車前子及其炮制品色度值、UPLC指紋圖譜及體外抗氧化活性的差異研究

程鈺潔，邱彩月，洪婉敏，盧彭信，汪凱東，徐 杰，張志鵬

車前子及其炮制品色度值、UPLC指紋圖譜及體外抗氧化活性的差異研究

程鈺潔，邱彩月，洪婉敏，盧彭信，汪凱東，徐 杰，張志鵬*

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

分析車前子及其不同炮制品的指紋圖譜、色度值及抗氧化活性的差異，探討其化學成分與抗氧化作用的譜效關系。采用分光測色儀測定色度值，采用UPLC法建立車前子及其不同炮制品指紋圖譜，采用ABTS法測定抗氧化活性，結合相似度評價、方差分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統計方法分析車前子及其炮制品的差異；運用偏最小二乘回歸法（partial least squares regression method，PLSR）和灰色關聯度分析法（grey relation analysis，GRA）分析車前子及其不同炮制品化學成分與抗氧化活性的譜效關系。建立的車前子UPLC指紋圖譜標定了19個共有峰，炒車前子和鹽車前子標定了27個共有峰，合計標定了34個色譜峰，并對其中13個色譜峰進行了指認。多元統計分析表明，車前子與不同炮制品間存在顯著差異，PCA與HCA可將車前子生品與炮制品分為2類，OPLS-DA篩選出10個差異性標志成分。車前子炮制前后的粉末色度值Δ*＞6，可被肉眼識別，但不同炮制品間粉末顏色差異不明顯。抗氧化活性結果表明，車前子炮制后抗氧化作用增強，不同炮制品間差異不大。相關性分析表明，共有峰的峰面積值對色度值有一定影響，對*值的影響較小，對*值、*值影響較大；PLSR與GRA分析表明，有11個共有峰表征的化學成分與車前子及其炮制品的抗氧化活性關聯較大，其中包括原兒茶酸、木通苯乙醇苷B與野漆樹苷。建立的UPLC指紋圖譜及色度值、抗氧化活性的測定方法，可用于車前子及其不同炮制品的鑒別及質量分析，指紋圖譜-體外抗氧化活性的譜效關系研究，可為車前子炮制機制的研究提供參考。

車前子；炮制；UPLC；指紋圖譜；色度值；抗氧化活性；譜效關系；ABTS法；主成分分析；層次聚類分析；正交偏最小二乘-判別分析；灰色關聯度分析法；異毛蕊花糖苷；車前草苷D；野漆樹苷；京尼平苷酸

車前子是車前科車前屬植物車前L.或平車前Willd.的干燥成熟種子，始載于《神農本草經》，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰的功效，臨床用于治療熱淋澀痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽[1]。車前子包含的主要化學成分有多糖、黃酮類、苯乙醇苷類、生物堿類、環烯醚萜類、三萜類等[2-3]。現代藥理研究表明，車前子具有利尿、抗氧化、降尿酸、降血糖、調血脂、降血壓及抗肝損傷等多種作用，臨床應用十分廣泛，可用于濕熱引起的諸多疾病，如肝炎、腎病、便秘、高尿酸血癥、高血壓等病癥的治療[4-9]。

車前子的現代炮制方法主要有凈制、炒制和鹽制[10]。車前子生品性微寒，長于利尿通淋，炮制后寒性減弱，其中炒車前子善于祛痰止咳，鹽車前子善于滲濕止瀉。中藥發揮藥效作用的基礎是多種有效成分的合理、有機的組合，其模式是多途徑作用于機體內與疾病相關的多靶點，發揮對機體的整體調節作用[11]。因此，車前子生品與炮制品的功效不同，可理解為內在化學成分存在差異。目前，關于車前子及其炮制品的研究，多集中于炮制工藝及京尼平苷酸、毛蕊花糖苷等成分的含量測定上，多以單個或多個指標分析車前子炮制前后的差異，不足以作為全面地反映車前子炮制前后差異的主要變量指標[10]。

顏色性狀作為中藥飲片質量的外在體現，是中藥鑒別與質量評價的關鍵指標之一，采用色度值量化飲片粉末顏色，在中藥炮制領域已有較為廣泛的應用[12-14]。因此，本研究擬通過UPLC法建立車前子及其不同炮制品的UPLC指紋圖譜，結合化學計量學模式識別對三者化學成分進行系統的分析；通過采集飲片粉末的色度值，分析車前子炮制前后飲片粉末的顏色變化；同時測定車前子及其不同炮制品的體外抗氧化活性，進一步分析車前子及其炮制品的藥效差異；利用偏最小二乘回歸法（partial least squares regression method，PLSR）及灰色關聯度法（grey relation analysis，GRA）分析UPLC指紋圖譜共有峰與抗氧化活性的譜-效關系，以期為車前子的炮制機制研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity型超高效液相色譜系統，美國沃特世公司；Thermo ICAPQ型電感耦合等離子體質譜儀，美國賽默飛公司；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-700DE型數控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；111B型二兩裝高速中藥粉碎機，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司；H22-X3型電陶爐，杭州九陽生活電器有限公司；TS7700型分光測色儀，深圳市三恩時科技有限公司；UV-2600型紫外分光光度計，日本島津公司；Milli-QDirect超純水系統，默克股份有限公司。

1.2 材料

對照品京尼平苷酸（批號11828-201805，質量分數98.1%）、阿魏酸（批號110773-201915，質量分數99.4%）、大車前苷（批號111914-202105，質量分數96.0%）、木犀草苷（批號111720-202111，質量分數96.6%）、毛蕊花糖苷（批號111530-201914，質量分數95.2%）、木犀草素（批號111520-202006，質量分數94.4%）、芹菜素（批號111901-202004，質量分數99.4%）、原兒茶酸（批號110809-201906，質量分數97.7%）、野漆樹苷（批號111919-201804，質量分數95.5%）、木通苯乙醇苷B（批號111910- 201604，質量分數98.2%），中國食品藥品檢定研究院；對照品異毛蕊花糖苷，批號FF17B039，質量分數98%，成都普思生物科技有限公司；對照品車前草苷D，批號CFS202101，質量分數98.0%，Chem Faces公司；對照品芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷，批號21062901，質量分數98.29%，成都普菲德生物科技有限公司。色譜級甲醇、乙腈，德國默克股份有限公司；色譜純磷酸，天津市科密歐化學試劑有限公司；水為超純水，取自實驗室Milli-Q超純水系統，其余試劑均為分析純；ABTS自由基清除能力檢測試劑盒，蘇州格銳思生物科技有限公司。

12批車前子藥材經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為車前科車前屬植物車前L.的干燥成熟種子，12批炒車前子和12批鹽車前子為廣東一方制藥有限公司實驗室自制，按照《廣東省中藥飲片炮制規范》第一冊[15]炒車前子炮制項下規定，取凈車前子炒至略有爆聲并有香氣溢出時，取出攤涼，得到炒車前子，按照《中國藥典》2020年版一部[1]鹽車前子炮制項下規定，取凈車前子照鹽水炙法（通則0213）炒至起爆裂聲時，噴灑鹽水，炒干，取出攤涼，得到鹽車前子。具體樣品信息見表1及圖1。

表1 樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 車前子及其不同炮制品色度值測定與分析

采用分光測色儀對車前子及其不同炮制品飲片粉末進行色度值測定。取12批車前子、炒車前子、鹽車前子飲片粉末（過三號篩）適量，均勻平鋪于玻片上，壓制厚度約1 mm，采用國際照明委員會認可的D65光源，以白色作為背景，測定孔徑8 mm，視角選擇2度，經白板校正后，采集飲片粉末色彩圖像，并測定色度值，平行3次，取平均值，結果見圖2及表2。

Lab色彩模式中，L值為明度指數，*、*為色度指數，其中*為紅綠軸，*為黃藍軸，樣品粉末顏色用總色度值（*）表示，公式為*＝(*2＋*2＋*2)1/2。Δ*C-S＝*C－*S、Δ*Y-S＝*Y－*S、Δ*Y-C＝*Y－*C、Δ*C-S＝*C－*S、Δ*Y-S＝*Y－*S、Δ*Y-C＝*Y－*C、Δ*C-S＝*C－*S、Δ*Y-S＝*Y－*S、Δ*Y-C＝*Y－*C、色差Δ*C-S＝(Δ*C-S2＋Δ*C-S2＋Δ*C-S2)1/2、Δ*Y-S＝(Δ*Y-S2＋Δ*Y-S2＋Δ*Y-S2)1/2、Δ*Y-C＝(Δ*Y-C2＋Δ*Y-C2＋Δ*Y-C2)1/2，用于表達生品及不同炮制品在明度、紅綠、黃藍、總體的顏色變化情況，計算結果見表3。

當Δ*為6～12時，其色差可被肉眼識別，當Δ*＞12時，色差顯著[16]。由表3可知，12批車前子與其2種炮制品的色差值均＞6.0，即同批次藥材中可明顯區分生品與炮制品，但炒車前子和鹽車前子2種炮制品之間色差值較小，難以用肉眼區分。此外，車前子與炒車前子的Δ*為?14.12～?2.52，均值為?9.54，車前子與鹽車前子的Δ*為?15.06～?4.90，均值為?10.87，表明車前子炮制后明度下降，顏色加深；車前子與炒車前子的Δ*為3.97～5.47，均值為4.88，車前子與鹽車前子的Δ*為4.48～5.78，均值為5.26，表明車前子炮制后紅色加深；車前子與炒車前子、鹽車前子Δ*正負均有且數值不大，表明車前子炮制前后在黃藍軸上顏色變化不大。

圖1 車前子、炒車前子及鹽車前子樣品圖

圖2 12批車前子(S)、炒車前子(C)及鹽車前子(Y)樣品粉末色彩圖像

2.2 車前子及其不同炮制品指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 采用Waters Acquity UPLC HSS T3column（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，10%乙腈；5～15 min，16%～18%乙腈；15～20 min，18%～25%乙腈；20～25 min，25%～45%乙腈；25～30 min，45%～60%乙腈；30～40 min，60%～70%乙腈；40～41 min，70%～10%乙腈；41～50 min，10%乙腈；程序檢測波長：0～10.5 min，245 nm；10.5～35.5 min，330 nm；35.5～50 min，245 nm；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

表2 色度值結果

表3 色度值變化結果

2.2.2 質譜條件 氮氣作為質譜離子源的霧化、錐孔氣；質譜采用HESI離子源，離子源參數為鞘氣流速35 arb；輔助氣流速10 arb；噴霧電壓3.2 kV；射頻電壓50 V；輔助器加熱溫度350 ℃；毛細管加熱溫度350 ℃。質譜掃描參數為正、負離子掃描模式；掃描范圍為/150～2000；一級掃描分辨率為70 000 FWHM；二級掃描分辨率為17 500 FWHM；二級碰撞能量為40 eV。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取京尼平苷酸、原兒茶酸、阿魏酸、大車前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、車前草苷D、異毛蕊花糖苷、野漆樹苷、芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為53.072 1、84.217 4、86.179 8、40.512 0、42.117 6、158.888 8、69.034 6、44.590 0、57.232 0、49.182 5、48.555 3、38.043 2、62.622 0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 取飲片粉末（過二號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理（250 W、40 kHz）60 min，離心，濾過，濾液蒸干，殘渣加20 mL水使溶解，用醋酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并醋酸乙酯，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容到10 mL量瓶，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.5 精密度試驗 取車前子（S04）供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以17號毛蕊花糖苷色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.06%～0.96%，相對峰面積的RSD為0.09%～2.89%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取車前子（S04）供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別在制備后0、2、4、8、16、24 h進樣測定，以17號毛蕊花糖苷色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間RSD為0.08%～1.20%，相對峰面積RSD為0.31%～2.53%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取車前子樣品（S04），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以17號毛蕊花糖苷色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間RSD為0.05%～1.07%，相對峰面積RSD為0.13%～2.52%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.8 指紋圖譜的建立及色譜峰的指認 取12批車前子、炒車前子及鹽車前子樣品，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，采集色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”軟件進行數據處理，建立指紋圖譜，分別以S01、C01和Y01號圖譜作為參照圖譜，以“中位數”法作為對照圖譜生成方式，分別生成12批車前子、炒車前子及鹽車前子的對照指紋圖譜。12批車前子共標定了19個共有峰，12批炒車前子和鹽車前子均共標定了27個共有峰，結果見圖3。通過質譜精確相對分子質量、碎片離子對比分析，再與對照品保留時間及紫外吸收光譜比對，指認出其中13個主要成分，指認結果見圖4及表4。

2.2.9 相似度評價 分別以車前子、炒車前子及鹽車前子的對照指紋圖譜為參照，計算12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）指紋圖譜的相似度，結果分別為0.998、0.998、1.000、0.997、0.999、0.999、0.999、0.972、0.999、0.999、1.000、0.999，0.950、0.955、0.999、0.914、0.999、0.999、0.996、0.991、0.939、0.997、0.998、0.995，0.981、0.965、0.995、0.941、0.959、0.976、0.984、0.984、0.995、0.982、0.987、0.984。結果顯示，12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的相似度均大于0.9，說明不同批次的車前子樣品批間差異較小，且炮制后的樣品批間質量也較穩定。分別把車前子、炒車前子及鹽車前子生成的對照指紋圖譜導入軟件，車前子與炒車前子的相似度值為0.388，車前子與鹽車前子的相似度值為0.358，炒車前子與鹽車前子的相似度值為0.997，說明車前子生品與炮制品之間的化學成分差異性較大，而不同炮制品之間差異較小。

2.3 車前子及其不同炮制品UPLC指紋圖譜多元統計分析

2.3.1 單因素方差分析 將車前子及其不同炮制品的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計）導入SPSS 26.0進行單因素方差分析，結果見表5。結果表明，車前子經炮制后，色譜峰的變化較為明顯。其中，相比于生品，車前子炮制品UPLC指紋圖譜中新增了13個色譜峰，分別為峰1～3、6～12、18、20、28，缺失了4個峰，分別為峰14、16、23、31。此外，除峰25外，車前子炮制品各色譜峰的峰面積與車前子生品間的差異均具有統計學意義（＜0.05）；炒車前子與鹽車前子中峰6、8、12、15、17（毛蕊花糖苷）、19（車前草苷D）、21（異毛蕊花糖苷）、22（野漆樹苷）、24、26、27、33的峰面積差異均具有統計學意義（＜0.05）。

2.3.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計）導入SIMCA 14.1，進行PCA。以特征值＞1為標準，共提取了3個主成分，累積方差貢獻率為93.2%，提示模型預測良好，可反映出12批車前子、炒車前子及鹽車前子整體的信息，各主成分貢獻率見表6。

由前3個主成分建立坐標系，得到的車前子、炒車前子及鹽車前子的PCA得分圖如圖5所示。結果顯示，車前子生品與炮制品可明顯分為2組，但炒車前子和鹽車前子的部分樣品相互重疊，無法較好地區分。

圖3 12批車前子(S01～S12)、炒車前子(C01～C12)、鹽車前子(Y01～Y12)的UPLC指紋圖譜及其對照指紋圖譜(SR, CR, YR)

4-京尼平苷酸 5-原兒茶酸 13-阿魏酸 14-大車前苷 16-木犀草苷 17-毛蕊花糖苷 18-木通苯乙醇苷B 19-車前草苷D 21-異毛蕊花糖苷 22-野漆樹苷 23-芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷 28-木犀草素 29-芹菜素

2.3.3 層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 將12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計）導入SPSS 26.0，采用組間連接法，以平方歐氏距離為分類依據，進行HCA。結果如見圖6所示，當聚類距離為5時，車前子生品與炮制品可明顯分為2類，但炒車前子和鹽車前子無法較好地聚類，其中C09單獨聚為一類，其余批次的炒車前子和鹽車前子聚為一類，表明炒車前子和鹽車前子樣品相似度較高，與PCA結果基本一致。

2.3.4 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 為篩選車前子、炒車前子及鹽車前子成分差異的主要標志性成分，將12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計）導入SIMCA 14.1，進行OPLS-DA。對各指標的變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值進行大小排列，選擇VIP值＞1的指標作為區分車前子、炒車前子及鹽車前子的主要差異性成分。

建立的車前子、炒車前子及鹽車前子的OPLS- DA模型中，自變量累積解釋能力參數R2為0.985，因變量累積解釋能力參數R2為0.938，預測能力參數2為0.807，均大于0.5，說明所建模型具有較強的解釋率和預測率，得到的OPLS-DA得分圖見圖7，VIP值見圖8。由圖7可知，車前子、炒車前子及鹽車前子呈現明顯的分類聚集現象。由圖8可知，以VIP值＞1為標準共提取10個VIP值，重要程度排名依次為峰21（異毛蕊花糖苷）、24、19（車前草苷D）、26、22（野漆樹苷）、8、4（京尼平苷酸）、27、7、15，以上成分可能是車前子、炒車前子與鹽車前子的差異性標志物。

表5 指紋圖譜峰面積單因素方差分析結果

與車前子比較：*＜0.05；與炒車前子比較：#＜0.05

*< 0.05PS;#< 0.05fPS

表6 主成分特征值及方差貢獻率

圖5 12批車前子及炮制品PCA得分圖

圖6 12批車前子及炮制品HCA圖

2.4 車前子及其不同炮制品體外抗氧化活性測定與分析

2.4.1 測定方法 在預試驗的基礎上，本研究將供試品溶液的質量濃度稀釋成60 μg/mL，按照格銳思試劑盒的規定方法進行測定。

（1）試劑溶液的配制：①試劑1：臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每支加0.49 mL蒸餾水溶解。②試劑2：臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每支加2.86 mL蒸餾水，充分溶解，備用。③ABTS工作液的配制：臨用前根據樣本量按試劑1-試劑2（1∶1）比例混合，避光反應12 h后（2 d內用完），再用無水乙醇稀釋20～30倍備用。

圖7 12批車前子及炮制品OPLS-DA圖

將上述溶液按照表7設計充分混勻后避光靜置6 min，轉移至玻璃比色皿（光徑1 cm）中，于734nm處讀取吸光度（）值，分別記為空白、對照和測定，并計算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率＝1－(測定－對照)/空白

2.4.2 測定結果 12批車前子、炒車前子及鹽車前子的抗氧化活性測定結果見表8。可見，12批車前子及其炮制品均具有清除ABTS自由基的能力，其中炒車前子最強，鹽車前子與炒車前子差異不大，車前子生品清除能力最弱。

2.5 表-里關聯分析

將車前子及其不同炮制品的色度值與峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計）導入SPSS 26.0進行皮爾遜（Pearson）相關性分析，結果見表9。結果表明，除峰21、24、25外，各共有峰峰面積均與*值、*值及*值呈極顯著相關（＜0.01）；其中峰13、14、16、17、19、22、23、26、27、30～34與*值和*值均呈極顯著正相關，其余峰與*值和*值呈極顯著負相關；峰1～12、15、18、20、24、28、29與*值呈極顯著正相關，其余峰與*值呈極顯著負相關；峰19、21、22、25、26與*值呈極顯著正相關（＜0.01），峰24與*值呈極顯著正相關（＜0.05），峰5、9、10與*值呈極顯著負相關（＜0.01），峰1、2、11與*值呈顯著負相關（＜0.05）。總體而言，各共有峰的峰面積值對色度值均有一定影響，對*值的影響較小，對*值、*值影響較大。

圖8 12批車前子及炮制品VIP得分圖

表7 ABTS反應體系

表8 抗氧化活性測定結果

2.6 譜-效關系分析

2.6.1 偏最小二乘回歸法（partial least squares regression method，PLSR）分析[17-18]參考文獻方法，利用SIMCA 14.1軟件，以12批車前子、炒車前子及鹽車前子的ABTS清除率為因變量，共有峰的峰面積經折算扣除水分后為自變量（部分缺失色譜峰峰面積以0計），采用PLSR進行相關性分析，建立的回歸方程為＝0.0591＋0.0952＋0.0013－0.0164＋0.0485＋0.0586＋0.0307＋0.0908－0.0369－0.00710＋0.07511＋0.06612－0.09513＋0.00814＋0.06115＋0.08416－0.00817＋0.04718－0.11219＋0.00720－0.05121＋0.00522＋0.01323＋0.08024＋0.13125－0.06026－0.01827－0.16428－0.06629－0.05230－0.05531－0.09232－0.11433－0.11434＋40 761，得到的標準化回歸系數見圖9。其中，峰1～3、5～8、11、12、14～16、18、20、22～26的回歸系數大于0，表明其與抗氧化活性呈正相關，其余峰的回歸系數為負值，與抗氧化活性呈負相關。

2.6.2 灰色關聯度（grey correlation degree，GRA）分析[19-21]將車前子、炒車前子及鹽車前子共有峰的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計）和抗氧化活性數據進行均值化處理。將處理后的抗氧化活性數據設置為母序列0（），峰面積數據為子序列x（）（為峰號），根據公式（1）計算母序列與子序列的灰色關聯系數。其中為分辨系數，越小，則分辨力越大，一般的取值區間為[0，1]，當≤0.546 3時，分辨力最好，通常取＝0.5。根據公式（2）計算關聯系數的算術平均值，即為關聯度，結果見表10。

當關聯度大于0.8，則表示母序列與子序列關聯度較大；當關聯度介于0.6～0.8，則表示二者關聯度一般；當關聯度小于0.6，則表示二者關聯度較小。由表10可知，峰1～12、15、18～22、24～26、28、29、34與抗氧化活性貢獻作用關聯度較大。與PLSR結果結合分析，可綜合得出峰1～3、5～8、11、12、15、18、20、22、24～26是與車前子及其炮制品的抗氧化活性關聯度較大的正相關色譜峰，即為主要起抗氧化作用的成分，其中峰5為原兒茶酸、峰18為木通苯乙醇苷B、峰22為野漆樹苷，其余色譜峰所對應的物質成分還有待進一步探索研究。

表9 色度值與化學成分(色譜峰)相關性分析

*＜0.05**＜0.01

圖9 PLSR標準化回歸系數圖

表10 關聯度結果

3 討論

3.1 提取和分析條件優化

本實驗分別考察了提取方式（回流、超聲）、提取溶劑（60%、80%、100%甲醇）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）、溶劑用量（25、50 mL）對特征圖譜色譜峰的峰型及峰面積的影響，結果顯示車前子樣品前處理時加入甲醇25 mL超聲1.0 h效果整體較佳。同時，本實驗采用PDA檢測器對車前子及其炮制品中的色譜峰進行全波長掃描，發現京尼平苷酸在238 nm下有最大紫外吸收，原兒茶酸在259 nm有最大紫外吸收，毛蕊花糖苷及的最佳紫外吸收為330 nm，異毛蕊花糖苷、木犀草苷、野漆樹苷、芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷、芹菜素、木犀草素的最大紫外吸收也在330 nm附近；且0～10.5 min和35.5～50 min時，色譜峰在245 nm下較豐富，紫外吸收較強；10.5～35.5 min時，色譜峰在330 nm下較豐富，紫外吸收較強。因此，本實驗最終采用切換波長的方式對車前子及其不同炮制品的UPLC指紋圖譜進行檢測。

3.2 生品與不同炮制品比較

本研究建立了車前子及其不同炮制品的UPLC指紋圖譜，共標定了34個共有峰，其中車前子有19個，炒車前子和鹽車前子有27個。共指認出其中13個主要成分，其中車前子指認了10個，炒車前子和鹽車前子指認了10個。車前子炮制前后色譜峰變化明顯，新增了13個峰，包括原兒茶酸、木通苯乙醇苷B和木犀草素；減少了4個峰，包括大車前苷、木犀草苷和芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷，上述色譜峰可作為車前子生品與炮制品的專屬性鑒別峰。同時，峰8、15僅在部分批次車前子生品中檢出，但在車前子炮制品指紋圖譜中均有呈現，且峰面積遠高于生品（＜0.05），說明峰8、15所表征的化合物亦為受熱后新增的成分，生品中檢出的原因可能為產地干燥過程中，受熱程度稍高產生的。峰27、30、33在所有車前子生品中均有檢出，但僅在部分炮制品指紋圖譜中呈現，且炮制品中上述3個色譜峰的峰面積遠小于生品（＜0.05），說明峰27、30、33所表征的化合物為熱敏性成分，炮制受熱后易分解或轉化，部分炮制品中檢出峰27、30、33，可能為批間炮制程度差異導致。單因素方差分析結果表明車前子及其炮制品中的部分化學成分具有顯著性差異，由PCA、HCA結果可知車前子炮制前后成分含量差異較大，進一步采用OPLS-DA分析可將炒車前子和鹽車前子也區分開，同時提取出10個潛在的差異性標志物。粉末外觀顏色上，通過色差Δ*＞6.0，可輔助識別車前子生品及炮制品。在抗氧化活性研究中，以ABTS自由基的清除率作為抗氧化活性的藥效學指標進行分析，結果顯示車前子炮制后抗氧化活性較生品明顯提高，而不同炮制品間的活性差異不大。

3.3 成分變化分析

車前子炮制后毛蕊花糖苷明顯減少，而異毛蕊花糖苷明顯增加，同時新產生了木通苯乙醇苷B；芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷消失，而芹菜素明顯增加，原因可能與炮制時成分相互轉化有關[22-23]；有研究表明，含有阿魏酸的藥材在體外干燥過程中會與阿魏酸松柏酯相互轉化，在光照或升溫時還會發生降解[24]，阿魏酸峰面積在炮制后顯著降低可能與此有關；原兒茶酸和木犀草素的增加可能是因為炮制時車前子內部溫度升高，藥材中含有的苷類化合物在加熱條件下不穩定分解而成[25]。此外，還有一些化合物含量升高或降低有待進一步研究。

3.4 譜-效關系分析

中藥成分復雜，治療范圍廣，副作用小，是多成分、多靶點、多途徑協同作用的結果，指紋圖譜可以在整體水平闡明中藥的化學成分組成，但不能直接對其功效進行評價。中藥譜效學[25]是研究中藥藥效和指紋圖譜相互關系的學科，可以將化學成分與中藥藥效相結合，對中藥質量的控制和藥效的評價具有重要意義。

PLSR法[24]綜合回歸分析、相關分析和主成分分析，更加準確可靠，具有較高的預測性，可以通過構建科學的回歸模型初步衡量各有效成分對藥效的貢獻程度；灰色關聯分析[25]是研究2個因素變化趨勢相關性的一種統計學方法，2個因素之間的關聯度高，則表示二者的同向化變化趨勢程度高，適合用于分析樣本信息量單一但影響因素復雜的圖譜，在譜效關系中運用廣泛[19,26]。本研究采用PLSR和灰色關聯分析相結合的方法，成功建立了車前子及其炮制品UPLC指紋圖譜與其抗氧化活性的譜效關系，結果顯示有11個峰代表的化學成分與車前子及其炮制品的抗氧化活性關聯較大，即主要具有抗氧化作用，其中3個峰分別為原兒茶酸、木通苯乙醇苷B和野漆樹苷，文獻研究也表明，這3個成分均具有較好的抗氧化活性[27-29]，其余峰所代表的化學成分還需要進一步研究。

本研究建立車前子炮制前后的UPLC指紋圖譜，并結合色度值和抗氧化活性，明確了車前子生品及其不同炮制品的顯著差異點，為車前子及其不同炮制品的鑒別及質量分析提供較科學、全面的判斷；同時結合譜效關系研究，明確了車前子及其炮制品抗氧化作用的物質基礎，可為車前子的炮制機制研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on chromaticity value, UPLC fingerprint and antioxidant activityofSemen and its different processed products

CHENG Yu-jie, QIU Cai-yue, HONG Wan-min, LU Peng-xin, WANG Kai-dong, XU Jie, ZHANG Zhi-peng

Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd., Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule, Foshan 528244, China

To analyze the difference of fingerprint, chromatic value and antioxidant activity of Cheqianzi (, PS) and its different processed products, and explore the spectrum-effect relationship between the chemical components and antioxidant effects.The chromaticity value were determined by spectrophotometer, the fingerprint of PS and its different processed products were established by UPLC, and the antioxidant activity were determined by ABTS method. The similarity evaluation, variance analysis, principal component analysis (PCA), cluster analysis, and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) were used to analyze the difference of PS and its different processed products; and the partial least-square method regression (PLSR) and grey correlation analysis (GRA) method were used to explore the spectrum-effect relationship between the chemical components and the antioxidant of PS and its different processed products.The established UPLC fingerprint of PS has calibrated 19 common peaks, while 27 common peaks were calibrated in fried PS (fPS) and salt-processed PS (spPS). A total of 34 chromatographic peaks were calibrated and 13 of them were identified. Multivariate statistical analysis showed that there were obvious differences between PS and its different processed products. PCA and HCA divided the raw and processed products of PS into two categories, and OPLS-DA screened 10 differential marker components. The chromaticity value Δ*of PS and its different processed products was greater than 6, making it visually distinguishable, but the color difference among different processed products was not obvious. The results of antioxidant activity showed enhanced antioxidant effect of PS after processing, with no significant difference among different processed products. Correlation analysis indicated that the peak area values of common peaks had a certain impact on chromaticity values, with a smaller impact on*values and a greater impact on*and*values. PLSR and GRA analysis showed that the chemical constituents represented by 11 peaks were significantly related to the antioxidant of PS and its different processed products, including protocatechuate, calceorioside B and rhoifolin.The UPLC fingerprint established in this study, as well as the determination method of chromaticity value and antioxidant activity, can be used for the identification and quality analysis of PS and its different processed productsThe study of the spectrum-effect relationship between fingerprint and antioxidant activitycan provide a reference for the study of the processing mechanism of PS

; processing; UPLC; fingerprint; chromatic value; antioxidant activity; spectrum-effect relationship; ABTS method; principal component analysis; hierarchical cluster analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; grey relation analysis; isoacteoside; plantainoside D; rhoifolin; geniposidic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)20 - 6657 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.010

2023-04-28

國家工信部2022年產業技術基礎公共服務平臺項目——中藥全產業鏈質量技術服務平臺（2022-230-221）

程鈺潔（1998—），女，漢族，學士，初級中藥師，從事中藥及中藥配方顆粒質量標準研究。Tel: 13226546740 E-mail: 2496773973@qq.com

通信作者：張志鵬（1990—），男，漢族，碩士，副主任中藥師，從事中藥及中藥配方顆粒質量標準研究。Tel: 15919328456 E-mail: zhangzp0909@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]