大竹米酒滋味品質與細菌類群的關聯性分析

向凡舒，蔡文超，郭 壯，劉慧杰，余海燕，單春會*

（1.石河子大學食品學院，新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832000；2.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；3.北京忠和房縣生物食品有限公司，湖北 十堰 442100；4.湖北廬陵王酒業有限責任公司，湖北 十堰 442100）

米酒，又稱醪糟，其作為國酒的起源，釀造歷史源遠流長[1]，因酒香濃郁、口感甘甜和營養豐富，深受中國和日本等亞洲國家人群的喜愛[2]。在米酒的發展歷程中，相關從業人員對其釀造工藝進行了許多創新，例如在米酒制作中添加其他原料，增添營養組分或提升風味[3]；使用酵母和酶制劑代替傳統米酒曲進行純種發酵，減少能耗，提高效率[4]。除了釀造工藝，微生物對米酒品質的形成亦發揮了關鍵作用[5]，因而許多科研人員開始解析米酒和米酒曲中的微生物群系。通過比較江蘇蘇州與湖北宜昌地區米酒的微生物類群，Lu Yucai等[6]發現蘇州米酒中的真菌以扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和米根霉（Rhizopus oryzae）為主，宜昌米酒以米根霉和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）為主；兩個地區米酒中的細菌均以檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）為主，且細菌多樣性要顯著大于真菌多樣性。Zhao Xinxin等[7]對湖北、四川和廣西地區米酒曲的細菌群落結構進行解析，結果發現它們的細菌組成較為相似，均以魏斯氏菌屬（Weissella）為主，但在細菌結構上，湖北和四川地區的米酒曲更為相似，廣西地區較為不同。此外，日本的一項研究發現，即便在使用以酵母為主的發酵劑發酵時，米酒中仍存在著較多的細菌類群[8]。上述研究表明米酒和米酒曲中的微生物形成可能受到了原料來源、地域環境和發酵過程等多重因素的影響，且細菌在米酒的發酵過程中發揮了不可或缺的作用。

我國四川省大竹縣擁有“醪糟之鄉”的美譽，當地米酒被列入在我國國家地理標志產品名列之中。然而目前針對大竹米酒的研究還鮮見報道，因而全面解析大竹米酒的品質以及細菌群落結構十分必要。隨著技術的不斷更新，電子舌等一系列仿生設備憑借其檢測快速和數據實時監測等特點逐漸取代了冗長而費力的常規檢測方法，在食品質量檢測領域占據了極大的優勢[9]。Illumina MiSeq是實現測序高效、準確且低成本的理想平臺，亦是使用最為廣泛的第二代測序平臺之一，在醫學、生物和農業領域均被廣泛應用[10]。目前也作為解析大曲[11]、泡菜[12]和黃酒[13]等眾多發酵食品微生物類群的主要方法之一。

本研究在使用電子舌對大竹米酒滋味品質實現數字化評價的基礎上，對其有機酸和游離氨基酸種類及含量進行測定，采用純培養法對其中的乳酸菌進行分離鑒定和保藏，結合MiSeq高通量測序技術解析其細菌群落結構，并對細菌菌群與滋味品質間的關聯性進行探究，最后將大竹米酒與恩施米酒的細菌群落結構及菌群功能進行比較分析，以期為推動當地米酒的產業化發展提供一定的理論參考依據，對農產品推廣起到一定的積極影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米酒于2 0 2 1 年5 月采集自四川省大竹縣（E106°59’～107°32’，N30°20’～31°00’）西門綜合市場和興光農貿市場。

M R S 合成培養基 青島海博生物技術有限公司；宏基因組DNA提取試劑盒 德國QIAGEN公司；10×Buffer、dNTP緩沖液、TaqDNA聚合酶和T 載體 寶生物工程（大連）有限公司；正/反向引物3 3 8 F/8 0 6 R（正向引物序列3 3 8 F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；反向引物序列806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SA402B電子舌（配備傳感器CA0、C00、AE1、CT0、AAE、GL1和2 個參比電極） 日本Insent公司；PHS-3C數顯臺式酸度計 上海越平科學儀器有限公司；L C-2 0 A D X R 高效液相色譜儀 日本島津公司；Biochrom 30＋全自動氨基酸分析儀 英國Biochrom公司；Vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司；R930機架式服務器 美國Dell公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理

從四川大竹縣西門綜合市場和興光農貿市場共采集米酒樣品7 份，編號為DZ1～DZ7。所采集的樣品均為當地農戶家庭制作，制作步驟如下：首先將糯米浸泡6 h，然后進行蒸飯、攤涼和淋飯，待其溫度降至32 ℃時加入研磨成粉的米酒曲拌勻，之后將米飯裝入容器中鋪平并輕輕壓實，中心處挖一個洞，接著在容器口蓋上紗布，最后用棉被包裹整個容器保溫發酵2～3 d。當米酒發酵好后，中心的洞會盛有汁水。將采集到的樣品分別裝入無菌采樣袋中低溫下運送回實驗室，置于-40 ℃冰箱中備用。

1.3.2 米酒滋味品質的數字化評價

樣品預處理：稱取30 g米酒樣品于燒杯中，加入120 mL純水，攪拌均勻后轉移至200 mL離心杯，5 000 r/min離心10 min，取上清液進行抽濾，將收集到的濾液置于-40 ℃備用。之后參照王玉榮等[14]方法使用電子舌對米酒的滋味指標進行測定。

1.3.3 米酒pH值和有機酸組分及其含量測定

參照酸度計使用說明書，使用pH 6.86和pH 4.00的標定液對酸度計進行兩點標定，繼而測定米酒的pH值。有機酸含量測定樣品前處理：稱取10.0 g米酒樣品置于研缽中研碎后，將其轉移至50 mL容量瓶中，使用流動相（0.01 mol/L K2HPO4溶液）定容，充分混勻后吸取1.5 mL勻液至2 mL EP管中，12 000 r/min離心3 min，取上清液使用0.22 μm濾膜過濾備用。參照王丹丹等[15]的方法制備7 種有機酸（草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸）的標準溶液，并采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對有機酸組分及含量進行測定。

1.3.4 氨基酸組分及其含量測定

樣品前處理方法參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》，預處理完成后參照馬佳佳等[16]的方法將樣品上機檢測。

1.3.5 乳酸菌分離、純化和鑒定

參照張振東等[17]的方法對米酒中乳酸菌菌株進行初步篩分并保藏，提取疑似乳酸菌菌株DNA，對序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增、產物清潔和連接轉化，最后挑取陽性克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序。將測序返回的序列上傳至NCBI網站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對確定其物種信息。

1.3.6 樣品宏基因組DNA提取、PCR擴增及測序

使用試劑盒提取米酒中細菌的宏基因組DNA，提取的DNA置于-20 ℃備用。在對序列進行PCR擴增前，先在引物中添加核苷酸標簽（barcode），之后參照王玉榮等[18]的方法對總DNA的16S rRNA V3～V4區域進行擴增，將檢測合格的PCR產物寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。

1.3.7 生物信息學分析

本研究采用QIIME平臺（v1.9.0）進行生物信息學分析。首先將測序返回的雙端序列進行拼接和歸并，剔除錯配率≥0.2、引物堿基錯配數≥2 bp或barcode堿基有錯配的低質量序列[19]，使用UCLUST兩步法對有效序列按照100%和97%相似度構建可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[20]，刪除含有嵌合體的OTU[21]，選取代表性序列在數據庫[22-24]中進行比對并確立其生物分類學地位；計算各樣品中細菌類群的α多樣性指數，基于非加權的UniFrac距離解析大竹米酒與恩施米酒細菌類群的β多樣性；采用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件對大竹米酒與恩施米酒的細菌基因功能進行預測[25]。

1.4 數據處理與分析

使用R軟件（v 4.1.1）繪制小提琴圖、氣泡圖、熱圖和啞鈴圖；使用MAGE7軟件構建乳酸菌菌株系統發育樹；使用Origin 2019軟件制作主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）散點圖和主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖；使用SAS（v8）軟件計算優勢細菌與滋味品質間的相關性系數，并使用Cytoscape（v3.7.2）軟件繪制相關性網絡圖；利用在線作圖網站（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）制作LEfSe圖；采用Mood-median檢驗法計算顯著性。

2 結果與分析

2.1 大竹米酒滋味品質評價及有機酸和氨基酸種類和含量分析

首先利用電子舌對大竹米酒的滋味品質進行數字化評價，繼而對其有機酸及游離氨基酸含量進行測定。由圖1A可知，大竹米酒在咸味、酸味和苦味指標上的差異較大，而在后味A、后味B和豐味指標上的差異較小。由圖1B可知，大竹米酒的pH值在3.59～4.06之間；乳酸是大竹米酒中含量最豐富的有機酸，平均含量達8.82 mg/g，其次為乙酸、琥珀酸和檸檬酸，平均含量分別為6.27、3.75 mg/g和2.63 mg/g，而蘋果酸和草酸含量較低。由圖1C可知，在7 份米酒中共檢測出15 種氨基酸，平均氨基酸總量達39.6 mg/g。其中包含7 種必需氨基酸，累計平均含量為14.5 mg/g，非必需氨基酸累計平均含量為25.1 mg/g；谷氨酸是大竹米酒中含量最高的氨基酸（8.06 mg/g），其次為亮氨酸（4.10 mg/g）和天冬氨酸（3.94 mg/g）等，纈氨酸含量最低（0.576 mg/g）。

圖1 大竹米酒各滋味指標相對強度（A）、有機酸（B）和氨基酸（C）含量分析Fig.1 Relative intensity of taste attributes (A), and organic acid (B)and amino acid (C) contents of Dazhu rice wine

2.2 基于純培養技術大竹米酒中乳酸菌的分離和鑒定

本研究進一步對大竹米酒中的乳酸菌進行分離，并對菌株進行純化保藏和鑒定。從7 份大竹米酒中共分離出14 株疑似乳酸菌菌株，樣品DZ1～DZ7中分別分離出1、1、3、4、1、2 株和2 株。選取了其中3 株分離株的菌落形態和鏡檢形態進行呈現，并依據所有分離株的鑒定序列構建了系統發育樹。由圖2A可知，米酒中的分離株菌落顏色均為白色，表面光滑且濕潤，但形狀各異。菌株DZ2-1菌落呈圓形，較扁平，周圍透明圈較大；菌株DZ3-3菌落呈圓形，較隆起，周圍透明圈較小；菌株DZ4-4菌落呈水滴形，較隆起，周圍無明顯透明圈。由圖2B可知，菌株DZ2-1細胞形態為球形，菌株DZ3-3為短桿狀，而菌株DZ4-4為短棒狀。由圖2C系統發育樹可知，14 株分離株共鑒定到5 個種，2 株被鑒定為副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei），2 株被鑒定為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），4 株被鑒定為發酵黏液乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum），2 株被鑒定為假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），4 株被鑒定為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），均屬于乳酸菌類群。

2.3 基于MiSeq技術大竹米酒細菌類群解析

在對大竹米酒中乳酸菌進行了初步分析后，進一步采用MiSeq高通量測序技術對其細菌群落結構進行解析，7 份米酒樣品通過測序共得到345 083 條序列，經質控后去除2 399 條低質量序列，余下342 684 條高質量序列，平均每個樣品約含有48 954 條序列。所有高質量序列共鑒定到了14 個門、39 個綱、61 個目、123 個科和194 個屬，分別從細菌門和屬水平上進行了解析，并將相對含量大于1.0%的細菌門和屬定義為優勢門和屬。由圖3A可知，大竹米酒中有2 個優勢門，分別為厚壁菌門（Firmicutes，91.65%）和變形菌門（Proteobacteria，5.28%），累計相對含量達96.93%，且Firmicutes為DZ2、DZ6和DZ7樣品中唯一優勢門。由圖3B可知，大竹米酒中有6 個優勢屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus，66.83%）、Pediococcus（9.23%）、Weissella（5.42%）、乳球菌屬（Lactococcus，4.47%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，2.17%）和不動桿菌屬（Acinetobacter，1.31%），累計相對含量達89.43%，但僅有Lactobacillus在所有樣品中的相對含量均大于1.0%。除了在樣品DZ2中以Pediococcus（56.74%）為含量最高的菌屬，其他樣品中含量最高的菌屬均為Lactobacillus。需要說明的是，Zheng Jinshui等[26]對Lactobacillus進行重新分類后劃分出了23 個新屬，其中就包括在2.2節出現的Limosilactobacillus、Lacticaseibacillus和Lactiplantibacillus，然而這些信息目前還未在QIIME分析平臺的RDA、Greengenes和SILVA數據庫中進行更新，因而本研究基于MiSeq高通量測序注釋出的Lactobacillus包含了所有新屬。

圖3 大竹米酒中優勢細菌門（A）和屬（B）分布情況及相對含量Fig.3 Distribution and relative content of dominant bacterial phyla (A) and genera (B) in Dazhu rice wine

我國湖北省恩施土家族苗族自治州生態環境良好，物種資源豐富，當地傳統發酵食品種類眾多，例如醬豆[27]、米酒曲[28]和米酒[19]等，因而本研究在MG-RAST數據庫中下載了團隊此前研究的10 份恩施米酒樣品序列[19]，進一步比較分析大竹地區與恩施地區米酒菌群結構的α多樣性和β多樣性。如圖4A、B可知，大竹米酒與恩施米酒的平均Chao1指數分別為1 111和506，平均Shannon指數分別為4.18和1.90，兩地區米酒Chao1指數差異極顯著（P＜0.001），Shannon指數差異顯著（P＜0.05）。由圖4C可知，在非加權UniFrac距離的PCoA，兩個地區的米酒在空間排布上呈現出了明顯的分離趨勢。大竹米酒均分布在橫坐標的正半軸上，且大多集中在縱坐標的零點附近，而恩施米酒均分布在橫坐標的負半軸和縱坐標的整個坐標軸上。由此可見，大竹米酒在細菌豐度和多樣性上差異較大。如圖5所示，在線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）閾值得分為3.0時，兩個地區米酒中共有9 個菌群類別存在顯著差異。大竹米酒中存在5 個差異類群，其生物標志物為Lactobacillus，恩施米酒中存在4 個差異類別，其生物標志物為Pediococcus。

圖4 大竹和恩施米酒的Chao1指數（A）、Shannon指數（B）及基于非加權的UniFrac距離PCoA（C）比較分析Fig.4 Comparative analysis of Chao1 index (A), Shannon index (B) and PCoA based on unweighted UniFrac distance (C) of Dazhu and Enshi rice wine

圖5 LDA圖Fig.5 Linear discriminant analysis

在比較了兩個地區米酒菌群結構的差異后，對兩者細菌菌群的基因功能亦進行了比較分析。將序列上傳至PICRUSt軟件比對共得到了4 402 個直系同源集（clusters of orthologous groups，COG），所有COG共注釋到了23 個功能類別，如圖6所示。所有樣品中的菌群均在E、G、J、K、L和M功能上有較高的表達，而在A、B、N和Z上的表達量較低。由聚類可知，兩個地區的米酒在菌群功能上沒有明顯的分離趨勢。然而，經Mood-median檢驗發現兩個地區的米酒在B、F和J功能上差異顯著（P＜0.05），在G和K功能表達上差異非常顯著（P＜0.01）。

圖6 大竹和恩施米酒的細菌功能預測（a）及功能差異分析（b）Fig.6 Prediction of bacterial functions (a) and analysis of functional differences (b) between Dazhu and Enshi rice wine

2.4 大竹米酒各滋味指標與細菌類群的關聯性分析

進一步針對菌群結構和滋味品質進行了相關性分析。由圖7A可知，在基于非加權UniFrac距離的PCA中，7 份米酒樣品在整個空間中呈現出了2 個明顯的聚類，一個聚類由DZ2、DZ4和DZ5組成，另一個聚類由DZ3、DZ6和DZ7組成，而DZ1距離這2個聚類均較遠。由圖7B可知，基于滋味指標7 份樣品被分成了3 個聚類，一個聚類為樣品DZ2、DZ3、DZ6和DZ7，一個聚類為樣品DZ1和DZ5，另一個聚類為樣品DZ4。結合圖7A、B可發現，在基于OTU水平和基于滋味指標的兩個空間分布中，樣品呈現出的聚類趨勢有部分重疊。因而本研究進一步探討了優勢菌屬和滋味指標間的相關性。由圖7C可知，Lactobacillus和Lactococcus與各項滋味指標更多呈正相關，而Pediococcus和Weissella與滋味指標更多呈負相關，Leuconostoc和Acinetobacter與各項滋味指標的相關性系數均較小。相關性檢驗結果顯示，Weissella與后味A、澀味和苦味指標間呈顯著負相關（P＜0.05）。

圖7 基于OTU水平的非加權UniFrac距離PCoA（A）、基于滋味指標的PCA得分圖（B）及優勢細菌屬與各滋味指標的相關性網絡圖（C）Fig.7 Unweighted UniFrac distance PCoA based on OTU level (A),PCA score plot based on taste indicators (B) and correlation network plot of dominant bacterial genera with taste indicators (C)

3 討論與結論

本研究采用電子舌評價了米酒的酸、苦、澀、咸和鮮5 個基本味與后味A、后味B和豐味3 個回味，結果發現大竹米酒在咸味指標上較為突出，而酸味指標較弱。通過Kang等[29]的研究發現，韓國米酒與大竹米酒有相似的滋味特征。眾所周知，有機酸和游離氨基酸是食品中間重要的呈味物質[30]。因而本研究進一步檢測了米酒中的有機酸和游離氨基酸，結果顯示有機酸以乳酸和乙酸為主，游離氨基酸以谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸為主。乳酸菌發酵是碳水化合物代謝產生乳酸和乙酸的主要途徑[31]，這間接表明了乳酸菌是米酒發酵過程中較為活躍的細菌類群，然而納入本研究的米酒其酸味卻較弱，這或許是因為米酒的發酵周期通常較短，僅有2 d左右，大部分的糖還未被代謝成酸。此外，谷氨酸和天冬氨酸在酸性食品中可作為鮮味物質的前體物質，而亮氨酸本身呈現苦味，它們或許是構成米酒中鮮味和苦味的原因之一。

在對米酒理化指標進行檢測的基礎上，采用純培養與高通量測序技術相結合的手段分別解析了大竹米酒中的乳酸菌與細菌類群，結果表明由Firmicutes和Proteobacteria構成了優勢菌門；Lactobacillus、Pediococcus和Weissella等乳酸菌類群構成了優勢菌屬；乳酸菌菌種分別由L.fermentum、Pediococcus pentosaceus、L.paracasei、L.plantarum和L.pseudomesenteroides構成。Kang等[29]的研究發現，乳酸菌在米酒發酵的整個過程中都占據主導地位，在發酵前期，它們能起到抑制腐敗菌的作用，這也為后期乙醇發酵提供了良好環境。值得注意的是，納入本研究的樣品中出現了Lactobacillus和Pediococcus含量分布不均一的現象。米酒曲作為米酒釀造的發酵劑，是米酒中微生物的主要來源，通常亦會含有部分Pediococcus[7]，因而米酒中菌群不均一的現象可能是由于曲中菌群不均一引起。此外，Weissella與后味A、澀味和苦味指標之間呈顯著負相關，這表明適當提高Weissella含量可能改善米酒中不適口的滋味品質。發酵食品中呈現的苦澀味大多與具有高含量疏水性氨基酸的苦味肽有關[32]，在發酵過程中這些苦味肽通常由微生物分解蛋白質產生。有研究表明Weissella具有高產胞外多糖的特性[33]，它們產生的胞外多糖在加熱或不同pH值條件下均能夠與大豆分離蛋白結合產生更加穩定的結構[34]，還能在酸面團的冷凍過程中降低面筋蛋白的解聚[35]。因而，米酒發酵在過程中，Weissella可能亦產生了胞外多糖并與原料中的蛋白質發生了結合反應，阻礙了其他微生物對蛋白的分解，從而減少了部分苦味肽的產生。

利用PCoA對大竹米酒與恩施米酒的菌群結構進行了比較分析，結果發現2 個地區米酒的細菌豐度和多樣性均存在顯著差異。使用LDA進一步分析，發現大竹和恩施地區米酒中共存在9 個差異菌群類別，生物標志物分別為Lactobacillus和Pediococcus。從不同地域采集的同類樣品其微生物類群存在顯著差異這一現象在眾多發酵食品中均有所體現，例如大曲[36]、泡菜[37]和奶酪[38]等。因而，后續在針對發酵食品菌群的研究中可進行多區域或是跨區域的樣品采集，亦可從發酵過程以及遺傳學上進行多方面的綜合研究。功能預測結果顯示兩地區米酒中菌群的基因功能表達較為相似，僅在少數幾個功能上有差異。經過發酵，糯米中的蛋白質和淀粉等物質逐漸被微生物分解利用，這也使得其細菌菌群在氨基酸和碳水化合物的運輸與代謝功能上的表達普遍較高[39]。綜上所述，大竹米酒咸味突出，富含多種有機酸和氨基酸，其細菌類群主要以乳酸菌為主，優勢菌群與滋味指標間存在一定的關聯性。