本土季也蒙畢赤酵母在干紅葡萄酒中試生產中的應用潛力

藏 偉，劉 葉，劉 宇，彭 帥，陳學蓮，王 婧,*

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅紫軒酒業有限公司，甘肅 嘉峪關 735100）

酵母菌對葡萄酒品質和風格起著重要作用。由于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）酒精轉化率高、發酵完全等優點，在葡萄酒行業中被開發成活性干粉制劑廣泛使用[1]。然而，在葡萄酒釀造中，用單一商業S.cerevisiae菌劑進行發酵，雖可確保酒精發酵（alcoholic fermentation，AF）的順利進行和完成，但會導致發酵過程中酵母菌群多樣性下降，酵母代謝產生的化學反應復雜度降低，使葡萄酒質量風味趨近，產品風格特色不突出[2]。近幾年，大量的研究已經證實，在葡萄酒AF前期，一些非S.cerevisiae的菌種參與發酵會增加葡萄酒感官特征的復雜性[3-4]。畢赤酵母（Pichia）是葡萄酒自然發酵過程中普遍存在的酵母菌種，也是重要的產酯酵母之一，對葡萄酒香氣成分的多樣性做出了重要貢獻[5-6]。

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）由于其獨特的代謝活動，在各種代謝產物的合成、功能蛋白的生產和生物防治方面表現出了巨大潛力[7-9]；M.guilliermondii與一些化學物質結合可以提高對霉菌的抑制作用[10]；此外，Benito等[11]的研究發現，M.guilliermondii發酵能夠增加吡喃花色苷類物質的形成，這些物質具有增強干紅葡萄酒顏色穩定性的作用。也有研究表明，M.guilliermondii能分泌多種胞外水解酶，如菊粉酶、α-淀粉酶、α-鼠李糖苷酶和脂肪酶[7]；Aplin等[12]通過順序接種M.guilliermondii（P40D002）可降低葡萄酒的乙醇含量，并產生高濃度的乙酸乙酯等香氣物質。Yan Wei等[13]也報道了M.guilliermondii能夠產生高濃度2-苯乙醇，對增強玫瑰香氣具有積極影響。本實驗室前期工作中優選出1 株高產β-葡萄糖苷酶的M.guilliermondii菌株NM218，該酶的產生與菌株細胞生長同步進行，通過釀酒學特性研究也證實該菌株具有較高的葡萄酒環境耐受性和低酸條件下的高酶活力性質[14]，與S.cerevisiae順序接種發酵，可以增加酯類和萜烯類等揮發性物質，增強葡萄酒香氣的復雜性[15]，在霞多麗干白葡萄酒陳釀過程中添加M.guilliermondii的β-葡萄糖苷酶制劑可增加萜烯類、C13-降異戊二烯類、高級醇類、酯類、脂肪酸類物質，豐富了葡萄酒的香氣復雜性[16]。

目前關于非S.cerevisiae與S.cerevisiae混菌發酵的研究大部分是在實驗室微釀條件下的結果，中試規模下的應用研究鮮有報道，而中試實驗是將實驗室成果與產業化應用連接的重要橋梁。因此，本研究目的是將NM218與商業S.cerevisiae以順序接種的模式進行中試發酵，并對發酵過程中酵母生長狀況、葡萄酒釀酒學特性和感官特征進行分析，以期明晰M.guilliermondii的應用潛力，為M.guilliermondii的工業化應用提供一定數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌劑與原料

菌株NM218由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室篩選于自然發酵的葡萄醪中，并經過26S rDNA D1/D2測序，確定其為M.guilliermondii（序列相似度99.51%），現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC NO：23155）；菌株NM218活性干粉菌劑由本實驗室參考張馨文等[17]的方法經過高密度培養，添加復合凍干保護劑等方法制備于冰箱冷藏備用。商業S.cerevisiae活性干粉制劑FX10、商業乳酸菌活性干粉制劑（Oenococcus oeni）Lactoenos 450 Preac購自法國Laffort公司。

2021年10月采摘于寧夏博納伯馥酒莊的赤霞珠（Cabrnet Sauvignon），糖質量濃度250 g/L（以還原糖計），可滴定酸6.45 g/L（以酒石酸計），pH 3.89。

1.1.2 培養基與試劑

WL（Wallerstein Laboratory）營養瓊脂培養基北京奧博星生物技術有限公司。

氯化鈉（分析純，99%）、無水乙醇（分析純） 天津市光復科技有限公司；果膠酶（食品級） 法國Laffort公司；2-辛醇（色譜純，99%）等標準品 Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1080紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；WINESCAN S20 FLEX多功能葡萄酒分析儀 福斯華（北京）科貿有限公司；H2050R高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵中試實驗

赤霞珠葡萄果實在分揀臺人工摘除爛果及二次果等，送入除梗破碎機除梗破碎后按70%的量輸入2 t不銹鋼控溫罐，加入40 mg/L果膠酶，分次加入SO2至質量濃度達到50 mg/L，打循環至均勻后在低溫（10 ℃）下浸漬24 h，隨后恢復室溫后進行酵母接種發酵，實驗如下：

供試酵母活性干粉均采用200 mg/L的接種量進行，先溫水活化后接種于50 L葡萄醪中擴培24 h后進行接種實驗。以先接種NM218，48 h后再接種FX10為處理組；只接種FX10為對照組，25～27 ℃控溫發酵。參考馮丹萍等[18]的方法，當相對密度在1.058左右時視為發酵中期，相對密度在1.015左右視為發酵末期，相對密度降至0.993～0.996時視為AF結束。發酵期間，分別在接種NM218后12 、48 h、發酵中期、發酵末期取樣監測酵母生長狀況。AF結束后酒樣轉罐分離，加入1 g/t的乳酸菌干粉活化液啟動蘋果酸-乳酸發酵，18～20 ℃控溫發酵，蘋果酸-乳酸發酵結束后酒樣轉罐分離，在15 ℃條件下陳釀貯藏。其中，AF結束與陳釀5 個月（5M）分別進行取樣，對照組酒樣分別記為AF-CK和5M-CK；處理組酒樣分別記為AF-NM和5M-NM；每組實驗重復3 次。

1.3.2 酵母生長動態監測

參考本實驗室Gao Pingping等[15]的方法，采用平板計數法。酒樣梯度稀釋后涂布在WL培養基上，28 ℃培養72 h后進行菌落計數。根據M.guilliermondii在WL培養基上菌落特征為圓形乳白色而S.cerevisiae為白色帶淺綠色，中間凸起的形態差異分別進行統計。

1.3.3 常規理化指標測定

利用多功能葡萄酒分析儀，測定乙醇、總酸、揮發酸、殘糖、甘油等。

多功能葡萄酒分析儀條件：用25% H3PO4溶液調零液；酒樣進液量為30 mL；樣品溫度25 ℃；XY自動進樣系統分析時間持續30 s。

1.3.4 顏色指標測定

1.3.4.1 CIELab顏色參數測定

參照SN/T 4675.25—2016《出口葡萄酒顏色的測定CIE 1976（L*a*b*）色空間法》[19]進行測定。檢測條件：酒樣經0.45 μm濾膜過濾，2 mm光程石英比色皿，用紫外-分光光度計連續掃描380～780 nm譜段，間隔5 nm，每酒樣重復3 次，蒸餾水為空白。將380～780 nm波長處吸光度矯正到1 cm光程后，CIELab顏色參數計算如下：

式中：X、Y和Z為樣品三刺激值；X0、Y0和Z0為D65標準白光三刺激值，取值為94.825、100.00、107.381。

1.3.4.2 總花色苷含量測定

參考蘭圓圓等[20]的方法，計算如式（6）所示：

總花色苷質量濃度/（mg/L）=（A1-A2）×875 （6）

式中：A1、A2分別為用HCl溶液、NaHSO3溶液處理的酒樣在520 nm波長處的吸光度。

1.3.4.3 單體花色苷比例、離子化指數測定

參考趙宇等[21]的方法，計算如式（7）、（8）所示：

式中：A1、A2、A3分別為未經過處理、SO2溶液處理、乙醛溶液處理的酒樣在520 nm波長處的吸光度。

式中：A1、A2、A3、A4分別為未加NaHSO3溶液酒樣、加入NaHSO3溶液酒樣、未加HCl溶液酒樣、加入HCl溶液酒樣在520 nm波長處的吸光度。

1.3.5 揮發性香氣化合物測定

參考Gao Pingping等[15]的方法，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace-solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）聯用儀進行測定。

SPME條件：取8 mL酒樣于裝有2.5 g NaCl、10 μL內標物2-辛醇（820.7 mg/L）的頂空瓶中，加磁力攪拌轉子密封，置于磁力攪拌器上，40 ℃水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。

GC-MS條件：TG-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；升溫程序為40 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；載氣（He）流速1 mL/min；不分流進樣；電子電離源；電子能量70 eV；進樣口溫度240 ℃、傳輸線溫度180 ℃、離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z50～350。

定性定量分析：GC-MS分析所得的樣品質譜圖經計算機在NIST、Wiley數據庫檢索比對，結合譜圖分析進行定性。各成分的含量以2-辛醇為內標物進行半定量分析。香氣物質含量和氣味活性值（odor activity value，OAV）按式（9）、（10）計算：

式中：X為香氣物質質量濃度/（μg/L）；A1為測得香氣物質的峰面積；f為內標物校正因子，f=1；C為內標物質量濃度/（μg/L）；A為內標物峰面積。

1.3.6 感官評價

參考趙美等[22]的方法，略作修改，品評小組由10 位葡萄酒專業人員組成，使用10 分結構化數值尺度量化，分別從外觀（色澤、澄清度）、香氣（花香、果香、異味）、口感（酸度、酸甜平衡感、余味）和整體評分這4 個方面對各酒樣進行品評。感官評分標準見表1。

1.4 數據處理

通過Microsoft Office Excel 2019進行數據整理和統計；利用IBM SPSS Statistics 26軟件對數據進行方差分析；應用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 AF過程中的相對密度變化

采取比重法對發酵進程進行監測，發酵溫度控制在25～27 ℃左右，發酵進程見圖1，對照組在發酵第1～6天時相對密度下降最快，說明這一階段發酵速率較高；第7天相對密度下降趨勢減緩，發酵速率開始減緩，直至第18天發酵結束。處理組在1～7 d發酵速度較快，隨后發酵減緩，與對照組相比，發酵時間延長了2～3 d。

圖1 AF過程中相對密度變化Fig.1 Changes in specific gravity during alcoholic fermentation

2.2 發酵過程酵母生物量分析

由表2可知，對照組中S.cerevisiae在整個AF過程中生物量呈現先上升后下降的趨勢，在發酵中期以前始終保持107CFU/mL數量級。處理組中，S.cerevisiae、M.guilliermondii生物量同樣呈現出先上升后下降的趨勢，其中，M.guilliermondii生物量在接種48 h后達到最大（8×107CFU/mL），至發酵中期時，S.cerevisiae的生物量（107CFU/mL）已遠大于M.guilliermondii（105CFU/mL），發酵末期未檢測到M.g u i l l i e r m o n d i i的存在，而S.cerevisiae的生物量保持在105CFU/mL水平。

表2 兩種接種方式下不同發酵時期酵母生物量Table 2 Yeast biomass during different fermentation periods under two inoculation modes 107 CFU/mL

2.3 常規理化指標分析

由表3可知，供試酒樣基本理化指標均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求。兩款酒樣殘糖質量濃度均低于4 g/L，表明酒樣均能徹底發酵；乙醇體積分數范圍為13.95%～14.44%，處理組乙醇含量顯著低于對照組，說明M.guilliermondii的參與能夠降低乙醇體積分數；酒樣中揮發酸質量濃度均不高于0.78 g/L，說明酒樣發酵過程無異常情況；AF-NM與5M-NM處理組酒樣總酸含量均低于對照組酒樣，但差異不顯著，隨著陳釀的進行，5M-CK與5M-NM酒樣總酸含量均顯著降低；AF-NM與5M-NM處理組酒樣甘油含量均顯著低于對照酒樣，說明M.guilliermondii并不是高產甘油的非S.cerevisiae。

表3 AF結束與陳釀5 個月后基本理化指標Table 3 Basic physicochemical indexes of wines at the end of alcoholic fermentation and after aging for five months

2.4 顏色指標分析

由表4可以看出，基于CIELab顏色空間的5 個參數數據結果均表現為處理組酒樣顯著高于同一時期對照組酒樣。L*代表酒樣的明暗程度，L*越大，酒樣顏色越亮。AF結束時，AF-NM酒樣的L*值顯著高于AF-CK酒樣211.47%，陳釀5 個月后依然高于對照酒樣180.80%；雖然陳釀5 個月后各酒樣L*值均呈上升趨勢，但5M-CK酒樣比AF-CK的L*值僅增高了24.33%，而5M-NM酒樣比AF-NM的L*值增高了37.91%，說明菌株NM218的參與發酵對顏色明亮度影響顯著。a*值代表酒樣紅綠色程度，a*值越高說明酒體顏色中紅色分量越大，可以看出，AF結束時和陳釀5 個月后，處理組酒樣比同一時期對照酒樣的a*值分別增加了42.35%、47.01%，說明菌株NM218參與發酵可能能夠增強某種紅色成分的物質。b*值代表酒樣黃藍色程度，b*值越高說明酒體顏色中黃色分量越大，通常干紅葡萄酒陳釀時間越長，b*值也逐漸增高，而本實驗中，AF結束時和陳釀5 個月后，處理組酒樣比同一時期對照酒樣的b*值分別增加了174.53%、205.68%，說明菌株NM218在AF過程即顯著增加了酒體黃色成分的分量。由此也相應地使處理組酒樣的C*ab值（色彩飽和度）和h*ab（色調）增高。色差（ΔE*ab）與L*、a*和b*值貢獻程度有關，表征酒樣間總體差異程度。以AF-CK為參比酒樣，5M-CK表現為ΔE*ab大于4，AF-NM與5M-NM均表現為ΔE*ab大于22，說明菌株NM218參與發酵對色差影響顯著。AF結束時，處理組AF-NM總花色苷含量和單體花色苷比例顯著低于對照（AFCK）酒樣，尤其總花色苷含量降低了49.08%。陳釀5 個月后，各酒樣總花色苷含量也都略有下降，在5 個月的陳釀過程中，5M-NM較AF-NM降低了1.80%，這個降低幅度與對照酒樣即5M-CK較AF-CK的降低幅度差異不大，說明菌株NM218在AF過程中能夠顯著降低花色苷含量。離子化指數反映葡萄酒中對顏色起貢獻的花色苷比例[21]，從表4可以看出，處理組酒樣的離子化指數均顯著高于同一時期對照酒樣，數據結果與L*值、b*值相對應，說明菌株NM218顯著增加了酒中對顏色起貢獻的花色苷比例。

表4 酒樣相關顏色指標Table 4 Color parameters of wine samples

2.5 香氣化合物分析

葡萄酒的風味是由不同揮發性香氣化合物共同作用的結果。實驗通過HS-SPME-GC-MS法分析酒樣香氣物質，共檢測出64 種揮發性香氣化合物，包括醇類18 種、酯類31 種、萜烯類7 種、酸類2 種、醛酮及其他類6 種，各個酒樣的揮發性化合物種類及含量均有差異（圖2、表5）。

圖2 不同香氣物質種類含量Fig.2 Contents of different classes of aroma substances in wine samples

表5 香氣化合物成分分析Table 5 Composition of aroma compounds in wine samples

高級醇類物質是酵母氨基酸代謝的次級產物之一，是葡萄酒中的主要香氣物質，高級醇低于300 mg/L時可以增加葡萄酒香氣的復雜性，賦予葡萄酒怡人的花香和水果香，但當高于400 mg/L時會給葡萄酒帶來刺鼻的氣味[23]。適量的醇類物質可使葡萄酒的香氣更為復雜、濃郁，如2,3-丁二醇具有橡膠、奶油、水果味；正辛醇賦予葡萄酒茉莉、檸檬、柑橘等多種風味。這些醇類物質對葡萄酒整體感官質量有一定的優化作用[24]。兩款酒樣共檢測出18 種醇類物質，總質量濃度為16 444.37（AF-NM）～23 056.98 μg/L（5M-CK），均低于3 0 0 m g/L。異戊醇（＞4 7.4 7%）和2-苯乙醇（＞47.39%）在醇類物質中占比最大，OAV均大于1，賦予葡萄酒香蕉、蜂蜜、玫瑰、丁香花等氣味。

酯類物質是葡萄酒香氣中的重要組成部分，主要在葡萄酒發酵和陳釀過程中產生，可以賦予葡萄酒愉悅的花香和果香，對葡萄酒香氣的形成起著至關重要的作用[23]。兩款酒樣共檢測出31 種酯類物質，酯類物質的總質量濃度為11 244.49（AF-CK）～15 224.347 μg/L（5M-NM）。辛酸乙酯在酯類物質中占比最大，其次為丁二酸二乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯等。AF-NM酒樣中，丁酸乙酯（97%）、乙酸異戊酯（123%）、己酸乙酯（59%）、庚酸乙酯（621%）、辛酸甲酯（43%）、辛酸乙酯（37%）、己酸異戊酯（77%）、反-4-癸烯酸乙酯（238%）、乙酸苯乙酯（61%）和3-苯丙酸乙酯（140%）含量均顯著高于AF-CK。5M-NM中辛酸乙酯（35.45%）、乙酸異戊酯（10%）、庚酸乙酯（151%）、丁二酸二乙酯（63%）、反-4-癸烯酸乙酯（351%）和肉豆蔻酸乙酯（83%）含量均高于5M-CK。值得注意的是，丁酸異戊酯和辛酸異戊酯僅在處理組中檢出。

脂肪酸是酵母在脂肪酸代謝過程中形成的，當接近其閾值時，葡萄酒會產生果味、奶酪味、黃油味。但濃度過高會使葡萄酒具有“汗味”、“脂肪味”、“腐臭味”等不良風味[25]。實驗共檢測出正己酸、辛酸兩種脂肪酸，其中，對照組與處理組酒樣經陳釀后總酸均顯著高于AF結束的酒樣。值得注意的是，辛酸只在對照組中檢出。

萜烯類物質閾值較低，賦予葡萄酒濃郁的香氣。實驗共檢測出芳樟醇、香茅醇、橙花醇、反式-橙花叔醇、大馬士酮、香葉基丙酮、α-萜品醇7 種萜烯類物質。其中，5M-CK較AF-CK、5M-NM較AF-NM大馬士酮含量顯著增加，分別增加了120%、171.43%。處理組與對照組在同一時期萜烯類物質總含量沒有顯著性差異，但經陳釀后分別增加了170.14%、115.01%。還檢測到6 種酮醛及其他類化合物，總質量濃度為290.83～577.48 μg/L，包括醇酮類5 種、其他類化合物1 種，盡管這些物質含量較低，但對酒體香氣復雜性有一定的積極貢獻。

2.6 主要香氣化合物的熱圖分析

OAV為香氣物質的含量與氣味閾值的比值，是評價單一香氣化合物對葡萄酒整體香氣貢獻程度的指標[26]。為確定供試酒樣的香氣差異，對OAV＞0.1的香氣物質進行熱圖聚類分析。由圖3可知，AF-CK酒樣中芳樟醇、月桂酸乙酯、辛酸甲酯、1-壬醇等含量較高，賦予葡萄酒濃郁的菠蘿、梨、柑橘等香氣；AF-NM酒樣中月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸甲酯、己酸乙酯等香氣物質含量較高，賦予葡萄酒復雜濃郁的香蕉、草莓、蘋果、柑橘等水果香；5M-CK酒樣中大馬士酮、壬醛、3-甲基丁酸乙酯、2-苯乙醇、癸酸乙酯等香氣物質含量較高，能夠為葡萄酒帶來復雜濃郁的玫瑰、橙子、黑莓、香蕉、丁香花等氣味；5M-NM酒樣中大馬士酮、乙酸苯乙酯、香茅醇、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、正辛醇等香氣物質含量較高，能夠為葡萄酒帶來濃郁的玫瑰、青檸檬、蘋果等香氣。熱圖分析表明，NM-218與S.cerevisiae順序接種發酵能夠增加部分酯類、萜烯類物質的含量，提升赤霞珠干紅葡萄酒中的花香、果香，提高香氣復雜性。

圖3 酒樣主要香氣成分熱圖Fig.3 Heatmap of the major aroma compounds of wine samples

2.7 感官分析

為更好地評估供試菌株對葡萄酒感官質量的影響，進行感官評價（圖4）。外觀方面，處理組酒樣與對照組酒樣在AF結束、陳釀5 個月均呈紫紅色，但處理組酒樣較同一時期對照組酒樣紫紅色較淺；香氣方面，AF結束與陳釀5 個月酒樣均無明顯異味，處理組酒樣花香、果香顯著優于對照組；口感方面，處理組酒樣AF結束時酸度較低、余味較強，經陳釀后處理組余味、酸甜平衡感較強；處理組酒樣在陳釀5 個月后整體評分方面也獲得了較高的分數，酒樣酒體協調、香氣濃郁。

圖4 感官分析雷達圖Fig.4 Radar plot of sensory analysis

3 討 論

近年來，消費市場對不同類型和風格葡萄酒的需求不斷增長，而S.cerevisiae與本土非S.cerevisiae混合發酵作為一種調控葡萄酒香氣特性的新工藝，成為了研究和應用的熱點之一。NM218菌株是本實驗室優選出的1 株本土菌株，前期研究表明[14]，菌株NM218能夠在350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH 2.5和9%乙醇條件下表現出較好的耐受性，在反應溫度40 ℃、pH 4.0條件下，β-葡萄糖苷酶活力可達49.5 mU/mL，具有應用于混菌發酵的潛力。Gao Pingping等[15]結果表明，NM218菌株與S.cerevisiae順序接種于葡萄醪液中，48 h后M.guilliermondii生物量達到106～107CFU/mL，能夠改善葡萄酒的風味特征。因此，為保證實驗中NM218在葡萄酒發酵過程具有較高的生物量與β-葡萄糖苷酶活力，NM218以48 h后接種S.cerevisiae的接種策略進行混菌發酵。

色澤是評價葡萄酒風味質量的重要指標，而花色苷是其顏色的物質基礎，對紅葡萄酒顏色起決定作用[27]。Han Fuliang等[28]采用主成分回歸分析法研究了赤霞珠葡萄酒中花色苷與顏色的關系，發現參與分析的花色苷可以解釋葡萄酒紅色的64.56%～81.57%。本研究中，處理組AF-NM酒樣總花色苷質量濃度（291.08 mg/L）顯著低于對照組AF-CK酒樣（571.67 mg/L），這可能歸因于M.guilliermondiiNM218高β-葡萄糖苷酶活力[29]。然而，AF-NM酒樣的a*值（45.61）卻高于AF-CK（32.04），AF-NM酒樣離子化指數與AF-CK酒樣相比顯著增高，說明處理組酒樣對顏色起貢獻的花色苷比例較高，所以處理組a*值高于對照組的原因可能是M.guilliermondii能夠使酒樣中產生對紅色分量貢獻較大的花色苷類物質，從而導致a*值較高，具體原因尚不清楚，這一點后期還需繼續研究以明確酒樣中不同成分對顏色的影響。本研究AF-NM酒樣b*值（24.90）顯著高于AF-CK（9.07），陳釀5 個月后趨勢不變。這一結果可能與吡喃類花色苷的含量有關，Benito等[11]研究表明，M.guilliermondii發酵能夠增加吡喃花色苷類物質的形成，而吡喃類花色苷對橘黃色貢獻較大[25]。從顏色參數可以看出，處理組酒樣陳釀5 個月的花色苷總量低于對照組，紅色指標和黃色都明顯增加，這一結果還需繼續在陳釀期進行跟蹤檢測以探明原因。同時也說明，針對高β-葡萄糖苷酶活力的M.guilliermondii菌種在干紅葡萄酒的應用中，可以考慮適當延長浸漬時間，讓花色苷等呈色物質更好的浸入葡萄酒[30]；其次，也可以考慮針對桃紅葡萄酒或干白葡萄酒的釀造進行應用研究。

香氣是葡萄酒感官評價的重要指標，也是影響葡萄酒感官質量的重要因素。陳譽文等[5]研究表明，畢赤酵母屬與S.cerevisiae混合發酵可以有效提高冰酒的香氣復雜性和豐富度，可釀造出具有本土特色的優質葡萄酒。本研究中，NM218與S.cerevisiae順序接種發酵能夠增加乙酸異戊酯、辛酸異戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、香茅醇等部分酯類、萜烯類物質的含量，提升赤霞珠干紅葡萄酒中的花香、果香，提高香氣復雜性，這與Gao Pingping等[15]研究結果一致。值得注意的是，丁酸異戊酯與辛酸異戊酯僅在處理組中檢出，這可能與NM218菌株的某種釀酒特性有關，具體機制還有待進一步研究。

4 結 論

本土M.guilliermondii菌株NM218與商業S.cerevisiaeFX10以間隔48 h順序接種進行赤霞珠干紅葡萄酒中試釀造，在AF過程中，M.guilliermondii細胞活菌數在AF中期逐漸降低為105CFU/mL，到發酵末期完全消亡，而S.cerevisiae自接種后到發酵末期一直存在于發酵體系；所得酒樣基本理化指標均符合GB/T 15037—2006的要求；順序接種能提高酒體CIELab顏色參數、離子化指數，降低總花色苷含量與單體花色苷比例，使酒樣顏色亮度、紅色色調、黃色色調與色彩飽和性與對照酒樣存在顯著差異；此外，順序接種發酵能夠增加酒樣中丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、香茅醇等酯類、萜烯類物質的含量，且有2 種獨有香氣，賦予赤霞珠干紅葡萄酒濃郁的花香、果香，提高香氣復雜性，在一定程度可以提升葡萄酒的感官品質。綜上結果表明，NM218與FX10順序接種發酵可以增強干紅葡萄酒香氣品質和感官愉悅感。