錫林郭勒鮮牛乳中乳酸菌分離鑒定及微生物多樣性分析

孫 潔，蘇 茜，杜 萍，夏亞男，趙 潔，于 潔，陳永福*

（內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古自治區乳品生物技術與工程重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

生鮮乳作為原料乳進一步加工成發酵乳或奶酪等產品[1]，通過微生物多樣性分析，可以知曉生牛乳中腐敗菌以及致病菌的種類，為后期乳制品的殺菌[2]及加工提供安全性的預判。另一方面，通過微生物多樣性分析，還能夠知曉生牛乳中有益菌的菌種，這些有益菌直接與發酵乳制品風味和有益功能代謝物的形成有關，這能為后期有益菌種的篩選以及發酵乳制品的發酵劑開發提供引導。除鮮牛乳的市場價值外，有研究從新鮮生牛乳中分離篩選具有不同特性的菌株，還有研究表明不同地區、不同季節牛奶中的微生物分布不同，菌群多樣性存在差異[3]。可見，研究和表征鮮牛乳的具體微生物對益生乳酸菌篩選及乳制品精深加工具有明顯的指導意義。

我國少數民族利用黃牛擠奶作為直接食物來源，至今已有5 000多年的歷史[4]。研究這些牛奶中的微生物種類、功能和特性也是一項十分必要的工作。傳統微生物多樣性多依賴于培養的方法進行評估，通過使用不同的選擇性培養基可以實現對樣品中目標微生物的分離和鑒定，從而確定樣品中可培養微生物的主要類群，同時也為后續篩選優良發酵菌株奠定基礎[5]。然而，基于純培養的方法僅能獲得樣品中可培養微生物的信息，不能全面反映樣品中微生物的組成[6]。

為了更全面準確評估乳制品的微生物多樣性，各類分子生物學技術被廣泛使用，如變性梯度凝膠電泳、時間溫度凝膠電泳、實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和16S rRNA基因克隆文庫的桑格測序。這些技術是監測乳制品中微生物結構和動態的有價值的工具，能夠在屬水平且揭示樣本的物種組成、結構及多樣性。如李引強等[7]利用PCR-克隆-測序的方法獲得牛奶中菌群的16S rRNA V3區序列信息，實時PCR法測定樣品中的細菌總數，發現牛奶中的細菌分為3 個革蘭氏陽性菌屬和14 個革蘭氏陰性菌屬且優勢菌是不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單孢菌屬（Pseudomonas）；Tatsuro[8]和Lafarge[9]等用同樣方法得出乳桿菌屬（Lactobacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）是牛奶中的優勢菌屬；而Delbes等[10]使用雙培養依賴性和直接分子方法結合單鏈構象多態性指紋和16S rRNA基因測序，研究了牛乳中細菌種群的多樣性和動態，結果與此不盡相同，表明牛奶中的優勢菌屬是梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）和Lactobacillus。但是以上結果受測序片段讀長的限制，僅能在屬水平挖掘樣品中微生物的群落結構組成，無法充分揭示牛乳中微生物在種水平和功能方面的特征[5]。因此，為了全面探究傳統乳制品中微生物多樣性，宏基因組學已經逐漸進入人們的視野，該組學是通過提取樣品中全部微生物的DNA進行測序，不僅可以在宿主相關群體中快速、準確地完成微生物在種水平的多樣性分析而，且可以完成微生物在種水平的功能組成分析。

本研究選擇位于內蒙古錫林郭勒西北部和東北部的蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗為采樣地點，分別采集當地牧民日常食用的新鮮牛乳。采用傳統分離鑒定和宏基因組學相結合的方法，對錫林郭勒盟鮮奶中微生物多樣性進行研究。并選擇宏基因組常見的HUMAnN2分析流程，采用分層式檢索策略和比對泛基因組的方法鑒定群體的已知物種，通過翻譯檢索未分類的序列，快速、準確定量基因家族和代謝通路，以期在豐富菌種資源庫、擴充少數民族微生態數據庫的同時，為生鮮牛乳的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶于2021年，采自內蒙古自治區錫林郭勒盟蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗（相距319.14 km），各采集3 份。樣品采集后迅速封存于液氮罐中，后轉移至實驗室-80 ℃冷凍保存。具體樣品信息如表1所示。

表1 錫林郭勒盟鮮奶采集地及活菌數Table 1 Sampling locations and viable LAB counts of fresh cow milk from Xilin Gol

MRS固體培養基、M17固體培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；蛋白酶K、TaqDNA聚合酶北京全式金生物技術有限公司；TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHJH-1214B垂直流超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；BX50光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；9902 PCR熱循環儀、DYY-60電泳儀 北京市六一儀器廠；CDS8000凝膠成像分析系統 美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及乳酸菌計數

樣品采集后，吸取1.5 mL至加有滅菌中和劑（淀粉與CaCO3質量比為50∶1）的無菌采樣瓶中，記錄采集時間和地點[11]。然后于37 ℃恒溫條件下，利用傾注法，選擇MRS和LB培養基，10-5、10-6、10-7梯度記錄活菌數。

1.3.2 宏基因測序分析

將添加保護劑的樣品送去天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序。具體分為3 步：1）質量控制，使用Qubit?dsDNA試劑盒測量DNA濃度，當OD值在1.8～2.0之間，DNA含量大于1 μg時便可用于構建文庫。2）文庫構建，每個樣品的總DNA量為1 μg[11-12]，用作DNA樣品制備的輸入材料[13]。使用NEBNext?Ultra生成測序文庫TMIllumina的DNA文庫制備試劑盒，按照制造商的建議和索引代碼添加到每個樣品的屬性序列中。簡言之，通過超聲將DNA樣品片段化至350 bp大小，然后將DNA片段進行末端拋光、a尾連接，并與全長接頭連接，以進行Illumina測序，并進一步PCR擴增。最后，用Agilent 2100生物分析儀純化PCR產物（AmpreXP系統），分析文庫的大小分布，并使用實時PCR進行定量。3）聚類排序，然后用Illumina Novaseq 6000對文庫制備物進行測序。

測序后的序列用Xshell軟件在Linux操作系統內進行質量控制和去宿主，將質控后的序列提取后，通過MetaPhlAn2、HMAnN2和ChocoPhlAn泛基因組數據庫進行物種注釋和功能注釋，并分別得到每個樣品中的物種和代謝通路的相對豐度。

1.3.3 乳酸菌的分離純化

根據計數梯度，對鮮奶樣品進行稀釋涂布，并挑選不同形態的菌落，平板劃線，劃線完成的平板倒放在37 ℃厭氧條件下培養2～3 d。注意，若無單個菌落要挑菌重新劃線，培養。純化3 代后挑取適量的菌體進行涂片及革蘭氏染色[5]。

1.3.4 菌株鑒定

收集二代菌株的純培養物于1.5 mL無菌EP管中，用TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株16S DNA。用微量紫外分光光度計檢測DNA純度[11]，符合純度要求的純化DNA OD260nm/OD280nm為1.6～1.8，用瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA提取液質量。DNA擴增采用的引物為27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-ACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR擴增使用50 μL體系：正、反向引物各1.5 μL、模板DNA 2 μL、10×PCR Buffer（含Mg2＋離子）5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL[11]、ddH2O 35.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環，72 ℃末端延伸10 min。擴增完畢后，用瓊脂糖凝膠電泳儀進行檢測。在低溫（-20 ℃）條件下送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行純化和雙端測序[14]。

1.3.5 同源性分析

利用NCBI BLAST網站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）找到與待鑒定菌株同源性最高的模式菌株并下載，或者利用LPSN網站（https://www.bacterio.net/）下載模式株序列。采用Neighbor-Join和BioNJ算法自動獲得啟發式搜索的初始樹，并選擇對數似然值優越的拓撲，使用MEGA11軟件構建系統發育樹。

1.3.6 菌株保藏

活化后的菌懸液離心去上清液，沉淀的菌體中加入生理鹽水復懸、離心、去上清液以清洗菌體。收集的菌體加入已滅菌的細菌細胞保護液混勻，分裝于安瓿管中，真空冷凍干燥后封玻璃口[15]，于0～4 ℃保存。

1.4 數據處理

使用R語言結合在線網站進行統計學分析和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 鮮奶中微生物群落結構和功能解析

2.1.1 鮮奶中微生物組成及差異分析

使用Illumina Novaseq6000平臺對文庫制備物進行測序，6 份鮮奶樣的宏基因組下機數據量，分別是6.7、4.7、5.3、4.8、7.6 G和5.1 G，采用分層式檢索策略，去除奶牛宿主后，實際數據量分別是6.2、4.5、5.1、4.2、7.0 G和5.0 G。使用生科云（https://www.bioincloud.tech/）軟件，對鮮奶中微生物結構與組成進行解析。

通過Shannon指數（圖1A）和Simpson指數（圖1B）評估樣本中微生物的多樣性和豐富度，指數越大，多樣性越高。基于Bray-Curtis距離（圖1C）和歐氏距離（圖1D），并選取貢獻率最大的主坐標組合進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），經Wilcoxon test配對檢驗發現兩地鮮奶樣品的差異并不顯著（P＞0.05）。可見，蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗的鮮奶樣，物種豐富度沒有顯著差異，物種組成和結構也未明顯分開，再經正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）（圖1E）可以看出較明顯的差異，表明兩地鮮奶中存在各自的特有物種。

圖1 鮮奶樣品中微生物結構多樣性分析Fig.1 Analysis of microbial diversity in fresh milk samples

蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗的6 個鮮奶樣，共鑒定到8 個細菌門、99 個屬、165 個種，優勢菌種隸屬于厚壁菌門（Firmicutes，52.26%）、乳球菌屬（Lactococcus，33.11%）的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，33.02%），其次為腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，9.40%）（圖2）。

圖2 鮮奶在門（A）、屬（B）和種（C）水平的微生物組成Fig.2 Microbial community composition in fresh milk at phylum (A),genus (B) and species (C) levels

兩地共有物種64 種，占總物種豐度的43.74%，特有物種各50 種，Venn圖揭示了微生物在兩個棲息地之間的重疊和劃分，近60.98%的物種被確定為唯一的物種，即僅在一個地區中檢測到。共有微生物L.lactis、L.mesenteroides、乳球菌噬菌體ul36（Lactococcusphage ul36）和約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）等占主導優勢。盡管兩地獨特的物種占總物種比例很大，但它們的相對豐度非常有限，這表明它們在微生物群落中處于不利地位，蘇尼特左旗的特有優勢物種為乳球菌噬菌體BM13（LactococcusphageBM13）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）等，東烏珠穆沁旗的優勢物種為腸桿菌亞種MGH8（Enterobactersp.MGH8）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）等。（圖3）。

圖3 兩地鮮奶共有和差異物種Fig.3 Shared and differential bacterial species between fresh milk from two regions

2.1.2 牛奶中微生物多樣性及功能分析

如圖4所示，使用HUMAnN（V2.0）軟件對鮮奶中微生物的功能進行解析，Uniprot數據庫注釋到1 408 048 個基因，然后將同源性大于50%的非冗余序列信息聚集在一起，得到412 條代謝通路。氨基酸合成和降解代謝功能豐度最高，其次為糖酸轉化和氧化反應。硝酸鹽反應、碳氮循環、嘧啶回收、糖酵解和呼吸作用也是較為豐富的代謝通路。與微生物組成相似，蘇尼特左旗的一個樣品（AM21）與東烏珠穆沁旗的一個樣品（AM60）代謝通路豐度基本一致，即6-羥基甲基二氫二磷酸生物合成豐度最高，丙酮酸發酵生成乙酸和乳酸II次之，而剩余4 個樣品其他代謝通路較多，組成更為豐富。另外，在排名前20的代謝通路中，除了AM60樣品不含L-精氨酸生物合成I（通過L-鳥氨酸）外，所有樣品代謝通路種類一致。而S-腺苷蛋氨酸-L-甲硫氨酸循環代謝途徑在除AM60樣品以外的其他樣品中含量較少。

圖4 代謝通路的豐度柱形圖（相對豐度前20）Fig.4 Top 20 metabolic pathways with the highest relative abundance

2.2 乳酸菌分離鑒定結果分析

2.2.1 乳酸菌分離純化結果

根據宏基因解析結果決定對細菌菌株進行分離鑒定，然后對乳酸菌進行入庫保藏。獲得顏色為白或淡黃，表面呈粗糙或光滑，形態為圓形或橢圓形的菌株55 份（圖5A）。經革蘭氏染色檢驗（圖5B），為紫色球形、鏈球、長桿、短桿等。再經過PCR，得到如圖5C的擴增條帶。

圖5 分離菌株在培養基形態（A）、革蘭氏染色熒光顯微鏡圖（B）及16S rRNA基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖（C）Fig.5 Morphology of isolates on culture medium (A), fluorescence micrograph of Gram-stained cells (B) and agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16S rRNA genes (C)

2.2.2 菌株鑒定結果

將6 份鮮奶樣中分離菌株的16S rRNA基因序列與NCBI數據庫中已有菌株的16S rRNA序列進行同源性比對后，共得到47 株菌，如圖6A所示，其中66%為L.lactis，9%為耐久腸球菌（E.durans），5%為L.mesenteroides、4%為假腸膜明串珠菌（L.pseudomesenteroides），2%為開菲爾乳桿菌（L.kefiri）。此外還鑒定出7 株非乳酸菌。用MEGA11構建系統發育樹，同源性分析結果與菌株分離鑒定結果基本一致，如圖6B所示，有35 株菌的16S rRNA基因序列與L.lactis模式株序列同源性為100%，被鑒定為L.lactis，同理鑒定到3 株E.durans，1 株L.kefiri，1 株蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis），同源性均為1 0 0%。鑒定到L.m e s e n t e r o i d e s和L.pseudomesenteroides各2 株，解鳥氨酸拉烏爾菌（R.ornithinolytica）、格里蒙克雷伯菌（K.grimontii）、產酸克雷伯菌（K.o x y t o c a）、巴氏克雷伯氏菌（K.pasteurii）各1 株，同源性均大于98%（圖6B）。

圖6 錫林郭勒盟鮮奶中菌株分離鑒定結果（A）及16S rRNA基因序列的系統發育樹（B）Fig.6 Identification (A) and phylogenetic tree (B) based on 16S rRNA gene sequences of LAB isolates from fresh milk from Xilin Gol (B)

3 討 論

通過傳統分離鑒定的方法結合宏基因組策略，解析了內蒙古錫林郭勒蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗物種組成。在門水平上，發現Firmicutes和變形菌門（Proteobacteri）為優勢菌門，Firmicutes含量遠高于擬桿菌門（Bacteroidetes），與Shinozuka等[16]的研究結果一致，長期服用可緩解腹瀉、肥胖，促進當居民形成健康的腸道菌群。屬水平上，Lactococcus作為牛乳中的優勢菌屬，產酸凝乳，并產生良好的芳香氣味，不僅在許多發酵食品的生產中用作發酵劑和輔助培養物，還發揮著重要的保護作用，抑制或減少牛奶中病原體微生物，可以在很大程度上提高牛奶的質量[17]。同時，鮮牛乳中還有Acinetobacter和Klebsiella等條件治病菌屬檢出，與Joubrane等[18]的研究結果一致。盡管在宏基因測序時去除了奶牛宿主的污染，這種經典的牛奶取樣方法可能還是會受到暴露于環境中的乳頭皮膚和乳頭尖端附近區域細菌的影響。但是，也不能排除牛奶中本身就含有這兩種菌的可能。種水平上，傳統分離鑒定方法得到優勢菌種為L.lactis、E.durans、L.mesenteroides、L.pseudomesenteroides和L.kefiri，宏基因二代測序也可以得到同樣的結果，由于培養基和培養條件的限制，宏基因測序方法還檢測到一些傳統分離方法未培養到的菌種，如溶酪大球菌（Macrococcus caselyticus）[18]，這是大球菌屬中研究最多的一類，與發酵食品香氣和風味的形成有關，因此被用作發酵的發酵劑，但是，在發酵中使用這些微生物時，必須考慮到食品安全的一些重要問題。這些菌種在豐富鮮奶口味的同時，為改善人體健康做出巨大貢獻。

分離鑒定到的乳酸菌均已保藏，用來擴充內蒙古少數民族聚集地乳酸菌數據庫。同時本研究還探討了錫林郭勒的兩個旗縣，蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗的微生物之間的差異性，發現兩地大量物種為共有物種，與Liu Wenjun[19]、呂瑞瑞[20]等研究結果一致。但也均存在特異物種，蘇尼特左旗的優勢物種為Lactococcusphage BM13，作為專門寄生于乳酸菌細胞內的細菌病毒，通常認為感染宿主細菌后會使發酵劑菌株細胞裂解，甚至引起發酵失敗，造成經濟損失；也有研究表明，噬菌體感染后，乳酸菌細胞破裂會釋放出胞內的酯酶、肽酶等，對奶制品的成熟具有重要作用[21]。東烏珠穆沁旗的優勢物種為Enterobactersp.MGH8，該細菌在自然界普遍存在，分布于空氣、水、土壤、人體、動物、植物中。可存在于人體，引起肺炎、膿毒癥、菌血癥等疾病，是人體的條件致病菌；可存在于昆蟲體內，侵染并殺死昆蟲；還可侵染植物，引起楊樹潰瘍病、梨火疫病、榆樹濕心病等。此外，還可作為生物農藥、固氮微生物等，對植物代謝、植物生長、有害生物防治等起著積極作用[22]。這些物種的鑒別可以為乳制品安全性評價提供有力依據，也對牛乳的商業價值與地理區域之間的關系提供了有趣的見解[23]。

通過宏基因功能分析發現，蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗的鮮奶樣品代謝通路種類基本一致，含量卻相差較大，因此功能也不盡相同。推測兩地微生物可能有著共同的祖先，但隨著時間的推移和生物的進化，兩地奶牛可能產生了不同的生活方式，飲食結構也隨之發生了改變[22]。檢測到的代謝通路主要用于乳酸酯類、乳酸醇類和乳蛋白的合成，因為乳中約有90%的蛋白質是在乳腺中由乳腺從血液中攝取游離的氨基酸及小分子寡肽合成[24]。丙酮酸發酵生成乙酸和乳酸途徑豐度較高是因為牛乳中抗氧化作用極強的丙酮酸含量較高，且丙酮酸有助于乳酸乳球菌細胞的防御系統，獲得更高的生物量，促進Nisin產生[18]。而乳酸菌存在的生理活性與細胞壁中的肽聚糖有關[25]，乳酸菌肽聚糖水解溶液具有低黏度、低pH值的性質，可能使得溶液pH值下降；具有抗氧化功能，肽聚糖水解后的抗氧化能力與谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸等顯著相關[26]。錫林郭勒鮮奶中肽聚糖成熟代謝功能占主導地位，因此，本研究可為此類有益菌的篩選提供依據。同時，研究也發現蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗的鮮奶中各類氨基酸生物合成代謝途徑豐度較高，如L-蘇氨酸，作為一種必需氨基酸被廣泛用于食品、飼料、醫藥及化妝品行業，是各類氨基酸保健飲品的配方成分，也是重要的食品強化劑；甘氨酸[27-29]和絲氨酸[30-33]則用于治療各種臨床疾病。

4 結 論

基于宏基因組測序分析，蘇尼特左旗和東烏珠穆沁旗6 份鮮奶樣品共鑒定出微生物菌種165 個，優勢菌種為L.lactis和L.mesenteroides。兩地鮮奶中共有微生物物種較多，致使α、β多樣性無明顯差異，但兩組鮮奶中仍存在明顯差異物種。蘇尼特左旗以Lactococcusphage BM13為主，東烏珠穆沁旗以Enterobactersp.MGH8為主。經Uniprot數據庫注釋，鮮奶功能集中在氨基酸代謝與糖酸代謝。同時，從6 份鮮奶樣品共分離出47 株菌，乳酸乳球菌為優勢菌種，占總分離株的65.96%，與宏基因組結果一致。該研究解析了錫林郭勒少數民族聚集地鮮乳中的微生物多樣性，可為發酵乳制品的安全生產及優質乳酸菌資源庫的建立提供積極引導。