出的病原菌經鑒定為米爾伊麗莎白菌，從B 組感染發病牛蛙組織中再次分離出的病原菌經鑒定為肺炎克雷伯菌，從C 組感染發病牛蛙組織中再次分離出的病原菌經鑒定為米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌。可見本次回歸試驗符合科赫氏法則。

表3 動物回歸試結果

4 討論

近年來，養殖戶為了追求高額利潤加大了養殖密度，使水體承載能力加大，同時也加大了投餌率，導致水體受到嚴重污染，各種病害微生物大量繁殖，溫度升高，導致各種病害加大，如蛙的歪頭病、白內障病、紅腿病、腹水病等[10]，其中歪頭病、白內障病是近年來養殖蛙類危害最大的病害之一。

本試驗從患病牛蛙內臟中分離純化出2 株疑似菌，通過觀察菌落形態、革蘭染色、藥敏試驗、生化鑒定、16S rDNA 基因檢測、構建分子進化樹等，鑒定為米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌，回歸試驗感染后，可見引起歪頭和白內障等癥狀，證實了2種菌可引起牛蛙歪頭白內障病。

藥敏試驗結果顯示，米爾伊麗莎白菌株對多黏菌素B 敏感；對多西環素、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢拉定、哌拉西林中度敏感；對其他抗生素表現為耐藥。肺炎克雷伯菌株僅對頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林中度敏感；對其他抗生素表現為耐藥。2 個菌株均具有較強的耐藥性，肺炎克雷伯菌的藥敏試驗結果，與周蓉等[11-12]的試驗結果差異較大。可見不同地區肺炎克雷伯菌耐藥性有一定的差異，原因可能是不同地區臨床中用于治療肺炎克雷伯菌引起的疾病，常用藥物存在差異導致，同時表明，肺炎克雷伯菌的耐藥性在增加，可能是由于抗生素使用不當引起。這種變化趨勢，對該菌的臨床治療和控制帶來了巨大的挑戰，建議在臨床防治牛蛙歪頭白內障病時，不選用農業農村部明令禁止使用的氯霉素、呋喃唑酮等藥物[13]，并且依據藥敏結果，選擇合適的抗生素，采用交叉及聯合用藥等方式，避免濫用抗生素，加強臨床用藥監管，以降低細菌的耐藥率[14]。同時視情況可以考慮采用非抗生素依賴性手段，例如疫苗。據周永燦等[15]的研究結果，接種白內障病蛙中分離的病菌制備的滅活疫苗，對有效預防該病的發生確實具有十分良好的效果。

動物回歸試驗結果顯示，A、B、C3 組菌液在注射試驗蛙后，同樣出現了白內障，歪頭等現象，且都具有一定的致病性，但程度不同。確定了米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌是其致病菌，也確定了江門市某牛蛙養殖場疾病暴發的主要原因，是感染了細菌性病原菌。A 組注射米爾伊麗莎白菌液的試驗蛙死亡率70%；B 組注射肺炎克雷伯菌液的試驗蛙死亡率15%；C 組注射米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌混合菌液的實驗蛙死亡率90%；而D 組注射PBS未見患病蛙或者死亡蛙。可見米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌均可導致牛蛙患歪頭白內障病死亡，其中米爾伊麗莎白菌為主要致病菌。而米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌共同致病時，死亡率相較于2 個菌單獨作用時，有明顯升高趨勢。本試驗結果表明，2種菌共同致病時，有協同作用。建議在臨床上，選擇對2種菌均有效的治療方案。

5 結論

通過菌落形態、生化特性、基因序列、藥敏性、致病性等方面試驗，分離得到病原菌，確定了江門市某牛蛙養殖場牛蛙歪頭白內障病的病原為米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌。2種菌均對多數抗生素耐藥，共同致病時，具有協同作用，對牛蛙具有比各自單獨致病時更高的致死率。