基于金@鉑納米酶的食品中過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙的研制

李博然，成璐瑤，曹智鴻，程 楠,2,*，羅云波,2,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

過(guò)氧化氫是一種重要的無(wú)機(jī)化工材料[1-2]。隨著我國(guó)食品級(jí)過(guò)氧化氫生產(chǎn)技術(shù)的提升，過(guò)氧化氫愈加廣泛的應(yīng)用在食品加工生產(chǎn)設(shè)備和包裝的消毒以及水發(fā)牛百葉、泡椒鳳爪等食品的漂白中[3-4]。自20世紀(jì)80年代起，國(guó)內(nèi)外就有諸多研究表明過(guò)氧化氫進(jìn)入到人體中會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和病變、加速人體的衰老，引發(fā)阿爾茲海默癥、癌癥等[5-8]，在國(guó)內(nèi)也有多起由食品中過(guò)氧化氫殘留引發(fā)中毒的報(bào)道[9-10]。在GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定過(guò)氧化氫作為食品加工助劑，應(yīng)在食品中盡量除去，在GB 5009.226—2016《食品中過(guò)氧化氫殘留量的測(cè)定》中，H2O2在食品中的含量被嚴(yán)格限制在3 mg/kg以下[11-13]。以化學(xué)分析法和儀器檢測(cè)法為代表的傳統(tǒng)過(guò)氧化氫檢測(cè)方法存在儀器體積大、耗時(shí)長(zhǎng)、需要專業(yè)人員操作等弊端，難以對(duì)食品樣品的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。試紙法因具有檢測(cè)快速靈敏、操作簡(jiǎn)便、便于攜帶、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域展示出了較好的應(yīng)用前景[14-16]。

目前，已廣泛報(bào)道的過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙均采用辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作為生物活性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，但是其作為一種蛋白質(zhì)存在穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)，易受溫度、pH值、無(wú)機(jī)離子等外界因素的影響變性失活，導(dǎo)致相應(yīng)過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙穩(wěn)定性差、貨架期短。近年來(lái)，納米材料模擬酶催化活性的研究發(fā)展迅速，引起了生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的廣泛研究興趣。與天然酶不同的是納米酶能夠避免生物酶易失活的弱點(diǎn)，已被廣泛證明能夠在水或緩沖溶液中表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和良好的催化性能，使其在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[17-18]。本研究分析幾種納米材料的類過(guò)氧化物酶活性，系統(tǒng)性優(yōu)化顯色劑成分與制備工藝，制備過(guò)氧化氫快速檢測(cè)試紙并驗(yàn)證其分析檢測(cè)性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡椒系列產(chǎn)品均購(gòu)自北京五道口佳美樂(lè)購(gòu)物超市。

四氯鉑（I I）酸鉀（K2P t C l4）、四氯金酸（H A u C l4）、抗壞血酸、聚乳酸納米粒子（PluronicF127）與葡萄糖 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；四氯鈀酸鈉（Na2PdCl4）、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB） 上海麥克林生化科技有限公司；二甲基亞砜 上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸、檸檬酸 北京化工廠；所用試劑均為分析純。

過(guò)氧化氫快速檢測(cè)試紙條 德國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YM-0405超聲波清洗機(jī) 深圳方奧微電子有限公司；Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；D3024離心機(jī)、MX-S混勻儀、HB120-S金屬浴 美國(guó)塞洛捷克公司；101-3BS電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市宏諾儀器有限公司；InPro3100 pH計(jì) 美國(guó)梅特勒-托利多公司；Tecnai G2 F30透射電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 納米酶顆粒的制備

1.3.1.1 鈀@鉑納米酶

取20 mg Pluronic F127超聲溶解于含有1.8 mL 20 mmol/L的K2PtCl4、0.2 mL 20 mmol/L的Na2PdCl4以及44 μL 6 mol/L的HCl的水溶液中。隨后加入2 mL 100 mmol/L的抗壞血酸超聲處理4 h至溶液均勻分散[19]。

1.3.1.2 金@鉑納米酶

取20 mg Pluronic F127超聲溶解于含有1.8 mL 20 mmol/L的K2PtCl4、0.2 mL 20 mmol/L的HAuCl4以及44 μL 6 mol/L的HCl水溶液中。隨后加入2 mL 100 mmol/L的抗壞血酸超聲處理4 h至溶液均勻分散。

1.3.1.3 金-鈀-鉑納米酶

取20 mg Pluronic F127超聲溶解于含有0.2 mL 20 mmol/L的HAuCl4、0.2 mL 20 mmol/L的Na2PdCl4、1.8 mL 20 mmol/L的 K2PtCl4以及44 μL 6 mol/L的HCl的水溶液中。隨后加入2 mL 100 mmol/L的抗壞血酸超聲處理4 h至溶液均勻分散。

1.3.2 納米酶的類過(guò)氧化物酶動(dòng)力學(xué)測(cè)試

部分納米材料具有類過(guò)氧化物酶活性，可以催化H2O2產(chǎn)生羥自由基將TMB氧化為氧化態(tài)TMB（oxTMB），其在652 nm波長(zhǎng)處有最大紫外吸收峰[20-21]。具有類過(guò)氧化物酶活性的納米材料的酶活動(dòng)力學(xué)遵循Michaelis-Menten方程：v＝vmax[S]/(Km＋[S])，其中，v表示反應(yīng)速率，[S]表示底物濃度，vmax表示反應(yīng)的最大速率；Km表示米氏常數(shù)。采用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法測(cè)試得到不同時(shí)間下反應(yīng)溶液在652 nm的吸光度，進(jìn)行非線性方程擬合，計(jì)算得到Km，以判斷納米酶與底物親和力的大小。Km值小，表示用很低的底物濃度即可達(dá)到最大反應(yīng)速度的一半，說(shuō)明酶與底物親和力大。

將1.3.1節(jié)中已制備好的3 種納米酶材料超聲1 h至均勻分散后進(jìn)行百倍稀釋。取10 μL百倍稀釋的納米酶溶液、32 μL 30%的H2O2和不同體積的20 mmol/L TMB的二甲基亞砜溶液溶于pH 4.6的醋酸緩沖液中，配制成200 μL反應(yīng)體系，使體系TMB濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mmol/L。檢測(cè)加入納米酶后，反應(yīng)體系在652 nm條件下吸光度在反應(yīng)前后60 s的變化。應(yīng)用GraphPad Prism 9.3.0軟件擬合米氏方程得到兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)米氏常數(shù)Km與反應(yīng)的最大速度vmax以分析納米酶的類過(guò)氧化物酶活性[22]。

1.3.3 納米酶的類過(guò)氧化物酶活性測(cè)試

納米酶的類過(guò)氧化物酶活性主要通過(guò)比色法分析。依據(jù)bnanozyme＝V/（ε×l）×（ΔA/Δt），ananozyme＝bnanozyme/[m]計(jì)算納米材料類過(guò)氧化物酶活性。一個(gè)b單位定義為在37 ℃每分鐘催化生成1 μmol產(chǎn)物的納米酶量；V為反應(yīng)溶液總體積（μL）；ε為反應(yīng)產(chǎn)物的摩爾吸收系數(shù)（39 000 L/（mol?cm））；L為光程，本實(shí)驗(yàn)中為0.622 cm；ΔA為吸光度變化值，ΔA/Δt為652 nm處吸光度的初始變化率（min-1），以計(jì)算納米酶活性ananozyme，[m]為換算的納米酶質(zhì)量（mg）。通過(guò)計(jì)算即可得到3 種納米酶活性ananozyme[22]。

將3 種納米酶材料超聲1 h以混勻。分別取3 種納米材料各1.5 mL，于15 000 r/min離心15 min，棄去上清液，干燥至呈干粉狀，稱量，測(cè)得3 種納米材料的質(zhì)量。

將32 μL 30%的H2O2、32 μL 20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液和不同體積的百倍稀釋納米酶溶液溶于pH 4.6的醋酸緩沖液中，配制成200 μL溶液，使納米材料體積分?jǐn)?shù)分別為0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%。檢測(cè)加入納米酶后反應(yīng)體系在652 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，每10 s測(cè)一次，共檢測(cè)400 s。

1.3.4 pH值對(duì)納米酶催化活性的影響

經(jīng)1.3.2節(jié)及1.3.3節(jié)兩步驟篩選出一種類過(guò)氧化物酶活性最佳的納米酶材料用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將32 μL 30%的H2O2、32 μL 20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液，16 μL百倍稀釋的催化效果最佳的納米酶溶液、溶于pH值分別為2.6、3.6、4.6、5.6、6.6、7.6、8.6、9.6的醋酸鹽緩沖液中，配制成200 μL溶液。檢測(cè)加入納米酶后反應(yīng)體系在652 nm的吸光度變化，pH值對(duì)催化效果最佳的納米酶材料活性的影響并篩選出最佳反應(yīng)pH值。

1.3.5 溫度對(duì)納米酶催化活性的影響

將32 μL 30%的H2O2、32 μL 20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液，16 μL百倍稀釋的催化效果最佳的納米酶溶液、溶于120 μL pH 4.6的醋酸-醋酸鹽緩沖液中，配制成200 μL溶液。檢測(cè)加入納米酶后反應(yīng)體系在4、25、35、45、55、65 ℃，652 nm條件下反應(yīng)60 s前后的吸光度的變化，溫度對(duì)催化效果最佳的納米酶材料活性的影響并篩選出最佳反應(yīng)溫度。

1.3.6 過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙的制備

首先，將納米酶材料、TMB溶液及醋酸-醋酸鹽緩沖溶液混合制成納米酶顯色溶液；其次，將Whatman No.1濾紙裁剪成10 cm×10 cm的小塊浸泡在裝有納米酶顯色液密閉培養(yǎng)皿中10 s后放入已預(yù)熱至50 ℃烘箱中恒溫烘干；最后，采用打孔器將烘干后的試紙打孔制成直徑為6 mm的活性試紙片，制成呈現(xiàn)均勻白色的過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙。

1.3.7 顯色液中TMB質(zhì)量濃度對(duì)顯色結(jié)果的影響

將25 μL催化效果最佳的納米酶材料與不同體積20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液溶于pH 4.6的醋酸緩沖液中，制成TMB質(zhì)量濃度分別為0、0.036、0.072、0.108、0.144、0.180、0.216 mg/mL的顯色液。采用

1.3.6節(jié)中方法制備過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙。使用不同TMB質(zhì)量濃度梯度的試紙片對(duì)10 μL 30%的H2O2標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)，以篩選出最佳的顯色液TMB質(zhì)量濃度。用智能手機(jī)拍攝得到試紙的顯色情況進(jìn)行定性分析，使用Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析，通過(guò)定性定量分析選出顯色液的最佳TMB質(zhì)量濃度[23-24]。

1.3.8 顯色液中納米酶質(zhì)量濃度對(duì)顯色結(jié)果的影響

將不同體積催化效果最佳的納米酶材料溶于60 μL 20 mmol/L的TMB溶液與pH 4.6的醋酸-醋酸鹽緩沖液的混合溶液中，制成催化效果最佳的納米酶質(zhì)量濃度分別為0、0.004 5、0.013 5、0.018 0、0.022 5、0.027 0、0.031 5 mg/mL的顯色液。采用1.3.6節(jié)中方法制備過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙。使用不同催化效果最佳的納米酶質(zhì)量濃度梯度的試紙片對(duì)10 μL 30%的H2O2標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)，以篩選出最佳的顯色液納米材料質(zhì)量濃度。用智能手機(jī)拍攝得到試紙的顯色情況進(jìn)行定性分析，使用Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析，通過(guò)定性定量分析選出顯色液的最佳納米酶質(zhì)量濃度。

1.3.9 試紙?jiān)陲@色液中浸泡時(shí)間對(duì)顯色結(jié)果的影響

以1.3.7節(jié)和1.3.8節(jié)兩步驟所得最佳條件制備納米酶顯色液，將Whatman No.1濾紙裁剪成10 cm×10 cm小塊紙片浸泡在裝有納米酶顯色液密閉培養(yǎng)皿中，分別浸泡10、20、30、40、50、60 s后放入已預(yù)熱至50 ℃烘箱中恒溫烘干；采用打孔器將烘干后的試紙打孔制成直徑為6 mm的活性試紙片，制成呈現(xiàn)均勻白色的過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙。使用不同顯色液浸泡時(shí)間的試紙片對(duì)10 μL 30%的H2O2標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)，用智能手機(jī)拍攝得到試紙的顯色情況進(jìn)行定性分析，使用Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析，通過(guò)定性定量分析選出顯色液的最佳TMB濃度。

1.3.10 試紙檢測(cè)時(shí)間對(duì)顯色結(jié)果的影響

以1.3.7～1.3.9節(jié)所得最佳條件制備過(guò)氧化快速檢測(cè)試紙片，使用10 μL 30%的H2O2標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，使用智能手機(jī)拍攝記錄試紙顯色情況隨檢測(cè)時(shí)間的變化，每30 s記錄一次，使用Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析，通過(guò)定性定量分析選出最佳的試紙檢測(cè)時(shí)間。

1.3.11 試紙檢測(cè)靈敏度的測(cè)試

以1.3.7～1.3.9節(jié)所得最佳條件制備過(guò)氧化快速檢測(cè)試紙片，配制濃度為0.1～10 mmol/L的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試試紙的靈敏度，同時(shí)建立一定過(guò)氧化氫濃度范圍內(nèi)過(guò)氧化氫濃度與試紙顯色后灰度值的定量關(guān)系。

1.3.12 試紙檢測(cè)特異性的測(cè)試

以1.3.7～1.3.9節(jié)所得最佳條件制備過(guò)氧化快速檢測(cè)試紙片，選取過(guò)氧化氫檢測(cè)中常見(jiàn)的幾種干擾物質(zhì)：檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖、山梨酸鉀、Zn2＋、Mn2＋，均配制成1 mol/L溶液進(jìn)行試紙的特異性測(cè)試，以1 mol/L過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，醋酸鹽緩沖液作為陰性對(duì)照觀察試紙的顏色變化，測(cè)試所制備試紙的特異性[25-27]。

1.3.13 試紙實(shí)際樣品的檢測(cè)

選取市面常見(jiàn)可能存在過(guò)氧化氫殘留的泡椒類食品：A品牌脆嫩筍尖（泡椒味）、B品牌山椒筍尖、C品牌脆筍（泡椒味）、D品牌脆泡豬皮、E品牌野山椒鳳爪、F品牌泡椒鳳爪、G品牌山椒味鳳爪進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。均稱取各樣品可食部位混合物5 g溶于50 mL水中制成實(shí)際樣品提取液，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.14 試紙陰性樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

將過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液加到過(guò)氧化氫檢測(cè)結(jié)果陰性的實(shí)際樣品液中，配制成濃度分別等同于0.05、0.1、0.2 mmol/L的加標(biāo)樣品液。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)試其過(guò)氧化氫殘留量。用智能手機(jī)拍攝得到試紙的顯色情況進(jìn)行定性分析，使用Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析，與建立的過(guò)氧化氫濃度——試紙顏色（灰度值）定量數(shù)學(xué)模型進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米酶的制備與表征

制備鈀@鉑納米酶、金@鉑納米酶、金-鈀-鉑納米酶3 種納米酶，通過(guò)電子顯微鏡觀察其形貌（圖1）。鈀@鉑納米酶平均直徑約為30 nm，金@鉑納米酶平均直徑約為20 nm，金-鈀-鉑納米酶平均直徑約為35 nm。3 種納米酶形態(tài)均具有高度枝狀和介孔性質(zhì)，均勻分布在納米晶表面形成了特殊的分散結(jié)構(gòu)。

圖1 納米酶的電子顯微鏡圖像Fig.1 Transmission electron microscopic images of nanozymes

2.2 納米酶類酶動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

測(cè)試鈀@鉑納米酶、金@鉑納米酶、金-鈀-鉑納米酶3 種納米酶的類酶動(dòng)力學(xué)，擬合得到3 種納米酶的米氏常數(shù)曲線，綜合比較3 種納米材料的動(dòng)力學(xué)常數(shù)可以得出，相同測(cè)試條件下鈀@鉑納米酶與金@鉑納米酶的Km相近，高于金-鈀-鉑納米酶，且金@鉑納米酶的vmax最大。表明鈀@鉑納米酶與金@鉑納米酶類過(guò)氧化物酶活性較優(yōu)（圖2）。

圖2 納米酶米氏方程擬合結(jié)果Fig.2 Michaelis-Menten plots of nanozymes

2.3 納米酶類過(guò)氧化物酶活性測(cè)試

通過(guò)測(cè)定3 種納米材料類酶活性可以得出，金@鉑納米酶活性為27.538 U/mg，鈀@鉑納米酶和金-鈀-鉑納米酶活性分別為4.233 U/mg和3.955 U/mg（圖3C），金@鉑納米酶活性最強(qiáng)。綜合米氏方程擬合結(jié)果選擇出活性最優(yōu)的納米酶，即金@鉑納米酶用于后續(xù)過(guò)氧化氫快速檢測(cè)試紙的制備。

圖3 納米酶類酶活性Fig.3 Catalytic activity of nanozymes

2.4 反應(yīng)溫度及pH值對(duì)納米酶催化活性的影響

如圖4所示，溫度對(duì)納米酶的活性影響較小，在所測(cè)溫度范圍內(nèi)，納米酶始終保持著較優(yōu)的活性，均在60%～100%相對(duì)活性范圍內(nèi)波動(dòng)，且在30～50 ℃間有最大催化活性，因此得出37 ℃為反應(yīng)最適溫度（圖4A）。相較于溫度對(duì)納米酶催化活性的影響，pH值對(duì)納米酶催化活性的影響更加顯著，當(dāng)pH 4.6時(shí)，金@鉑納米酶有最大的催化活性，當(dāng)pH值高于6.6時(shí)，酶幾乎失去催化活性，因此得出pH 4.6為反應(yīng)最適pH值（圖4B）。

圖4 環(huán)境因素對(duì)納米酶催化活性的影響Fig.4 Effects of environmental factors on catalytic activity of nanozymes

2.5 顯色液成分優(yōu)化

隨著TMB添加量的加大，顯色效果更加明顯，利于肉眼觀察，但是高質(zhì)量濃度TMB的試紙很容易被空氣氧化變色而使試紙失去其使用效果（圖5A）。綜合考慮，TMB在顯色液中的最佳質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL。此質(zhì)量濃度制成的試紙為均勻的白色，且響應(yīng)迅速，梯度明顯。

圖5 顯色液組分對(duì)試紙顯色結(jié)果的影響Fig.5 Effect of TMB and nanozyme concentrations on results of color development

隨著金@鉑納米酶添加量的加大，在較低濃度條件下，試紙的顯色程度會(huì)更加明顯，但是當(dāng)金@鉑納米酶大于0.018 mg/mL后，增加金@鉑納米酶濃度對(duì)試紙的顯色程度幾乎無(wú)影響，金@鉑納米酶此時(shí)濃度已經(jīng)達(dá)到飽和（圖5B）。綜合考慮，金@鉑納米酶在顯色液中的最佳質(zhì)量濃度為0.018 mg/mL。

2.6 試紙工藝優(yōu)化

試紙?jiān)陲@色液中浸泡時(shí)間超過(guò)10 s后，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，試紙顯色程度無(wú)明顯變化，無(wú)需再延長(zhǎng)浸泡時(shí)間；當(dāng)浸泡時(shí)間小于10 s時(shí)，肉眼觀察到試紙未浸透（圖6A）。因此，選擇10 s為試紙?jiān)陲@色液中的最佳浸泡時(shí)間。

圖6 試紙工藝優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Results of optimization of soaking and reaction time of test strip

隨著過(guò)氧化氫與試紙反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在3 min內(nèi)，試紙顯色效果逐漸明顯。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)3 min后，顯色深淺程度在一段時(shí)間內(nèi)幾乎不變，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)8 min后顯色效果隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，確定3 min為試紙與過(guò)氧化氫反應(yīng)的最快穩(wěn)定時(shí)間（圖6B）。后續(xù)檢測(cè)中選擇3 min為試紙與過(guò)氧化氫的反應(yīng)時(shí)間。

2.7 試紙性能測(cè)試

2.7.1 靈敏度測(cè)試

當(dāng)過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液濃度大于或等于0.01 mmol/L，即0.34 mg/kg時(shí)，肉眼可以很容易辨別試紙呈現(xiàn)的藍(lán)色。因此，最終確定試紙的靈敏度為0.01 mmol/L（圖7）。當(dāng)過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.05～0.5 mmol/L時(shí)，試紙顯色灰度值與過(guò)氧化氫濃度有較好的線性關(guān)系（R2＝0.993 1），擬合得到過(guò)氧化氫濃度——試紙顏色（灰度值）定量數(shù)學(xué)模型：y＝17 735x＋3 028.4，可用來(lái)進(jìn)行過(guò)氧化氫的定量檢測(cè)，過(guò)氧化氫快速檢測(cè)試紙的比色卡見(jiàn)圖8。

圖7 試紙靈敏度測(cè)試Fig.7 Sensitivity of test strip

2.7.2 特異性測(cè)試結(jié)果

檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖、山梨酸鉀、Zn2＋對(duì)試紙均無(wú)陽(yáng)性響應(yīng)，而Mn2＋則會(huì)使試紙呈現(xiàn)灰色（表1）。

表1 試紙?zhí)禺愋詼y(cè)試結(jié)果Table 1 Specificity of test strip

2.8 試紙性能測(cè)試結(jié)果

7 種樣品檢驗(yàn)時(shí)與空白對(duì)照均無(wú)差異（表2），均未檢出過(guò)氧化氫，對(duì)樣品進(jìn)行陰性加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，回收率為93.10%～108.63%（表3）。

表2 實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果Table 2 Results of test strips for actual samples

表3 泡椒鳳爪實(shí)際樣品陰性加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 3 Recoveries of spiked negative chicken feet with pickled pepper

3 討 論

目前對(duì)于過(guò)氧化氫的檢測(cè)方法主要包括滴定分析法、比色分析法、化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)分析法等[28-31]。常見(jiàn)的滴定分析法包括碘量法和高錳酸鉀滴定法，其作為一種廣泛應(yīng)用的經(jīng)典方法具有較為精確快捷等優(yōu)點(diǎn)，碘量法是現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的食品中過(guò)氧化氫殘留量的測(cè)定方法，但滴定分析法受操作人員及環(huán)境影響較大且操作繁瑣[28-29]。傳統(tǒng)的比色法如鈦鹽比色法同樣是國(guó)標(biāo)中規(guī)定的食品中過(guò)氧化氫殘留量的測(cè)定方法，其檢測(cè)精確，不易受鈣鐵離子及其他過(guò)氧化物的影響，但需要濃硫酸以提供強(qiáng)酸性環(huán)境、耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)、濃硫酸的使用會(huì)干擾某些體系的檢測(cè)以及需要依靠分光光度計(jì)檢測(cè)等弊端[28-29]。化學(xué)發(fā)光法本身的分析選擇性較差，不適用于分析復(fù)雜樣品和同時(shí)檢測(cè)多種待測(cè)物，從而局限了其應(yīng)用范圍，常與毛細(xì)管電泳、高效液相色譜等聯(lián)用以滿足實(shí)際檢測(cè)需要，儀器昂貴且操作也較為復(fù)雜[30-31]。相較于以上方法，試紙法具有靈敏、快速、便攜、樣品用量小且能夠短時(shí)間批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，本研究中的金@鉑納米酶過(guò)氧化氫殘留快速檢測(cè)試紙?zhí)娲藗鹘y(tǒng)HRP作為生物活性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)溫度、pH值等外界因素影響的抗性提高，是一種穩(wěn)定性更好的新型檢測(cè)技術(shù)，適用于實(shí)驗(yàn)室的初篩及現(xiàn)場(chǎng)大樣本測(cè)定監(jiān)督，但多用于半定量和定性檢測(cè)，檢測(cè)精確度仍待提高。

4 結(jié) 論

本研究制備的試紙?jiān)诰哂蓄愡^(guò)氧化物酶活性的金@鉑納米材料作用下，檢測(cè)過(guò)氧化氫時(shí)能夠?qū)o(wú)色物質(zhì)TMB氧化成為藍(lán)色物質(zhì)oxTMB，從而實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫的比色法檢測(cè)。基于上述原理，本研究建立了一種以金@鉑納米材料類過(guò)氧化物酶活性為基礎(chǔ)的可視化半定量過(guò)氧化氫快速檢測(cè)試紙，該試紙可以在3 min內(nèi)對(duì)樣品中過(guò)氧化氫殘留量進(jìn)行快速檢測(cè)，檢出限為0.34 mg/kg。通過(guò)在泡椒雞爪中加入不同濃度的過(guò)氧化氫測(cè)定其回收率，結(jié)果表明該試紙準(zhǔn)確性高、檢測(cè)速度快、無(wú)需復(fù)雜的樣品處理，具有應(yīng)用于食品殘留過(guò)氧化氫快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的潛力。