MALDI-TOF MS在豬、牛、羊源性成分檢測(cè)中的應(yīng)用

沈麒亮，方志娟，李曉芹，張雪婧，王偉

蘇州市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（蘇州 215104）

食品摻假作為一種食品欺詐的行為，是影響食品安全的一個(gè)重要方面[1-2]。如今豬肉冒充牛肉等現(xiàn)象越來(lái)越多，市民對(duì)肉類摻假的問(wèn)題也越來(lái)越重視[3-4]。不同肉類具有不同的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和口感，各種肉類之間也存在一定價(jià)格差異，肉類摻假往往是商家為謀取更多的利益的一種手段。因此，旨在提出準(zhǔn)確有效的方法加強(qiáng)對(duì)肉類的摻假鑒別，以維護(hù)良好的市場(chǎng)環(huán)境[5-7]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的方法被應(yīng)用于肉類摻假檢測(cè)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[8-9]、近紅外光譜[10-12]、酶聯(lián)免疫分析法[13]、核磁共振技術(shù)[14-15]、電子鼻結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析技術(shù)[16-18]等。這些方法雖然準(zhǔn)確可靠，但同時(shí)也存在著操作復(fù)雜、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)。基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）作為一門新興技術(shù)，適用于測(cè)定蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)等大分子[19-21]。因其前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于微生物、乳制品、水產(chǎn)品、食用油、蜂蜜等各領(lǐng)域[22-27]。試驗(yàn)采用MALDI-TOF MS技術(shù)構(gòu)建出不同畜肉蛋白質(zhì)分子指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)豬、牛、羊3種不同畜肉進(jìn)行高效鑒別。此次建立的豬、牛、羊源性成分鑒定系統(tǒng)，具有快速、準(zhǔn)確、低成本、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，可被廣泛應(yīng)用于肉類摻假檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑[融智生物科技（青島）有限公司]；磷酸鹽緩沖液（PBS）。

畜肉樣品（54批次豬、46批次牛、50批次羊，均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

QUANTOF 1質(zhì)譜儀[融智生物科技（青島）有限公司]；AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；BagMixer 400拍打式均質(zhì)器（法國(guó)Interscience公司）；IQ7000超純水機(jī)[密理博（中國(guó)）有限公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 畜肉樣品蛋白質(zhì)的提取

稱取25 g樣品（分別為豬肉、牛肉、羊肉），用水清洗后放入無(wú)菌袋中，倒入225 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）；在拍打式均質(zhì)器上以4次/s的速度，均質(zhì)2 min；將上清倒入50 mL離心管中，于4 ℃冰箱，靜置8 h。從50 mL離心管中取上清，即得肉浸液，可放入-80 ℃冰箱備用。取2 μL肉浸液，加18 μL SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑，混勻，滴加2 μL于靶點(diǎn)正中，干燥，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集

將制備好的樣品靶通過(guò)檢測(cè)口放入質(zhì)譜儀內(nèi)部托盤并固定。啟動(dòng)激光系統(tǒng)提供脈沖激光，打擊樣品靶點(diǎn)，在質(zhì)荷比2 000～35 000范圍內(nèi)掃描和采集數(shù)據(jù)。采用儀器自帶分析軟件對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行平滑、對(duì)齊、歸一化等處理。

1.3.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

將采集到的150組MALDI-TOFMS數(shù)據(jù)導(dǎo)入Chem Pattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件[科邁恩（北京）科技有限公司]，篩選獲得共有模式，對(duì)豬、牛、羊3種畜肉的差異性進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬、牛、羊動(dòng)物源性成分指紋圖譜的建立

對(duì)150批次3種不同類型的畜肉進(jìn)行測(cè)定，采集MALDI-TOF MS譜圖并進(jìn)行平滑、對(duì)齊、歸一化等處理，豬、牛、羊3種不同類型畜肉質(zhì)譜圖如圖1所示。

圖1 3種不同類型畜肉質(zhì)譜圖

2.2 指紋圖譜相似度分析

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Chem Pattern軟件進(jìn)行分析，樣品圖譜經(jīng)去背景、平滑等規(guī)范化前處理，以保留時(shí)間對(duì)樣品圖譜進(jìn)行校正。采用歐氏距離算法分析相似度，可以看出豬、牛、羊3種不同類型畜肉能夠歸屬到各自類別，同一類型產(chǎn)品距離共有模式的距離相當(dāng)，分離效果較好（圖2）。

圖2 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 指紋圖譜多元統(tǒng)計(jì)分析

多元統(tǒng)計(jì)分析方法常用的有系統(tǒng)聚類分析、主成分分析、偏最小二乘判別分析、自組織映射人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等[28]。系統(tǒng)聚類分析是將一些相似度較高的樣品先聚合為一類，根據(jù)相似程度將不同類的樣品不斷聚合成一個(gè)更大的類，直到所有的樣品都聚合完畢，從而形成一張完整的系統(tǒng)聚類圖，能準(zhǔn)確反映各類之間的親疏關(guān)系[29]。主成分分析是依據(jù)降維思想，損失較少原始信息，直接把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種多元統(tǒng)計(jì)方法[30]。偏最小二乘判別分析是偏最小二乘回歸的一種特殊形式，是對(duì)多元線性回歸模型的拓展分析。自組織映射人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)適用于復(fù)雜體系數(shù)據(jù)的可視化、降維、模式識(shí)別以及數(shù)據(jù)挖掘，它能夠?qū)⑷我饩S數(shù)的原始數(shù)據(jù)在保持拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不變的情況下映射到二維空間內(nèi)。

豬、牛、羊3種不同類型畜肉的系統(tǒng)聚類分析如圖3所示。按照不同對(duì)象之間差異，利用歐式距離函數(shù)作模式進(jìn)行分類，圖3（B）中的顏色代表歸一化法下各個(gè)峰所占的面積百分比。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示，3種不同類型畜肉都能被很好地區(qū)分開(kāi)。該分析方法可直觀觀察每個(gè)樣品中的共有峰在樣本和自變量2個(gè)維度中所形成的聚類模式及其對(duì)聚類結(jié)果的影響，能夠清楚地反映樣本之間的親疏關(guān)系。

圖3 聚類分析結(jié)果

主成分分析及偏最小二乘回歸分析如圖4和圖5所示。3種不同類型畜肉能很好地被分開(kāi)，很少有樣品出現(xiàn)偏離現(xiàn)象，2種不同的分析方法結(jié)果完全相同。圖6自組織映射神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析顯示的樣品位置情況更為直觀，樣品分類結(jié)果與圖4、圖5這2種分析方法結(jié)果完全一致。

圖4 主成分分析圖譜

圖5 偏最小二乘回歸分析圖譜

圖6 自組織映射神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖譜

2.4 化學(xué)模式識(shí)別

將9批次牛肉樣品作為測(cè)試集，采用PLS-DA算法進(jìn)行模式識(shí)別，測(cè)試結(jié)果如表1和圖7所示。可以看出，牛肉樣品全部被正確識(shí)別，誤識(shí)率為0，識(shí)別率為100%。因此，所建立的模型能夠提供一個(gè)穩(wěn)定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確判定所選畜肉的類型。

表1 模式識(shí)別結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖7 PLS-DA模型分類預(yù)測(cè)效果圖

3 結(jié)論

利用MALDI-TOF MS技術(shù)分析豬、牛、羊3種不同畜肉的蛋白質(zhì)譜圖，建立不同畜肉蛋白質(zhì)分子指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)。配合Chem Pattern先進(jìn)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，建立基于蛋白質(zhì)組學(xué)的成分鑒定系統(tǒng)，為豬、牛、羊3種不同畜肉動(dòng)物源性成分的鑒別提供新思路。