栝樓SRAP引物篩選及遺傳多樣性分析

何慶元，劉 麗，孫 武，朱軍軍，惠 雪，朱浩波，徐榮華

栝樓SRAP引物篩選及遺傳多樣性分析

何慶元1，劉 麗1，孫 武2，朱軍軍2，惠 雪1，朱浩波1，徐榮華1*

1. 安徽科技學院，安徽 鳳陽 233100 2. 潛山市農業科學研究所，安徽 潛山 246300

分析不同來源栝樓資源群體的遺傳結構和自然亞群間基因漂移分析以及資源的遺傳多樣性，為栝樓育種奠定基礎。從100對相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）引物中篩選出擴增效果好、穩定性高的43對引物對13個來源于3個自然亞群的栝樓資源進行擴增，進行不同亞群間和品種之間的遺傳結構和多樣性分析。共擴增出691個位點，其中多態性位點百分率達到79.16%，整個群體的多態性信息含量（polymorphic information content，PIC）、觀察等位基因數（observing the number of alleles，N）、有效等位基因數（effective number of alleles，N）、香農信息指數（Shannon information index，）和遺傳距離（genetic distance，）依次為0.495 5、1.791 6、1.374 6、0.359 4和0.231 6，3個自然亞群中其他野生類群的遺傳豐富度最高，潛山和合肥自然亞群之間的遺傳相似度高，達到0.922 9。親緣關系類群體間的群間分化系數（intergroup differentiation coefficient，）平均為0.265 6，類群間基因流（gene flow，N）平均為1.382 6，遺傳分化系數較大，不同自然亞群間具有一定的基因交流，但不同位點基因交換的差異很大。13個品種資源被分成2個亞群，2個長萼栝樓地方品種單獨組成一個亞群，其他11個雙邊栝樓資源被聚為另一個亞類，2個亞群遺傳相似性系數僅為60.94%，福建野生型與安徽育成品種相似性較低，四川野生型相似性較高，說明四川野生型已被大量應用于安徽栝樓育種。栝樓種質資源之間有較大的遺傳相似性，不同自然亞群的栝樓種質資源之間有一定的基因交流。

栝樓；長萼栝樓；雙邊栝樓；SRAP；遺傳分化；遺傳多樣性

栝樓Maxim.是葫蘆科栝樓屬多年生攀緣型草本植物。在我國各地均有分布和種植，栝樓根和皮具有清熱、潤肺、化痰、散結、滑腸的功效，是我國常用中藥材，栝樓籽是良好的保健休閑食品，因此栝樓具有很高的綜合開發和經濟價值[1]。栝樓屬植物有80多種[2]，我國產約40多種，多數已被栽培利用，并且不同的栝樓以＝11為染色體基數，有2、4、6和8倍（22、44、66和88）不同倍性，但當前栽培栝樓主要是4倍體栝樓（44），雌雄不同株的異花授粉植物，其遺傳基礎較為復雜[3-4]。而從形態學、細胞學和生化同工酶水平上雖有少量關于栝樓的遺傳研究，但分類受到環境條件影響較大。從DNA水平上選用一種高效的分子標記技術研究栝樓的種質資源，將為栝樓遺傳改良和育種應用打下堅實的基礎。目前應用于栝樓遺傳多樣性評價的分子標記有隨機引物擴增多態性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）[5]和間隔簡單重復多態性（interval simple repeat polymorphism，ISSR）[6]和ITS序列[7]的鑒定。

SRAP標記技術針對基因組的開放閱讀框（open reading frame，ORFs）外顯子富含GC序列和內含子富含AT設計正反向引物進行特異擴增，無需基因組參考信息即可實現PCR擴增檢測，具有操作簡便、穩定、多態性高等優點[8]，已被廣泛應用于油菜、花生、黃瓜、辣椒、結縷草、多花黑麥草和苜蓿等植物的遺傳多樣性和遺傳圖譜構建等研究[9-12]，但應用于栝樓的研究還鮮有報道。

由于栝樓是雌雄異株植物，長期異花授粉和無性繁殖，導致品種退化和混雜，不同品種之間遺傳關系不清，致使栝樓產業陷入停滯不前的困局。因此加強栝樓品種的遺傳研究，為栝樓品種選育和復壯奠定基礎，達到提質增效目的。本研究選用當前13個安徽地區育成品種及相關野生種質栝樓品種資源，通過SRAP研究不同資源之間的遺傳關系，為明確不同品種之間的遺傳關系，促進栝樓合理引種及育種利用提供依據。

1 材料與試劑

材料為13個安徽育成及相關野生栝樓品種，由安徽科技學院徐榮華副教授鑒定為Hayata和雙邊栝樓Harms，其來源、產地和自然群、種類和主要形態特征見表1。SRAP分析引物（上下游各10個）由通用生物（安徽）股份有限公司合成（表2）、Taq酶和dNTPs等購自索萊寶生物有限公司。

表1 供試的栝樓品種及產地和類群

表2 SRAP標記的引物序列

2 方法

2.1 DNA的提取

取各栝樓品種幼嫩葉片，液氮研磨成粉末，經改良CTAB法提取總基因組DNA[13]，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得清晰條帶，用紫外分光光度計測定濃度和質量，于?20 ℃保存備用。

2.2 SRAP反應及引物篩選

PCR體系為10 μl，包括25 ng的DNA，0.6 U的Taq酶，3 pmol上下游引物，0.6 mmol的dNTPs，20 pmol的MgCl2和1 μL的10×buffer。SRAP-PCR反應程序按94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性1 min、35 ℃退火1 min、72℃延伸1 min、5個循環，接著94 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min、再進行35個循環，最后72 ℃延伸8 min，12 ℃保存。以皖簍17號和皖簍18號DNA作為模板對100對引物組合進行篩選，按上述反應體系和程序進行擴增篩選，選擇擴增效果好的引物進行遺傳多樣性鑒定。

2.3 凝膠電泳檢測

擴增產物用8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200 V電泳約1.2 h。電泳結束后凝膠銀染顯色，用0.1%的AgNO3染色約10 min、經蒸餾水漂洗2次，在顯影液（16 g/L氫氧化鈉＋甲醛10.8 ml/L）中顯色至條帶清晰可見為止。

2.4 數據獲取與分析

2.4.1 居群內遺傳多樣性分析 將13個栝樓品種資源上擴增的條帶按通過人工統計帶型，將同一個水平線上有帶的標記為“1”，無條帶處標記為“0”表示進行基因分型。將13個品種分為3個自然群，分別為潛山地區自然群（5個），合肥育成自然群（4個）和其他野生自然群（4個）。計算總群體和3個自然群的總等位位點數（total number of alleles，TNB），多態性位點數（number of polymorphic loci，NPB），多態性標記位點百分比（percentage of polymorphic alleles，PPB）。用軟件Popgene version1.31[14]計算觀察等位基因數（observing the number of alleles，a）、有效等位基因數（effective number of alleles，e）、多態性信息含量（polymorphic information content，PIC）、香農信息指數（Shannon information index，）和遺傳距離（j）。

2.4.2 居群間遺傳變異，基因漂移分析 用Popgene32軟件計算不同群體之間的Nei’s遺傳距離（GD）和遺傳一致度（genetic identity，GI）、基因流（gene flow，m）、群間分化系數（st）以及居群之間的遺傳相關性，并用MEGA4.0.2轉化為樹狀圖。

2.4.3 品種資源的遺傳結構分析 利用NTSYSpc 2.1軟件進行相似性分析，并利用非加權組平均法（unweighted pair group with mathematic average，UPGMA）對供試栝樓品種資源進行聚類分析，將結果轉化為樹狀圖譜。

3 結果與分析

3.1 DNA質量分析

提取的栝樓基因組DNA電泳檢測只有1條帶，說明所提取的DNA具有良好的完整性，紫外分光光度計檢測，其260/280的值在1.5～1.8，可用作為SRAP的模板。

3.2 引物的篩選結果分析

上下游各10個引物，組合成100對引物以皖簍17號和皖簍18號DNA作為模板進行PCR擴增，產物經凝膠電泳檢測后，篩選出在2個品種上擴增效果好，穩定性較好的43對引物（圖1）。

3.3 PCR擴增結果

用篩選出的43對效果好的引物對13個栝樓品種資源進行擴增，產物經凝膠電泳檢測后獲得相應多區分度良好。其中AW75305F～AW75295R這對引態性圖譜，共擴增出691個位點，條帶清晰，帶型物擴增出的位點數最多，擴增出29個位點，其次是AW75302F～AW75291R這對引物能擴增出26個位點，最少的是AW75303F～P0814P1H10R這對引物僅擴增的位點數最少，僅擴增出7個位點。從整體看，SRAP每對引物獲得的位點數多，擴增的位點多態性高，分辨區分度良好，可以作為栝樓遺傳分析標記。圖2是AW75304F～AW75298R擴增的圖譜。

圖1 皖簍17號和皖簍18號部分SRAP引物篩選電泳圖

電泳圖中泳道序號與表1序號所對應品種資源一致

3.4 類群內遺傳多樣性分析

將13個品種分為3類群，從表3中看出整個群體有較高的多態性，標記位點的多態性百分率達到79.16%，、a、e、和依次為0.495 5、1.791 6、1.374 6、0.359 4和0.231 6。其中野生型品種類群資源遺傳多樣性最高，其標記平均達到57.45%、PIC為0.498 8、a為1.574 5、e為1.363 9、為0.317 2和為0.213 1都最高，合肥育成的品種類群的遺傳多樣性最低，標記位點多態性也最低。

3.5 類群間的遺傳結構和基因漂移分析

從表4可以看出，自然群間具有一定的遺傳一致度（GI≥0.866 9），自然群間遺傳距離（GD）均小于0.142 8，說明不同自然群間從進化來源一致性較高，當前所收集的栝樓不同群體間遺傳相似性較高，特別是安徽合肥和潛山的類群遺傳相似性達到0.922 9。從聚類圖（圖3）和表4上可知，潛山和合肥育成品種之間的遺傳一致性很高，遺傳距離較近，說明安徽當前栽培選育的栝樓品種遺傳基礎較為狹窄。而不同地區來源的野生栝樓和安徽本地的遺傳距離較遠，具有較大的遺傳差異，能夠拓寬栝樓育種的遺傳基因，具有較高的育種價值。

從自然群之間的基因流和基因分化來看，親緣關系地方群體間的群體間分化系數（st）平均為 0.265 6，說明不同自然群間存在較多的雜交，不同位點上最小為0.001 6，最大為1.000。自然群間m平均為1.382 6，位點之間最小為0.088 5，最大為303.545 5。可以看到栝樓類群遺傳分化系數較大，不同自然群間具有一定的基因交流，但不同位點間差異很大。

3.6 品種資源的遺傳結構分析

13個栝樓品種資源的聚類分析結果見圖4，從圖中可以看出，13個品種資源被分成2個亞群，2個長萼栝樓品種與其他栝樓品種資源遺傳相似性系數僅僅為60.94%，它們單獨組成1個亞群，與其他栝樓品種的遺傳差異最大，但在內部2個長萼栝樓地方品種的相似性較高，兩者相似性達到82.92%。其余11個品種被分成另外一個亞群，其中福建野生栝樓與其他品種遺傳相似系數最小，僅為70.33%，其次是天寶2號與其他栝樓品種遺傳相似性差異較大，相似系數為71.92%。皖簍9號和皖簍17之間的遺傳相似性最高，達到85.82%。從圖中可以看出，天寶2號雄株與皖簍9號和17以及潛山野生型相似性更高，而四川野生型與皖簍20和皖簍9號籽生資源從遺傳上被聚類在1個亞群中。天寶2號雌株和雄株之間也遺傳差異較大，因此選育栝樓品種要同時考慮雌株和雄株的遺傳背景，從栝樓遺傳相似性可以看出安徽所選育的栝樓品種遺傳相似性較高，而四川和福建的野生品種同時也被聚類在一起，特別是四川野生種質資源，其基因已大量摻入，可能是其已被安徽栝樓育種廣泛應用。

表3 栝樓類群內遺傳多樣性指標

表4 類群間的GI和GD

GI（上三角）和GD（下三角）

GI (above diagonal) and GD (below diagonal)

圖3 基于Nei’s遺傳距離類群聚類圖

圖4 13個栝樓品種資源的SRAP分析聚類樹狀圖

4 討論

4.1 SRAP用于栝樓遺傳多樣性分析適用性

SRAP作為一種不需要參考基因組序列信息的高效、快速分子標記，已被廣泛用于各類大田作物、園藝、草坪和中草藥的遺傳多樣性及分子圖譜的構建[9-12,15-17]，然而迄今還很少有栝樓的SRAP研究報道[18]。本研究選取上下游各10條SRAP引物，組成100對擴增引物，通過篩選，獲得了43對穩定擴增的引物，條帶清晰，帶型區分度良好，標記位點在13個種質資源上多態性百分率達到79.16%，說明SRAP標記適用于栝樓遺傳多樣性分析。

4.2 栝樓的遺傳多樣性

栝樓是異化授粉，雌雄異株植物，而栝樓以無性繁殖為主，通過雜交獲得種子，多采用集團選擇，選育的品種具有高度的雜合性，并且品種內部不同單株之間同樣存在遺傳背景差異，迄今為止，對瓜蔞遺傳多樣性研究還不多，孫稚穎等[5]采用了RAPD技術研究了山東栝樓的遺傳多樣性、高燕會等[6]采用ISSR研究了34份瓜蔞種質資源的遺傳多樣性、呂澤芳等[7]采用ITS序列研究了湖北及西南地區瓜蔞遺傳多樣性，但都沒有分析不同來源地的起源進化關系。本研究從每個品種資源上隨機選取3個單株進行混合取樣，建立DNA樣品池，確保所用基因組能夠代表品種資源的群體基因型。所用的43對SRAP引物所獲得的691個等位基因信息表明為0.495 5，類群內的值變化較小。說明栝樓品種資源之間具有較高的遺傳多樣性。并且3個自然群間具有較高的遺傳一致性（≥0.866 9），較小的遺傳差異（≤0.142 8），特別是合肥自然群和潛山自然群之間一致性很高，差異很小，這說明當前安徽所選育的瓜蔞品種其來源遺傳基礎還比較狹窄，而其他野生型與這2個自然群之間具有較高的遺傳差異，可以通過引入這些野生種質資源拓寬安徽栝樓育種的種質資源遺傳基礎。從品種資源的遺傳聚類結果看，不同地域來源的品種資源聚類結果并不在同一個遺傳類群中，并且不同居群之間的基因流較大，說明不同栝樓之間存在較大的基因交換，符合異交作物的遺傳特征。但11個雙邊栝樓品種資源與2個長萼栝樓（TGX和TGD）之間存在較大的遺傳差異，2個種間存在一定的生殖障礙，鮮有將2個種進行雜交育種，并獲得成功的先例。當前栝樓的基因型與表型之間的關系研究還較少，構建栝樓遺傳圖譜，乃至如大田作物一樣進行QTL定位和關聯定位，利用標記進行輔助選擇是栝樓未來育種的方向，也是分子標記利用的最終方向[19]。

4.3 栝樓種質資源的保護與利用

先前的育種實踐表明，異交作物，如玉米通過自交或者近交，獲得純合基因型，淘汰不利等位基因，獲得優良的純合自交或近交系，再雜交往往能夠獲得巨大的產量和抗性增益[20]。然而當前，栽培的栝樓品種大多數通過野生品種馴化選育獲得，以無性繁殖為主，經多年栽培種植，品種退化，異花授粉導致品種混雜，而育種上多采用集團選擇，還沒有進行系統的系譜選育。通過分子標記鑒定栝樓種質資源遺傳特性，為創制和選育新品種奠定基礎。本研究選用了2個類型的栝樓種，兩者之間的遺傳差異較大，利用SRAP分子標記鑒定了不同種質資源遺傳上的相似性，為進一步的系譜選育選擇親緣關系最近的雌雄單株構建姊妹近交系，加快創制出純合度高的栝樓遺傳研究材料和育種中間品系，為選育出高產、穩產和抗逆的新品種奠定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Primer screening of SRAP reaction system and analysis on genetic diversity of

HE Qing-yuan1, LIU li1, SUN Wu2, ZHU Jun-jun2, HUI Xue1, ZHU Hao-bo1, XU Rong-hua1

1. Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China 2. Qianshan Agricultural Science Research Institute, Qianshan 246300, China

To analyze the genetic structure, gene drift and genetic diversity of theresources from different sources within and among natural groups, so as to lay a foundation forbreeding.A total of 43 pairs of sequence-related amplified polymorphism (SRAP) primers with good amplification effect and high stability were screened from 100 pairs of SRAP primers to amplify 13resources from three natural groups, the genetic structure and diversity between genetic groups and varieties were analyzed.A total of 691 loci were amplified, of which the percentage of polymorphic loci reached 79.16%. The polymorphic information content (PIC)the number of observed alleles (N), the number of effective alleles (), the Shannon information index () and the genetic distance () of the whole population were 0.495 5, 1.791 6, 1.374 6, 0.359 4 and 0.231 6, respectively. The genetic richness of other wild groups was the highest in the three natural groups. The genetic similarity between Qianshan and Hefei natural groups was higher, reaching 0.922 9. The intergroup differentiation coefficient () between the genetic groups was 0.265 6, and gene flow (N) between the groups was 1.382 6. The coefficient of genetic differentiation was large. There was certain gene exchange between different groups, but the difference of gene exchange was very large in different loci. The 13 varieties resources were divided into two genetic subgroups. The two wild resources ofwere clustered into one subgroup separately, and the other 11resources were clustered into another subgroup. The genetic similarity coefficient of the two subgroups was only 60.94%. The similarity between wild resource from Fujian and Anhui resources was low, and the similarity between wild resource from Sichuan was high, indicating that Sichuan wild resource has been widely used in Anhuibreeding.There is greater genetic similarity between different germplasm resources, and there is a certain gene exchange between different groups of germplasm resources.

Maxim.;Hayata;Harms; sequence-related amplified polymorphism; genetic differentiation; genetic diversity

R286.12

A

0253 - 2670(2023)20 - 6813 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.024

2023-02-10

安徽省重點研發項目（202104a06020029）；安徽勝教育廳重大項目（2023AH040279）；國家自然基金項目（32101704）；大學生創新課題（202210879102，S202210879310）

何慶元（1978—），男，教授，博士，研究方向為植物遺傳育種。E-mail: heqingyuan1@163.com

通信作者：徐榮華（1979—），男，副教授，博士，研究方向為植物分子遺傳。E-mail: xrh96@163.com

[責任編輯 時圣明]