乳腺癌-抑郁癥關聯基因篩選與中藥預測的生物信息學研究

李丹云 藍婉寧 袁澤煥 廖秋華 陳彥彤 鄭錦湖 曹 陽

(1 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海市 200000;廣州中醫藥大學2 第一臨床醫學院,3 第二臨床醫學院,4 第三臨床醫學院,廣東省廣州市 510405)

乳腺癌是臨床上較為常見的癌癥,同時也是導致女性死亡的主要原因之一[1]。世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的最新數據顯示,2020年全球乳腺癌新發病例首次超越肺癌,成為全球第一大癌[2]。心理健康是乳腺癌診斷和治療過程中醫生與患者關注的重點[3]。研究表明,相較于其他惡性腫瘤患者,乳腺癌患者的抑郁癥發生率更高[4]。而抑郁、焦慮等不良情緒的發生會降低乳腺癌患者治療的依從性與效果,影響患者的生活質量及預后[5],甚至增加患者的死亡率[6]。因此,早期診斷乳腺癌并發抑郁癥并給予治療,對改善患者預后具有重要的臨床意義。目前,乳腺癌并發抑郁癥并無特效藥物,多是在乳腺癌治療的基礎上服用抗抑郁藥物,但這容易引起患者食欲減退、惡心、嘔吐、血細胞減少等不良反應[7]。中醫學認為乳腺癌并發抑郁癥多屬“郁病”范疇,其發生主要與肝氣郁結有關,中醫藥防治可發揮整體調治、辨證論治的優勢[8-9]。本研究利用生物信息學方法,識別特定、敏感和可靠的乳腺癌-抑郁癥關聯基因及其涉及的相關信號通路,挖掘潛在治療中藥,為乳腺癌并發抑郁癥患者的早期診斷、治療與預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源 從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中查找并篩選得到兩個數據集GSE70905和GSE98793,兩個數據集均以血液樣本作為檢測樣本,且同時具有病變組織樣本及正常對照組織樣本,樣本的物種來源均為人。GSE70905數據集包括47例乳腺癌組織樣本和47例正常對照組織樣本,其來源平臺為GPL4133 Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F(Feature Number version)。GSE98793數據集包括128例重度抑郁癥患者血液樣本和64例正常對照人群血液樣本,其來源平臺為GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 差異表達基因的篩選 使用在線分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分別篩選上述2個數據集中乳腺癌組織樣本和正常對照組織樣本之間、重度抑郁癥患者血液樣本和正常對照人群血液樣本之間的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),設置篩選條件為|log2FC|≥1、P值≤0.05,采用SangerBox軟件繪制DEGs的火山圖和熱圖。運用Draw Venn Diagram在線軟件對上述2個數據集的DEGs制作Venn圖,獲取乳腺癌-抑郁癥關聯基因用于后續分析。

1.3 乳腺癌-抑郁癥關聯基因的富集分析 利用在線分析工具DAVID(http://david.ncifcrf.gov)對乳腺癌-抑郁癥關聯基因進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析,以了解其分子功能、參與的生物學過程及涉及的細胞組分,并進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05作為篩選條件。使用在線云平臺OmicShare(www.omicshare.com/tools)對分析結果進行可視化處理。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及關鍵基因的分析 將乳腺癌-抑郁癥關聯基因導入STRING數據庫(https://string-db.org/),設置“Organism”為“Homo sapiens”,“最低相互作用閾值”選擇“最高置信度(0.900)”,隱藏網絡中無關聯的靶標基因,其余參數選取默認值,得到蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡信息。運用Cytoscape 3.7.2軟件進一步可視化處理PPI網絡,并在PPI網絡中通過MCODE插件篩選關鍵基因,篩選條件為MCODE score>16、degree cut-off=2、node score cut-off=0.2、Max depth=100、k score=2。在GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中分析關鍵基因在乳腺癌組織中的mRNA表達水平;利用在線數據庫Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)進行生存分析(選擇“mRNA-gene chip”),根據關鍵基因的mRNA表達水平中位數將乳腺癌患者分為高表達組和低表達組,采用log-rank檢驗比較兩組生存曲線的差異(其他參數為默認值),以P<0.05為差異有統計學意義。

1.5 關鍵基因映射及中藥預測 在Coremine Medical數據庫(http://www.coremine.com/)中對關鍵基因進行映射,篩選出與關鍵基因相關的中藥。

2 結 果

2.1 DEGs及乳腺癌-抑郁癥關聯基因 共得到5 005個乳腺癌相關DEGs及1 680個抑郁癥相關DEGs,將兩者取交集得到281個乳腺癌-抑郁癥關聯基因,見圖1、圖2、圖3。

圖1 DEGs的火山圖

圖2 DEGs的熱圖

圖3 Venn圖

2.2 乳腺癌-抑郁癥關聯基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果 GO功能富集分析結果表明,乳腺癌-抑郁癥關聯基因的分子功能主要表現在蛋白磷酸酶結合、三磷酸腺苷酶活性、多聚腺嘌呤核糖核苷酸結合等,參與的生物學過程主要為血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)信號通路、白細胞遷移、一氧化氮生物合成過程的正調控、對缺氧的反應、白細胞介素10產生的正調控等,涉及的細胞組分主要為細胞表面、細胞支架、胞質液等,見表1。KEGG通路富集分析結果表明,乳腺癌-抑郁癥關聯基因主要富集在IgE-FC片段受體(Fc fragment of IgE receptor,FcεRI)信號通路、癌癥中的蛋白多糖信號通路、白細胞跨內皮遷移信號通路、Rap1信號通路、鞘磷脂信號通路等,見圖4。

表1 乳腺癌-抑郁癥關聯基因的GO功能富集分析結果

圖4 乳腺癌-抑郁癥關聯基因的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.3 關鍵基因的篩選及分析結果 通過STRING數據庫及Cytoscape 3.7.2軟件構建乳腺癌-抑郁癥關聯基因的PPI網絡后,使用Cytoscape 3.7.2軟件的MCODE插件尋找PPI 網絡中密集連接的區域,得到功能模塊最大者由16個節點和120條邊組成,共得到16個關鍵基因,包括毒蕈堿型膽堿受體(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)2、CHRM4、C-X-C基序趨化因子配體(C-X-C motif chemokine ligand,CXCL)2、CXCL8、CXCL10、CXCL11、α2腎上腺素受體(adrenoceptor alpha 2,ADRA2)C、ADRA2A、ADRA2B、前列腺素E受體3(prostaglandin E receptor 3,PTGER3)、5-羥色胺受體1B(5-hydroxytryptamine receptor 1B,HTR1B)、γ-氨基丁酸B型受體亞單位1(gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1,GABBR1)、μ1鴉片受體(opioid receptor mu 1,OPRM1)、δ1鴉片受體(opioid receptor delta 1,OPRD1)、D2多巴胺受體(dopamine receptor D2,DRD2)、D3多巴胺受體(dopamine receptor D3,DRD3),見圖5。

圖5 關鍵基因的PPI網絡圖

利用GEPIA網站分析16個關鍵基因在乳腺癌組織中的mRNA表達水平,結果顯示,與正常乳腺組織相比,在乳腺癌組織中CXCL10、CXCL11呈高表達,ADRA2A、ADRA2C、CXCL2、DRD2、GABBR1、PTGER3呈低表達(P<0.01),見圖6。通過Kaplan-Meier Plotter進行生存分析,結果顯示,與相應基因低表達者相比,CXCL8、CXCL10、CXCL11高表達的乳腺癌患者生存率更低,ADRA2A、ADRA2B、CXCL2、CHRM2、CHRM4、DRD2、DRD3、GABBR1、HTR1B、OPRD1、OPRM1、PTGER3高表達的乳腺癌患者生存率更高(P<0.05),見圖7。

圖6 在正常乳腺組織與乳腺癌組織中16個關鍵基因的mRNA表達水平

圖7 生存分析曲線圖

2.4 關鍵基因映射與中藥預測結果 在Coremine Medical數據庫中對關鍵基因進行映射,篩選得到與關鍵基因相關的中藥包括火麻仁、人參、白果、螺旋藻、眼鏡蛇等。其中,火麻仁是關鍵基因CXCL2、CXCL8、PTGER3、DRD2、CHRM2、OPRM1映射的中藥,人參是關鍵基因CXCL10、CXCL8、GABBR1、ADRA2A、DRD3、CHRM2映射的中藥,白果為關鍵基因HTR1B、CXCL10、GABBR1、CXCL8、DRD2映射的中藥,螺旋藻為關鍵基因HTR1B、ADRA2B、CXCL10、CXCL2、CXCL8映射的中藥,眼鏡蛇為關鍵基因CHRM4、CXCL10、CXCL11、CXCL8、DRD2映射的中藥。

3 討 論

目前,抑郁癥與腫瘤的關系逐漸成為醫學界研究的焦點[10]。相關文獻報告,乳腺癌患者的抑郁癥發生率達10.0%～63.5%[11-12]。近年來,有關乳腺癌患者并發抑郁癥的發生、發展機制及治療靶點尚無定論。利用基因芯片數據挖掘分析技術,可以更好地研究乳腺癌-抑郁癥的生物學機制,進而發現疾病治療的新靶點和新藥物。

本研究共篩選出281個乳腺癌-抑郁癥關聯基因。GO功能富集分析表明,這些乳腺癌-抑郁癥關聯基因主要參與多種生物學過程,包括VEGFR信號通路、白細胞遷移、一氧化氮生物合成過程的正調控等。其中,VEGF是刺激血管生成最具代表性、作用最強的調節因子,可特異性作用于血管內皮細胞受體,促進血管內皮細胞的生長、遷移等[13]。腫瘤的生長和轉移依賴于新血管的形成,VEGF作為血管生成的關鍵因子,可促進腫瘤血管的形成,增強腫瘤血管的通透性,并且能夠誘導腫瘤淋巴管的生成,參與惡性腫瘤的發生和發展[14]。研究表明,VEGFR信號通路在乳腺癌的發生和發展過程中發揮了重要的調控作用[13,15-16]。此外,近年來有研究證實VEGF還是一種神經營養因子,可以保護神經、調節神經元功能及增強突觸可塑性等[17]。雖然不少研究結果表明VEGF與抑郁癥存在相關性[18-19],但目前臨床研究尚未形成一致的相關性結果。故VEGF也為研究抑郁癥的發病機制及治療靶點拓展了新的視角。

本研究KEGG通路富集分析結果表明,乳腺癌-抑郁癥關聯基因涉及的信號通路包括FcεRI信號通路、癌癥的蛋白多糖信號通路、Rap1信號通路、鞘磷脂信號通路等。FcεRI是一種異型多聚復合物,屬于具有多條鏈的免疫識別受體[20]。IgE可與肥大細胞表面上的高親和力受體FcεRI交聯,促使肥大細胞產生炎性細胞因子,從而加重抑郁癥[21]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3,TIM-3)在腫瘤組織中特異性表達。而肥大細胞可表達TIM-3,含有免疫受體酪氨酸激活基序的IgE受體可激活肥大細胞上TIM-3的表達[22-23]。故可推測FcεRI信號通路可能在乳腺癌與抑郁癥之間有一定的介導作用。乳腺癌和抑郁癥的發病過程都存在免疫炎癥反應[24],而Rap1是Ras重要的調節劑和介質,可促進白細胞跨內皮遷移,從而參與免疫炎癥過程[25]。此外,Rap1可以通過調節突觸的結構和功能,影響個體的精神活動,進而影響個體的行為[26]。神經酰胺是所有鞘脂代謝的中心生物活性脂質,可參與鞘脂的合成,以及維持屏障功能和流動性[27-28]。同時,鞘脂作為致癌相關信號分子,被廣泛應用于各種癌癥模型的研究[29]。

本研究共篩選得到16個關鍵基因,進一步分析關鍵基因在乳腺癌組織中的表達量及其與生存情況的相關性,結果顯示,8個關鍵基因在乳腺癌組織中顯著表達,且除ADRA2外,其余關鍵基因與乳腺癌患者預后密切相關。其中,CXCL10和CXCL11在乳腺癌組織中表達上調,CXCL10和CXCL11高表達的乳腺癌患者預后較差;ADRA2A、CXCL2、DRD2、GABBR1和PTGER3在乳腺癌組織中表達下調,上述基因高表達的乳腺癌患者預后較好。趨化因子在細胞增殖、分化、遷移和侵襲中發揮調節作用,CXCL2、CXCL10、CXCL11均屬于C-X-C基序趨化因子亞族。CXCL10及其受體CXCR3可表達于人乳腺癌細胞系,其可通過旁分泌回路建立腫瘤微環境,同時以自分泌方式增加癌細胞的遷移能力[30]。因此,乳腺癌患者的CXCL10和CXCL11高表達可促進乳腺癌擴散,縮短患者生存期,符合本研究生存分析的結果。有研究顯示,乳腺癌患者的血清CXCL10、CXCL11呈顯著性高表達[31],與本研究結果一致。CXCL2可募集中性粒細胞,從而發揮抗腫瘤或促腫瘤的作用。本研究結果提示CXCL2在乳腺癌組織中屬于表達下調基因,但目前針對CXCL2及其編碼蛋白在腫瘤中的調節作用及機制的研究較少,有待進一步探索[32]。ADRA2A為α2腎上腺素受體的編碼基因,與乳腺癌等多種疾病相關[33-34]。此前,針對DRD2的研究主要集中在精神病學領域,但近年來越來越多研究發現其對腫瘤具有調控作用[35]。目前尚缺乏GABBR1、PTGER3在乳腺癌與抑郁癥中作用的相關研究,今后需進一步研究以深入了解這些基因在乳腺癌與抑郁癥中的作用。

本研究通過映射關鍵基因預測治療乳腺癌與抑郁癥的中藥,結果顯示,人參和火麻仁對接的乳腺癌-抑郁癥關鍵基因最多。在中醫中,乳腺癌又名“乳巖”,抑郁癥為“郁證”,皆為情志不暢、肝脾失調所致。癌癥會給患者造成嚴重的心理壓力,憂思過度則氣機郁滯,氣機不暢反過來又會加重肝脾失調,二者互為因果。故中醫多以疏肝健脾為乳腺癌-抑郁癥的治療原則[36-37]。人參甘溫,大補元氣,為治療虛勞內傷的要藥;火麻仁兼可滋潤補虛。研究表明,人參具有減緩抑郁、抑制腫瘤細胞生長等作用,其主要成分是人參皂苷Rb3[38]。火麻仁含有大量中間體脂肪酸、大麻二酚及木脂素酰胺等,具有顯著的抗腫瘤作用[39],但目前尚未有研究闡明人參與火麻仁在抗抑郁及腫瘤中的作用機制,這或可為相關的藥理研究提供新思路。

綜上所述,本研究基于生物信息學分析共篩選出了7個可能參與乳腺癌-抑郁癥的發生和發展過程且與乳腺癌患者預后密切相關的基因,這些基因可能通過血管生成、免疫炎癥反應等信號通路發揮作用。而人參、火麻仁等中藥可為乳腺癌合并抑郁癥患者的治療提供新方向。本研究雖對后續研究有一定的參考價值,但研究結果缺乏臨床試驗及動物實驗等支撐,因此未來仍需要深入研究以驗證所得結論。