靚竹彩葉形成的細胞學以及光合色素*

徐薪璐 蔡 鷗 趙婉琪 呂 卓 姚文靜 李 龍 林樹燕

（1. 南京林業大學 南方現代林業協同創新中心 南京 210037；2. 南京林業大學竹類研究所 南京 210037；3. 南京林業大學生物與環境學院 南京 210037）

葉是植物進行光合作用的重要器官。彩葉植物是長時間內葉片呈現如紫色、金色、紅色、條紋等非綠色的植物（何冰，2006），彩葉植物在葉片生長過程的某個階段會出現變色期，這種葉色變化與葉綠素含量、葉綠體發育程度有關。葉綠素代謝是一個復雜的過程，中間任何一個過程受抑制均會引起葉綠素的大量累積或降解從而引起葉色變異。目前，關于彩葉植物葉色呈色機制的研究多集中于銀杏（Ginkgo biloba）（王改萍等， 2020）、 紫葉李（Prunus cerasifera）（高艷等，2014）、金葉女貞（Ligustrum vicaryi）（鄭健等，2012）、雞爪槭（Acer palmatum）（蔡雪雁等，2015）、槭樹（Acer pseudosieboldianum）（姜楠南等，2013）等較為常見的彩葉植物上，也有一些研究從分子水平研究彩葉產生的機制，如楊樹（Populus）中AP3的過表達誘導葉片衰老并降低葉綠素含量（Duet al.，2022）。Zhou等（2022）在綠白葉觀賞羽衣甘藍（Brassica oleracea）中鑒定出PSBQ、LHCB1.3、LHCB2.4和HSP70是葉綠體形成的關鍵基因（Zhouet al.，2022）。

許多觀賞彩葉竹種特點為全綠色葉片上出現黃色或白色條紋。 楊海蕓（2015）在花葉矢竹（Pseudosasa japonicaf.akebonosuji）中發現ELIPs基因參與調控葉綠體發育，抑制色素合成。黃滔等（2016）對 白 紋 陰 陽 竹（Hibanobambusa tranquillans‘Shiroshima’)、 鼓 節 竹 （Bambusa tuldoides‘Swolleninternode’）、花稈早竹（Phyllostachys violascens‘Viridisulcata’）和美麗箬竹 （Indocalamus decorus）4 個觀賞竹種的光合特性進行了比較研究，探究各竹種葉片的光合能力。陳凌艷等（2017）對銀絲竹（Bambusa multiplex‘Silverstripe’）不同葉色葉片的光合色素含量、葉綠素合成前體相對含量及葉片顯微和超微結構研究發現，葉綠素合成受阻、葉綠體發育異常是葉色變異產生的原因。徐胤（2020）在白化類型的綠竹（Bambusa oldhamii）中發現PIFs 通過抑制PEP 的轉錄活性，下調參與葉綠素生物合成相關基因，導致綠竹中的葉綠體發育異常，進而葉綠素合成受阻。

靚竹（Sasaella glabra‘Albostriata’）為禾本科（Poaceae）竹亞科（(Bambusoideae)）東笆竹屬竹種，高度20~40 cm，直徑0.1~0.2 cm，葉片具3~5 條黃色條紋，為優良地被類觀賞植物。1984 年周芳純從日本引至南京林業大學，目前已廣泛分布在我國華東、華北地區。該種可作為竹坪、林下綠化或作為盆栽觀賞竹，還可用于礦區土壤修復，山坡綠化，避免水土流失。靚竹葉色在葉片發育過程中形成，且能夠穩定遺傳。目前，對于彩葉竹種葉色形成原因的研究都集中在成熟功能葉，而對于葉片發育過程中葉色形成的研究尚未見報道。鑒于此，本研究以不同發育階段的靚竹葉片為材料，通過比較各時期葉片顯微結構、超微結構、光合色素以及葉綠素合成前體物質，同時對成熟功能葉的黃區和綠區的表皮結構、細胞內部結構、光合色素進行比較，分析竹葉內部結構形態及光合色素合成在不同時期及不同葉色分區的差異，為探討靚竹彩葉形成機制提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需靚竹葉片于2022 年4—5 月采自南京林業大學白馬苗圃繁育基地(119°10'35″ E，31°36'19″ N)。葉片按照生長發育及葉色變化特征分為S1、S2、S3和S4 4 個時期（表1，圖1），成熟功能葉根據葉色分為黃區(yellow stripe，YS)和綠區(green stripe，GS)。靚竹集中于4—6 月抽枝展葉。

圖1 靚竹不同發育時期葉片發育過程中形態Fig. 1 Appearance of morphological characteristics at different developmental stages of S. glabra ‘Albostriata’

表1 靚竹葉片不同發育時期特征描述Tab. 1 Description of leaf characteristics at different developmental stages of S. glabra ‘Albostriata’

1.2 試驗方法

1.2.1 靚葉片發育過程中內部結構觀察 1）光學顯微鏡觀察顯微結構：分別取靚竹葉片4 個發育時期各15 片， 選取S1、 S2 時期的葉片放入50% FAA（formaldehyde-acetic acid-alcohol）固定液中，S3、S4 時期的葉片放入70% FAA 固定液中，固定2 天以上，待用，每個時期樣品至少3 個生物學重復。固定后取S1、S2 時期的葉片中段、S3、S4 時期的葉片及S4 時期葉片YS、GS 區切取中部以主脈為中軸10 mm×5 mm 大小區域，置于25% HF（氫氟酸）中軟化48～72 h。采用常規石蠟切片技術（李正理，1987）切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，Leica RM 2255 自動切片機切片(厚度為 8 μm) ，番紅—固綠雙重染色法染色，中性樹膠封片，Leica DM 2500 光學顯微鏡選取成熟葉片沿主脈左右對稱視野拍照觀察。Leica LAS X 軟件對葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、梅花狀細胞長度、指狀臂細胞長度、梭形細胞空隙長度、泡狀細胞長度、主脈面積、側脈（1 級脈、2 級脈）面積進行測量。每個時期的葉片選取10 個切片，每個切片選取10 個視野觀測，每個時期測量至少50 個數據。此外，將靚竹S4 時期葉片的黃綠條紋區域分開分別放入PBS 溶液中固定，制作方法參考張書敏等（2015），將制作好的徒手切片置于Leica DM 2500 光學顯微鏡下觀察，利用Leica LAS X 軟件拍照，黃綠兩區各選取10 個視野觀測。

2）透射電鏡觀察超微結構：分別取靚竹的4 個時期葉片各3 片，其中已經出現條紋葉色的S2、S3、S4時期要將黃區和綠區分開取樣，避開葉脈切取葉片的三角形葉塊（2 mm×2 mm，底×高），置于2%戊二醛混合固定液(pH 7.0) 中，抽氣使葉片下沉，4 ℃下固定24 h，每個樣品至少設置3 個重復。固定后參考 Hall等（1991）的方法，磷酸緩沖液沖洗 3 次后，乙醇逐級脫水，丙酮置換，LR. white 樹脂包埋，Leica EM UC6 超薄切片機切片（切片厚度約為 90 nm），醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在電子透射電鏡 JEM-1400 下拍照觀察。

3）掃描電鏡觀察超微結構：取新鮮S4 時期葉片洗凈，將葉片區別YS 和GS 區修剪成0.5 cm × 0.5 cm的小塊于FAA 固定液中固定24 h，脫水后真空鍍膜，在PHILIPS XL30 ESEM 掃描電鏡下觀察表皮系統。

1.2.2 光合色素含量的測定 對各發育時期葉片及S4 時期葉片的YS、GS 區進行光合色素含量測定。提取方法參考 Hodgins 等（1986）的方法，每個樣品3個重復。按照下列公式計算葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

式中：Ca、Cb、C(x+c)分別代表葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量(mg·g-1)，A為吸光值，V為提取液總體積(mL)，若稀釋則乘以相應的倍數，W為葉片鮮質量(g)。

1.2.3 葉綠素合成前體物質的測定 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)含量的測定：根據Dei（1985）的方法稍加改動，取混合液2 mL 加入2 mL顯色液（Ehrlich-Hg 試劑），黑暗處理15 min 后測定553 nm 處的OD 值。并按下述公式計算ALA 摩爾濃度：A=ε·C·L，其中A為吸光值，ε 為摩爾消光系數（ALA 的含量以553 nm 處的摩爾消光系數7.2×104L·mol-1cm-1計算），C為摩爾濃度，L為測試液的液層厚度。

卟啉原（porphobilinogen, PBG）含量的測定參照Bogorad（1962）的方法稍加改動，取混合液2 mL，加入2 mL 顯色液（Ehrlich-Hg 試劑），黑暗中放置15 min 后，測定553 nm 處的OD 值。

按下述公式計算PBG 摩爾濃度：A=ε·C·L，其中A為吸光值，ε 為摩爾消光系數（PBG 的含量以553 nm處的摩爾消光系數6.1×104L·mol-1cm-1計算），C為摩爾濃度，L為測試液的液層厚度。

尿卟啉原III（UrogenIII）和糞卟啉原III（CoprogenIII）含量的測定參照Bogorad（1962）的方法稍加改動，按下述公式計算摩爾濃度：A=ε·C·L，其中A為吸光值，ε為摩爾消光系數（UrogenIII 含量以405.05 nm 處的摩爾消光系數5.48×105L·mol-1cm-1計算；CoprogenIII 含量以399.5 nm 處的摩爾消光系數4.89×105L·mol-1cm-1計算），C為摩爾濃度，L為測試液的液層厚度。

原卟啉IX（ProtoIX）、鎂原卟啉IX（Mg-ProtoIX）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的測定參照Hodgins 等（1986）的方法，根據下列公示計算原卟啉IX（ProtoIX）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的含量：

式中，E、F分別為摩爾消光系數、OD 值，下標為nm 值。

鎂原卟啉IX（Mg-ProtoIX）的相對含量以E400F595值直接表示。

1.3 數據處理

使用SPSS 19.0 進行數據統計和方差分析，利用Graphpad Prism 9 作圖，Microsoft PowerPoint 作表，圖表中所有數據值均為重復測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 靚竹不同發育時期葉片內部細胞結構觀察

靚竹葉片各發育時期內部細胞顯微結構變化如圖2a–e 所示。不同發育時期的葉片內部顯微結構差異較大。S1 時期葉片卷曲未露出葉鞘，因此整個葉片嫩黃白色，此時期的葉片內部細胞界限不清晰，細胞核大，組織分化程度低，維管系統初步分化但無明顯的主側脈之分，上下表皮無明顯差異（圖2a）。S2 時期葉片卷曲、剛露出葉鞘，初步出現條紋葉色，此時期的葉片內部細胞相對清晰，細胞壁加厚，細胞核近似圓形，組織分化程度較明顯，維管系統分化出明顯的1 級側脈和2 級側脈，主脈和1 級側脈的差異不顯著，下表皮出現乳突結構，上下表皮差異顯著（圖2b）。S3 時期葉片由卷曲逐漸展平，葉片出現穩定的條紋葉色，此時期葉片內部細胞界限清晰，細胞壁加厚，組織分化程度高，可觀察到明顯的梅花狀細胞、指狀臂細胞、泡狀細胞和梭形細胞，維管束完整，有清晰的主側脈之分，上下表皮差異顯著，下表皮乳突結構清晰（圖2c）。S4 時期為功能葉，葉片展平，細胞結構與S3 時期類似（圖2d–e）。功能葉綠區（圖2d）和黃區（圖2e）葉片顯微結構差異較大，區別在于綠區上表皮附近的指狀臂細胞有2~3 層且結構清晰、排列緊密；而黃區葉肉細胞中僅有1 層清晰可見的指狀壁細胞緊貼上表皮，其余葉肉細胞無明顯指狀臂細胞和梅花狀細胞的區別。葉片黃區和綠區著色程度不同，綠區細胞較易染色。隨著發育過程的推進，葉片厚度、上下表皮、葉肉厚度均不斷增厚（表2），葉脈面積不斷增加，前期主脈和1 級側脈差異較小，S3 到S4 時期主脈發育速度最快（表3）。

圖2 靚竹葉片不同發育時期內部細胞結構觀察Fig. 2 Microstructure comparison of S. glabra ‘Albostriata’ in different stages

表2 靚竹葉片不同生長階段顯微結構指標（一）①Tab. 2 Leaves microstructure parameters in S. glabra ‘Albostriata’

表3 靚竹葉片不同生長階段顯微結構指標（二）①Tab. 3 Leaves microstructure parameters in S. glabra ‘Albostriata’

2.2 靚竹不同發育時期葉片超微結構觀察

靚竹S1 時期葉肉細胞較小，形狀相對規則，細胞排列緊密，未出現梅花細胞和指狀臂細胞的分化（圖3a1）；細胞壁薄；細胞核大質濃，成分生細胞狀態（圖3a2）；線粒體數目較多，多靠近細胞壁分布；細胞質中散布核糖體和高爾基體等細胞器（圖3a3）；未出現明顯的葉綠體結構，有較大的淀粉粒出現在原質體中(圖3a4)。

圖3 靚竹不同發育時期葉片超微結構觀察Fig. 3 Ultrastructure comparison of S. glabra ‘Albostriata’ in different stages

靚竹葉片S2 期初步出現條紋，綠區各類型細胞壁較S1 時期加厚；葉肉細胞開始出現梅花狀細胞和指狀臂細胞的初步分化（圖3b1）；多數細胞內有較大面積的空洞，部分發育中的細胞內部細胞核大質濃；細胞器較少；原質體開始向葉綠體轉化，靠近細胞壁分布，但葉綠體數量較少且內部結構不清晰，少數類囊體片層垛堞成基粒，基粒數量少且分散（圖3b2）。同時期黃區細胞結構如圖3b3，此時期細胞壁較S1 時期加厚；葉肉細胞開始出現梅花狀細胞和指狀臂細胞的初步分化；相較于綠區，更多細胞內有較大面積的空洞，部分發育中的細胞內部細胞核大質濃；線粒體飽滿；原質體靠近細胞壁分布，無明顯葉綠體結構（圖3b4）。

靚竹葉片S3 期綠區葉肉細胞多分化為梅花狀，細胞壁加厚，細胞核不明顯，細胞空腔面積小，無明顯細胞器（圖3c1）；質體靠近細胞壁附近分布，葉綠體數量多且內部結構清晰，內部有小型淀粉粒和嗜餓顆粒，嗜餓顆粒分散分布，類囊體垛疊層數多，基粒間距大、片層多（圖3c2）。同時期黃區細胞如圖3c3 所示，同樣觀察到細胞壁加厚、細胞核不明顯的現象，相較于S2 時期黃區細胞空腔面積縮小，細胞器減少，葉綠體數量少且發育不完全，內部有嗜餓顆粒集中分布（圖3c4）。

如圖3d1 所示，S4 綠區的葉肉細胞形狀清晰，完全分化為梅花狀結構和指狀臂結構，細胞內無明顯空腔，細胞壁加厚，細胞核不明顯，無明顯細胞器；質體靠近細胞壁附近分布，葉綠體數量多且面積大，基粒數量多且排列密集，內部有嗜餓顆粒分散分布(圖3d2)。黃區細胞中可觀察到大面積空腔，與綠區相似，同樣出現細胞壁加厚，細胞核不明顯，無明顯細胞器的現象(圖3d3)；質體靠近細胞壁分布，無清晰葉綠體結構，淀粉粒大且數量多，嗜餓顆粒集中分布（圖3d4）。

2.3 靚竹葉片YS 和GS 的徒手切片及掃描電鏡觀察

通過徒手切片可以看出黃區YS 及綠區GS 的葉綠體數量以及分布有明顯差別。黃區的葉綠體數量明顯少于綠區。綠區的葉綠體在上下表皮間葉肉細胞中均有分布（圖4a），黃綠交界區域的葉綠體主要集中分布在下表皮附近的梅花狀細胞中，靠近上表皮的指狀壁細胞中葉綠體分布很少（圖4b），而黃區（圖4c）葉肉細胞呈黃色，無明顯葉綠體分布。

圖4 靚竹分區徒手切片觀察Fig. 4 Microscopic structure of hand sectioning of different stripes of S. glabra ‘Albostriata’

顯微結構觀察（圖5），與石蠟切片類似，靚竹葉片的黃區(圖5i、l)及綠區(圖5c、f)的葉表皮及橫切面結構差異明顯，綠區葉片厚于黃區葉片，且綠區葉片內部細胞排列緊密。二者上表皮(圖5a、g)均較為平整，能夠清晰地分辨出葉脈部分和脈間部分，少有附屬物；下表皮(圖5b、h)均著生密集的乳突，綠區的乳突密度較黃區的乳突密度大；乳突有大乳突和小乳突兩種類型，大乳突為三角狀，小乳突為顆粒狀，大乳突體積約為小乳突的10 倍，少數區域有須狀刺撓著生(圖5d、j)；二者在下表皮的顆粒狀乳突中有氣孔分布(圖5e、k)，且氣孔形狀類似，均為狹長橢圓形，氣孔兩端各有2 個小乳突，區別在于綠區氣孔數目較黃區多。

圖5 靚竹葉片分區的表皮及葉片橫切面的超顯微結構觀察Fig. 5 Ultrastructure of epidermis and transsections of S. glabra ‘Albostriata’ in different stripes

2.4 靚竹葉片光合色素的測定

光合色素是導致葉色變化的重要因素，提取靚竹不同時期葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素，由表4 可知，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素的含量均隨著發育而逐漸增加。S1、S2 期葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素含量較低，且差異不顯著（P>0.05），發育到功能葉差異較為顯著（P<0.05）。

表4 靚竹不同時期葉片光合色素含量變化①Tab. 4 Changes of leaves photosynthetic pigment content during different stages of S. glabra ‘Albostriata’

將靚竹葉片分為黃區和綠區分別測定各區光合色素，并與靚竹完整葉片進行比較分析，由表5 可知，葉片黃區及綠區各光合色素均存在顯著差異（P<0.05）。綠區的各光合色素含量均高于黃區，綠區的葉綠素含量是黃區葉綠素的10 倍左右，類胡蘿卜素是葉綠素的9 倍左右，綠區中葉綠素和類胡蘿卜素的比例為3.542，高于黃區的2.952，說明綠區中影響葉色的主要原因是葉綠素的積累。

表5 靚竹S4 時期葉片光合色素含量分區對比①Tab. 5 Photosynthetic pigment content comparision in different stripes at S4 stage of S. glabra ‘Albostriata’

2.5 靚竹葉片葉綠素合成前體物質的測定

對靚竹葉片不同時期的前體物質相對含量進行比較，以功能葉S4 時期為標準，結果如圖6 所示，除尿卟啉原III（UrogenIII）之外的物質都是隨著發育過程推進逐漸積累的。UrogenIII 在靚竹葉片發育前期（S1、S2）顯著高于葉色穩定的后期（S3、S4），并且相較于糞卟啉原III（CoprogenIII）的相對含量，原卟啉IX（Proto IX）各時期相對含量驟減。以上結果說明，隨著靚竹葉片條紋的出現，UrogenIII 向CoprogenIII 的轉化增加，CoprogenIII 向Proto IX 的轉化過程受阻從而造成CoprogenIII 的大量積累。由此推測，UrogenIII和CoprogenIII 是靚竹葉片發育過程中葉綠素合成途徑中的關鍵物質。

圖6 靚竹葉片不同前體物質在不同發育階段的相對含量Fig. 6 Relative concentration of different precursor material of chlorophyll during different stages of S. glabra ‘Albostriata’

3 討論

3.1 解剖結構與彩葉形成的關系

Hara（1957）認為彩葉葉片表面具有不同顏色，形成規則圖案或不規則斑點或斑塊。Sheue 等（2012）將彩葉分為5 種類型：葉綠素型、色素型、表皮型、空腔型和附屬物類型，而其中表皮型、空腔型和附屬物類型的彩葉屬于結構型彩葉。葉片結構很大程度上會引起彩葉的形成，影響因素主要是葉片的表皮形態和葉肉細胞排列方式具有差異。葉肉細胞排列疏松，細胞間隙大導致光反射，從而影響葉色。銀色葉片葉色變異歸因于表皮細胞和柵欄細胞之間存在廣泛的細胞間隙（Burgeret al.，1998；Hochet al.，1980）。Tsukaya等（2004）發現廣西落檐（Schismatoglottis calyptrata）葉片的斑塊葉色是由于葉肉細胞松散、表皮和柵欄組織之間有不規則的細胞間隙造成；王振興等（2016）的研究認為狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikt）這種彩葉變異與彩葉葉肉細胞結構更為疏松從而導致的光反射有關；尖萼報春苣苔（Primulina pungentisepala）白葉類型葉肉細胞的柵欄組織細胞呈白色球形且排列松散（Chenet al.，2022）。在本研究中，通過對靚竹不同發育時期及成熟功能葉分區的葉片顯微結構觀察中發現，隨著發育過程不斷推進，各細胞及葉脈面積不斷增大，細胞界限逐漸清晰；葉片綠區的表皮細胞與葉肉細胞、葉肉細胞間均排列緊密，黃區葉肉細胞內部不易被染色，且分化程度低，黃區指狀臂細胞層數少于綠區，因此，靚竹彩葉的形成與指狀臂細胞的分化和排列方式有關。

由于表皮細胞的形狀可將光聚焦到色素上（Zhanget al.，2009）以及葉片表皮上的腺毛和蠟質等附屬結構，從而來影響葉色(Reicoskyet al.，1978；Karabourniotiset al.，1999)。禾本科植物的葉表皮形態結構被認為在研究種的分類和系統關系方面具有重要的價值(陳志強等，1987；Bothmeret al.，1993)，稻型葉片表皮系統具有上表皮有長短細胞之分、葉脈帶常有微毛或兼有刺毛、下表皮乳突密集等特征（張志耘等，1998）。靚竹葉片屬于稻型葉片表皮系統，本研究在對靚竹不同葉色分區進行掃描電鏡觀察，可以觀察到靚竹葉片上表皮均較為平整、葉脈清晰、下表皮均著生密集的乳突，乳突有三角狀和顆粒狀兩種，氣孔兩端各附著2 個小乳突。但是不同葉色之間的表皮結構差異不顯著，說明靚竹葉色變異受到表皮的影響較小。

植物組織的質地和顏色可能受到組織中色素濃度和分布的影響（Neillet al.，1999；Gouldet al.，2000）。通過對不同葉色區域的葉片進行徒手切片，觀察到綠區葉片葉綠體在靠近上下表皮的葉肉細胞中均有分布，而黃區葉片葉綠體靠近下表皮分布。綜上，可以推斷在靚竹葉片中，葉綠體在葉肉細胞中的分布情況會對葉色產生影響，而表皮、葉片內部細胞排列方式并非決定葉色變異的因素。

3.2 彩葉形成過程中葉綠體發育與葉綠素合成的變化

葉色變異與光合色素有著密切聯系，光合色素的含量及組成均會對葉色的形成產生影響（陳星旭，2009; 邱義蘭等，2010）。光合色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，葉綠素又包括葉綠素a 和葉綠素b，其中葉綠素a 呈黃綠色，葉綠素b 呈藍綠色。葉綠素位于葉綠體上，葉綠體發育異常或結果受損均會引起葉色變異（Yuet al.，2016）。葉綠體發育進程與葉片發育大致同步，葉片發育的過程也是葉色逐漸加深的過程。王嘯晨（2012）在對4 種彩葉竹種葉片研究中發現，白紋陰陽竹和白紋椎谷笹的葉肉細胞則呈現基粒片層降解、產生大量嗜鋨顆粒等不同程度的葉綠體變異。白紋陰陽竹、白紋椎谷笹、菲黃竹和黃條金剛竹葉片呈現不同顏色可能由光合色素合成途徑受抑制引起；成敏敏（2018）研究花葉矢竹不同復綠階段葉片葉綠體超微結構和光合色素，確定葉綠素累積是使花葉矢竹白葉復綠的原因，并且可觀察到復綠過程中葉綠體內膜系統由無序泡狀到有序的片層和基粒類囊體排列；蘇佳露等（2020）研究了6 個彩葉竹種在不同分區的葉色與光合色素，以及與細胞顯微超微結構之間的關系，證明彩葉葉片不同葉色的呈現與部分細胞內葉綠體發育異常和光合色素含量較低有關。本研究中，靚竹葉片黃區細胞及葉綠體發育異常，表現為細胞空腔大、葉綠體數量少且內部結構不清晰；綠區葉肉細胞中的葉綠體隨發育進程不斷趨于成熟，這與蘇佳露等（2020）的研究結果類似。在光合色素上，各時期光合色素的含量隨著發育而逐漸積累，功能葉的黃區及綠區在光合色素的含量上也有顯著差異，這也與蘇佳露等（2020）的研究結果類似。說明葉色是光合色素含量的直觀呈現，且葉片在發育過程中，光合色素處于不斷積累的狀態，葉綠素的積累是影響葉色的最主要原因。

在高等植物葉片中，葉綠素是由L-谷氨酸-tRNA經過一系列復雜的反應合成的。這一過程中ALA 的合成和鎂原卟啉IX 的合成對于葉綠素合成速度有限制作用，屬于葉綠素合成途徑中的關鍵步驟。葉綠素合成途徑中需要20 多個基因編碼的15 種酶的參與(Beale， 2005)。在合成過程中，其中任何一個基因發生突變都會導致合成途徑中的中間產物大量積累，阻礙葉綠素的合成。目前有一些對于發生葉色變異的葉片其葉綠素合成途徑的研究，陳凌艷等（2017）的研究中證明銀絲竹葉片呈現出白色性狀的原因在于其葉片葉綠素生物合成過程受阻，受阻點位于CoprogenIII至ProtoIX 的轉化過程中；楊熒等（2019）推測安吉白茶（Camellia sinensis‘Baiyel 1’）由于葉綠素合成階段中Mg-proto IX 合成葉綠素a 時受阻，使Mg-proto IX在白化葉片中積累，使白化葉中Mg-proto IX 含量高于返綠葉；徐胤（2020）在對綠竹白化葉片的研究中證明，綠竹白化變異類型的葉綠素合成途徑在合成ALA 之前就可能受到了阻礙；黃婧等（2021）證明復綠期黃金枸骨（Ilex×attenuata‘Sunny Foster’）葉片的葉綠素積累可能起始于UrogenIII 的增加。在對葉片光合色素的研究中發現了靚竹葉片中光合色素的含量是隨著發育進程不斷積累的。為了探究這一現象出現的原因，尋找葉綠素合成途徑中的差異，故對于葉綠素合成途徑中的前體物質進行測定，并發現靚竹葉片多個發育時期在CoprogenIII 向Proto IX 轉化過程中受到阻礙，出現了CoprogenIII 的大量積累，另外在彩葉功能葉中除UrogenIII 之外的物質都是隨著發育過程推進逐漸積累，可推測UrogenIII 和CoprogenIII 對于靚竹葉片發育進程中的葉色變異有重要影響，CoprogenIII 的合成受阻或CoprogenIII 至ProtoIX 的轉化受阻均會導致葉色變異，這與陳凌艷等（2017）的研究結果一致。

3.3 類胡蘿卜素含量對于葉色的影響

除葉綠素之外，類胡蘿卜素及葉黃素的大量積累也可以引起葉色變黃。葉片通過合成類胡蘿卜素和葉黃素來實現保護作用。之前研究中一些金葉植物葉片黃化與類胡蘿卜素的含量增加有關。Li 等（2018）在銀杏中發現上調基因ZISO、ZDS和LCYE促進類胡蘿卜素的積累，類胡蘿卜素與葉綠素比率的變化是導致突變株葉片呈金色的主要因素（Liet al.，2018）。但在Tian 等（2021）的研究中發現金葉楊突變體JHY 的葉綠素和類胡蘿卜素含量低于原種L22025，但類胡蘿卜素/葉綠素比值高于L22025。這兩種色素之間的差異是葉片顏色變化的原因之一。本研究經對比黃區及綠區的光合色素含量，未觀察到黃區類胡蘿卜素含量增高，黃、綠兩區的葉綠素：類胡蘿卜素比例基本在3∶1 左右浮動，綠區比值高于黃區，這與Tian 等（2021）的研究結果類似。說明在靚竹葉色變異中，葉綠素的含量更具有決定性，而非類胡蘿卜素。

4 結論

靚竹葉片發育過程中，葉片厚度逐漸增大，葉片表皮細胞、葉肉細胞、葉脈均不斷增大。光合色素含量逐漸積累，UrogenIII 和CoprogenIII 是靚竹葉片發育過程中葉綠素合成途徑中的關鍵物質。黃區葉片葉肉細胞空腔大且葉綠體發育異常，指狀臂細胞層數少，綠區葉片隨發育程度葉綠體數量逐漸增加，葉綠素含量積累。靚竹條紋葉色的出現與指狀臂細胞分化程度低、葉綠體發育異常以及葉綠素合成受阻有關。