火麻仁黃嘌呤氧化酶抑制肽的分離鑒定與分子對(duì)接研究

魏連會(huì)，石杰，張正海，董艷

黑龍江省科學(xué)院大慶分院（大慶 163319）

痛風(fēng)是一種由高尿酸血癥引起的在世界范圍內(nèi)高度流行的疾病。在全球范圍內(nèi)，每年有超過1%的成年人患有痛風(fēng)[1]。體內(nèi)尿酸鹽生成過量或排泄不足，導(dǎo)致高尿酸血癥，男性尿酸含量＞7.0 mg/dL和女性尿酸含量＞6.4 mg/dL，為高尿酸血癥的生化指標(biāo)[2]?？梢酝ㄟ^控制體內(nèi)尿酸和相關(guān)鹽類水平來預(yù)防痛風(fēng)。黃嘌呤氧化酶（XOD）在尿酸代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用而引起了人們的廣泛關(guān)注。因此，研究人員正專注于發(fā)現(xiàn)新的XOD抑制物質(zhì)，來降低尿酸水平[3]。近年來，針對(duì)XOD的藥物在治療高尿酸血癥方面效果顯著，然而在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)觀察到嚴(yán)重的副作用[4]。因此，專注于從食品材料中尋找XOD抑制劑，特別是生物活性肽，作為新的安全替代品具有重要意義。迄今為止，已經(jīng)從乳鐵蛋白、鯊魚軟骨和核桃中獲得了幾種XOD抑制肽[5-6]。

火麻（Cannabis sativaL.）俗稱為大麻，是大麻科大麻屬一年生草本植物，火麻屬低毒大麻，因其四氫大麻酚含量低于0.3%，已不具備毒品利用價(jià)值[7]。目前，許多發(fā)達(dá)國家都在大力開發(fā)利用火麻，尤其是以火麻籽功能食品的研究備受關(guān)注?；鹇樽训牡鞍踪|(zhì)含量為20%～25%，脂類含量為25%～35%，碳水化合物含量為20%～30%，脂溶性維生素含量為10%～15%，并且富含大量的礦物質(zhì)，是重要的營(yíng)養(yǎng)源[8]?；鹇樽训鞍鬃鳛橐环N新型蛋白資源，具有很高的開發(fā)研究?jī)r(jià)值。目前，火麻蛋白已被水解成具有多種生物活性的多肽，包括降血壓作用、α-葡萄糖苷酶抑制作用和抗氧化作用等[9-11]。然而，關(guān)于火麻黃嘌呤氧化酶抑制肽的研究未見報(bào)道。

此研究通過膜分離和離子交換層析結(jié)合質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)火麻蛋白水解物中的生物活性肽進(jìn)行了表征和純化，發(fā)現(xiàn)新型黃嘌呤氧化酶抑制肽，利用分子對(duì)接技術(shù)確定了火麻多肽與XOD之間的活性機(jī)制，為火麻蛋白的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁蛋白肽粉（實(shí)驗(yàn)室自制）；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、CHCA（美國Sigma公司）；乙腈（Merck公司）；三氟乙酸（Merck公司）；中性蛋白酶（夏盛酶生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA 1104 N電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；DHG-9070 A鼓風(fēng)干燥箱（上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；AKTA蛋白純化儀（GE Life Science，GE公司）；FlowMen-0015超濾設(shè)備（廈門福美科技公司）；AB SCIEX MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 火麻蛋白酶解液的制備

稱取一定質(zhì)量的火麻仁蛋白，按照1∶5 g/mL的比例加入蒸餾水溶解，加入4.5%的中性蛋白酶酶解，酶解pH為6.5，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為5 h，于100 ℃水浴滅酶5 min，按5 000 r/min 離心20 min，分離取火麻蛋白水解液。

1.3.2 火麻仁蛋白酶解肽液的超濾

將火麻仁蛋白酶解肽液經(jīng)截留分子量1，3和5 kDa的超濾膜進(jìn)行分級(jí)，得到HEPM 1（分子量＜1 kDa），HEPM 2（分子量1～3 kDa），HEPM 3（分子量3～5 kDa）和HEPM 4（分子量＞5 kDa）這4部分的酶解反應(yīng)產(chǎn)物，取XOD高抑制活性組分，冷凍干燥備用。

1.3.3 火麻仁蛋白酶解肽純化

以XOD抑制率為指標(biāo)，選取降尿酸活性最高的超濾組分冷凍干燥，于-20 ℃保存。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，依次經(jīng)過強(qiáng)陰離子交換柱HiTrap Q FF分離純化。層析柱：HiTrap Q FF；樣品及溶液預(yù)處理：0.45 μm針管過濾器除雜，于4 ℃靜置除氣泡；樣品質(zhì)量濃度：12.5 mg/mL；上樣方式：樣品環(huán)；上樣量：500 μL；緩沖液A：20 mmo/L Tris-HCl，pH 8.5；流動(dòng)相B：20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 8.5；線性梯度洗脫，洗脫體積30 BV；流速1 mL/min，收集組分并凍干，于-20 ℃保存，分別測(cè)定降尿酸活性。

1.3.4 分子量分布測(cè)定

飛行質(zhì)譜法MALDI-TOF分子量測(cè)試（委托上海厚基生物公司）采用正離子，反射模式，取1 μL火麻仁肽樣品點(diǎn)至樣品靶上，待自然干燥后，再取1 μL CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，然后用相同方法在樣品靶位的相鄰靶位上點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品。采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品Calibration Mixture 1進(jìn)行外標(biāo)一級(jí)校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差小于1.0×10-6。圖譜采集條件：一級(jí)質(zhì)譜（MS）范圍分別為m/z0～5 000，每張譜圖累加500個(gè)Laser Shots。

1.3.5 LC-MS/MS鑒定XOD抑制肽序列

火麻仁肽經(jīng)超濾、定量、脫鹽后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。液相所用的A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。液相色譜柱（0.15 mm×150 mm，RP-C18，Column Technology Inc.）以95%的A液進(jìn)行平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Zorbax 300 SB-C18peptide traps（Agilent Technologies，Wilmington，DE），再經(jīng)過液相色譜柱分離，相關(guān)液相梯度設(shè)置如下：0～55 min，B液線性梯度從4%到50%；55～59 min，B液線性梯度從50%到100%；59～60 min，B液維持在100%。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后，用Q Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Fisher）進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時(shí)長(zhǎng)60 min。檢測(cè)方式：正離子。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集10個(gè)碎片圖譜（MS 2 scan）。質(zhì)譜測(cè)試原始文件（Raw File）用軟件MaxQuant 1.5.5.1檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，最后得到蛋白質(zhì)鑒定及定量分析結(jié)果。

1.3.6 分子對(duì)接方法

小分子柔性對(duì)接的方法與黃嘌呤氧化酶進(jìn)行對(duì)接篩選。人源的Xanthine Oxidase酶全長(zhǎng)1 333個(gè)氨基酸，有晶體結(jié)構(gòu)2 CKJ和2 E1Q，結(jié)合小分子配體Bovine Xanthine Oxidase酶（PDB ID：3 NVY）中Quercetin的分子結(jié)合位置作為小肽對(duì)接的口袋位置。MOE v 2015.1001中的Dock模塊被用于基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選（SBVS）。3 XDH的結(jié)構(gòu)（PDB Code：2 E1Q）被用作受體。在對(duì)接之前，選擇AMBER 10：EHT力場(chǎng)和Reaction Field（R-field）的隱性溶劑模型。如圖1所示，蛋白中的自身配體（2-羥基苯甲酸）在XDH的X射線結(jié)構(gòu)中的結(jié)合位置被定義為小肽的結(jié)合口袋。對(duì)接流程采用柔性的induced fit模式，結(jié)合口袋氨基酸的側(cè)鏈可根據(jù)配體構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，約束側(cè)鏈轉(zhuǎn)動(dòng)的權(quán)重設(shè)置為10。每個(gè)配體，首先通過London dG評(píng)分對(duì)其所有的對(duì)接姿勢(shì)進(jìn)行排名，然后對(duì)最佳姿勢(shì)進(jìn)行優(yōu)化，接著應(yīng)用GBVI/WSA dG進(jìn)行重新評(píng)分。具有最低結(jié)合自由能的構(gòu)象最終被確定為最佳可能的結(jié)合模式。

圖1 XDH的三維結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁蛋白酶解肽液的超濾結(jié)果分析

把蛋白酶作用于底物發(fā)生水解反應(yīng)之后的混合物先后通過截留分子量5，3和1 kDa的超濾膜之后得到4個(gè)組分：HEPM 1（＜1 kDa），HEPM 2（1～3 kDa），HEPM 3（3～5 kDa）和HEPM 4（＞5 kDa）。圖2顯示了這五個(gè)組分的XOD抑制活性?；鹇槿拭附怆囊褐械闹饕煞质欠肿恿坎坏鹊母骷?jí)肽類，通過超濾可以去除大分子雜質(zhì)，保留小分子活性肽。當(dāng)前獲得的所有活性肽的分子量較小時(shí)，其所構(gòu)成的氨基酸殘基總量一般都小于20個(gè)，由試驗(yàn)結(jié)果可以看到XOD抑制活性最好的是HPM 1，其他組分XOD抑制活性和沒有經(jīng)過超濾膜的酶解肽液相比，其XOD抑制作用有所增加。

圖2 超濾組分的黃嘌呤氧化酶抑制率

2.2 火麻仁蛋白酶解肽純化結(jié)果

經(jīng)離子交換層析后將分子量＜1 kDa的火麻仁肽分為2個(gè)組分F1（峰1）和F2（峰2）（圖3），XOD抑制活性組分F2活性顯著高于F1，達(dá)到95.2%，說明F2中含有XOD抑制活性肽段（圖4）。

圖3 利用HiTrap QFF分離火麻仁肽

圖4 超濾組分HPM 4分子量分布

圖5 超濾組分HPM 3分子量分布

圖6 超濾組分HPM 2分子量分布

2.3 分子量分布測(cè)定結(jié)果

肽段的分子量分布及大小對(duì)其性質(zhì)有著重要的影響，通常利用膜分離技術(shù)作為蛋白酶解處理后富集特定分子量肽段的手段，超濾膜之后得到4個(gè)組分：HEPM 1，＜1 kDa；HEPM 2，在1～3 kDa之間；HEPM 3，在3～5 kDa之間；HEPM 4，＞5 kDa。按照XOD抑制活性情況，選用HPM 1，HPM 2，HPM 3和HPM 4進(jìn)行分子量分布分析。

4個(gè)組分的火麻仁肽分子量分布結(jié)果如圖4～圖7所示。其中：HPM 1中分子量＜1 kDa的小分子肽達(dá)到85%以上；HPM 2和HPM 3中小分子肽＜1 kDa數(shù)據(jù)相近，都在70%左右，含量幾乎相同，分子量在1～1.5 kDa的肽量HPM 2比HPM 3要多；HPM 4小分子肽＜1 kDa也達(dá)到40%以上，HPM 4沒有少于＞5 kDa的肽段。這4個(gè)組分的XOD抑制活性（XOD抑制活性強(qiáng)弱順序：HPM 1＞HPM 2＞HPM 3＞HPM 4）與其中的＜1 kDa 的活性肽含量占比（HPM 1＞HPM 2＞HPM 3＞HPM 4）呈正相關(guān)，可以推測(cè)火麻仁蛋白＜1 kDa小分子肽的XOD抑制活性相對(duì)較高，不同分子活性差異與其中肽分子量差異之間有一定潛在關(guān)系。

圖7 超濾組分HPM 1分子量分布

2.4 LC-MS/MS鑒定XOD抑制肽氨基酸序列結(jié)果

基于小分子量控制篩選，進(jìn)一步對(duì)火麻仁活性肽進(jìn)行合理的分離純化處理，獲得XO抑制活性高的組分F2。因此，可以進(jìn)一步推斷出，F(xiàn)2理應(yīng)存在XO抑制活性較高的小分子量活性肽成分，通過LC-MS/MS活性肽鑒定，質(zhì)譜測(cè)試原始文件（Raw File）用軟件MaxQuant 1.5.5.1檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，獲得了302個(gè)多肽序列，對(duì)302條多肽序列進(jìn)行了黃嘌呤氧化酶分子對(duì)接篩選，通過分子對(duì)接結(jié)合能打分值，篩選出了2條結(jié)合能力最強(qiáng)的序列AFNVDSETVK和KTNDNAWVSPLAG，并進(jìn)行分子對(duì)接構(gòu)像分析。

2.5 分子對(duì)接構(gòu)象結(jié)果

計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接可用來預(yù)測(cè)分析受體-配體之間的構(gòu)效關(guān)系。選擇肽1和肽2與XDH進(jìn)行相關(guān)分子對(duì)接可視化分析，進(jìn)行分子對(duì)接后，XDH與肽1（AFNVDSETVK）的結(jié)合模式如圖8所示。XDH與peptide1的相互作用位點(diǎn)信息見表1。如圖8所示，肽1和XDH的結(jié)合部位形成了合適的空間互補(bǔ)。對(duì)接結(jié)果顯示，XDH中的殘基Lys 772、Gln 876、Glu 880、Thr 1 011和Val 1 012可能通過氫鍵相互作用與peptide1中的Ala 1、Phe 2、Asp5、Ser 6和Val 9殘基結(jié)合。XDH中的殘基Glu 1 262可能通過鹽橋作用與肽1中的殘基Lys 10發(fā)生相互作用。

表1 肽1和XDH之間的相互作用位點(diǎn)列表

圖8 肽1和XDH的結(jié)合模式

XDH與肽2（KTNDNAWVSPLAG）的結(jié)合模式見圖9。XDH與peptide 2的相互作用位點(diǎn)信息見表2。肽2和XDH的結(jié)合部位形成了合適的空間互補(bǔ)。對(duì)接結(jié)果顯示，XDH中的殘基Asn 651、Lys 772、Gln 872、Gln 876和Phe 912可能通過氫鍵相互作與肽2中Lys 1、Asn 5、Ser 9和Ala 12殘基結(jié)合。XDH中的殘基Glu 1 262通過鹽橋與肽2中Lys 1發(fā)生相互作用。

表2 肽2和XDH之間的相互作用位點(diǎn)列表

圖9 肽2和XDH的結(jié)合模式

3 結(jié)論

通過超濾技術(shù)與離子交換法對(duì)火麻蛋白酶解物進(jìn)行分離純化，采用LC-MS/MS對(duì)純化后的活性部位進(jìn)行鑒定，使用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步研究篩選活性多肽，對(duì)分子對(duì)接結(jié)合能力最強(qiáng)的2條多肽AFNVDSETVK和KTNDNAWVSPLAG進(jìn)行了分子對(duì)接構(gòu)象分析。結(jié)果表明，分離鑒定得到的火麻多肽能夠與黃嘌呤氧化酶主要活性位點(diǎn)的氨基酸殘基結(jié)合，此方法為后續(xù)已知靶點(diǎn)的活性多肽的尋找與評(píng)價(jià)提供參考與借鑒。