液質聯(lián)用檢測老酸奶和牛軋?zhí)侵腥矍璋返难芯?/h1>
2023-10-19 02:49:50劉超呂雪梅景贊
食品工業(yè) 2023年9期
劉超，呂雪梅，景贊
樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）
三聚氰胺，簡稱三胺，俗稱蜜胺、蛋白精。三聚氰胺是一種白色的單斜晶體，幾乎無味，微溶于水，可溶于甲醇、吡啶、乙酸、甲醛、甘油等有機溶劑，不溶于醚類、丙酮。三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化工原料，其主要用途可以用于生產三聚氰胺甲醛樹脂。由于三聚氰胺有毒，會對人體造成很大危害，因此在對于食品的加工環(huán)節(jié)時，三聚氰胺被禁止加入食品中。
乳制品中大多可能含有三聚氰胺，要想檢測出三聚氰胺，可采用氣相色譜-質聯(lián)用法、氣相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等。
試驗采用液相色譜-質譜聯(lián)用法，會產生一定的基質效應。基質效應指樣品中除待測組分之外的其他組分（基質），經常會對待測組分的分析造成一定的干擾，會對待測組分的測定造成增強或者抑制。因此需對其產生的基質效應進行評價，并采用外標法或者內標法對其進行消除。
1 材料與方法
1.1 儀器與設備
LC-20UFLC/API3200液相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；XH-C旋渦混合器（廣州前旗電子科技有限公司）；DVG-9076B電熱恒溫鼓風干燥箱（上海巖硎儀器制造有限公司）；HSC-H氮吹儀（福建歡儀有限公司）；TGL16N高速冷凍離心機（廣西顧寧儀器有限公司）；LSPE-13固相萃取儀（福建葉翎儀器有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（上海冠德精儀儀器有限公司）；KQ-700數控超聲波清洗器（上海雙旭電子有限公司）；TGL-16臺式高速冷凍離心機（北京娜維斯儀器有限公司）；HN-6數顯恒溫水浴鍋（杭州尹思特諾儀器制造有限公司）。
1.2 材料與試劑
三聚氰胺標準品（純度 99.0%，批號 G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內標標準品（Melamine-13 C3，100 μg/mL，CAS號1173022-88-2）；甲醇、乙腈（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；老酸奶、牛軋?zhí)牵ㄙ徲跇飞郊壹覙烦校?/p>
1.3 試驗條件
色譜柱采用強陽離子交換與C18混合填料，混合比例（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相為乙酸銨溶液-乙腈（1︰1，V/V），乙酸調至pH 3；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；氣簾氣30 psi；霧化氣30 psi；輔助加熱氣30 psi；離子化溫度450 ℃。
表1 三聚氰胺及其內標質譜參數
1.4 試驗方法
樣品經2.1的方法溶解后，參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[14]第二法液相色譜-質譜/質譜（LC-MS/MS）法中4.4.1.1提取方法進行提取、4.4.2凈化方法進行凈化。
1.5 標準溶液的配制
三聚氰胺標準儲備液：準確稱取10 mg三聚氰胺標準品至10 mL容量瓶中，用甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質量濃度1 mg/mL的三聚氰胺儲備液。
三聚氰胺內標儲備液：準確吸取1 mL三聚氰胺內標溶液至10 mL容量瓶中，甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質量濃度10 μg/mL的三聚氰胺內標儲備液。
2 結果與分析
2.1 膠基的溶解
由于乳制品老酸奶、牛軋?zhí)侵芯心z基，無法直接提取三聚氰胺，需將老酸奶、牛軋?zhí)侵兴哪z基溶解后進行三聚氰胺的提取。在對老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分兴z基進行溶解的探究過程中，嘗試3種方法。稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠犯?份，置于50 mL塑料離心管中，分別用3 L純水、2 mL純水+2 mL 95%乙醇、3 mL 60%甲醇作溶劑[4]，在恒溫水浴鍋中加熱10 min后，觀察老酸奶、牛軋?zhí)堑葮悠返娜芙馇闆r，選出溶解膠基的最佳試劑，結果見表2。
表2 老酸奶、牛軋?zhí)侨芙馇闆r
由表2說明：純水對老酸奶、牛軋?zhí)悄z基的溶解效果最好，原因可能是老酸奶、牛軋?zhí)侵芯忻髂z，明膠是一種大分子物質并且易與水結合，雖然3種溶解試劑中均含有水，但明膠不溶于乙醇；甲醇易被氧化生成甲醛，明膠遇到甲醛時，明膠成為不可逆的凝狀膠體，且不溶于水，3種溶解試劑中純水溶解效果較好。故后續(xù)試驗采用3 mL純水作溶劑溶解乳制品老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分兴z基。
2.2 基質效應的評價
采用提取后添加法測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應強度，通過式（1）計算二者相對比值評價基質效應。
式中：A和B分別表示純溶劑與基質溶液中分析物的峰面積；若B/A＞1，表示基質對分析物的響應產生增強效應；若B/A＜1，表示基質對分析物的響應產生抑制效應；若B/A=1，表示不存在基質效應。B/A介于0.8～1.2時，可不用消除基質效應；B/A＜0.8或B/A＞1.2，基質效應干擾強烈[5]，需要消除或降低基質效應對檢測結果的影響。
表3數據表明：試樣中基質效應均＜0.8，表明基質對分析物的響應產生抑制效應，且因基質效應遠小于0.8，表明基質效應的干擾強烈，需要消除或降低基質效應對檢測結果的影響，否則試驗結果偏差較大。
表3 基質效應的評價
2.3 外標法對基質效應的消除
2.3.1 隨行加標
分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，編號。樣品經2.1的方法溶解后，分別加入一定量的三聚氰胺標準中間液，按照1.4進行樣品處理，配制成標準質量濃度分別為1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個標樣。另取9個空白樣品，分別配成質量分數2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標回收試驗，結果見表4。
表4 外標法加標回收率、精密度（n=3） 單位：%
2.3.2 基質配標
設置1～6號空白試樣，分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，按2.1的方法溶解后，按1.4對老酸奶和牛軋?zhí)沁M行樣品處理，配制成6個空白溶液，用空白溶液配制成標準質量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個標樣。進液質聯(lián)用儀，測定對應的峰面積，以三聚氰胺濃度為橫坐標，以三聚氰胺峰面積為縱坐標，繪制得三聚氰胺標準曲線。另取9個空白樣品，分別設置成濃度2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標回收試驗，結果見表4。
2.4 內標法對基質效應的消除
取6個10 mL容量瓶，分別加入一定量的三聚氰胺標準溶液，每個容量瓶中加入一定量的三聚氰胺內標中間液，配制成三聚氰胺質量濃度為1，2，4，8，16和20 ng/mL的標點，每份溶液含內標質量濃度為10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標，三聚氰胺與內標物峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。測定對應的峰面積，繪制得到標準曲線。另分別設置低、中、高3組試樣，每組試樣中取3個溶解后的樣品各加入20 μL三聚氰胺內標物，低濃度2.434 μg/kg、中濃度5.079 μg/kg和高濃度10.16 μg/kg這3組試樣。每組樣品重復測定3次，測定其平均加標回收率，結果見表5。
表5 內標法加標回收率、精密度（n=3） 單位：%
結果表明，內標法所測得的三聚氰胺平均加標回收率均在100%左右，均高于外標法所測得的平均加標回收率，表明內標法準確度好，徹底消除因基質效應對結果的影響。
2.5 方法學驗證
2.5.1 三聚氰胺及其內標質譜圖
如圖1～圖3所示，三聚氰胺及其內標母離子分別為127.1和130.2，三聚氰胺子離子特征離子峰選取68.0和85.0，三聚氰胺內標子離子特征離子峰為70.1和87.1。在此條件下，三聚氰胺及其內標物響應值最高。
圖1 三聚氰胺及其內標一級質譜圖
圖2 三聚氰胺內標二級質譜圖
圖3 三聚氰胺二級質譜圖
2.5.2 標準曲線方程和線性范圍
準確吸取不同體積的三聚氰胺標準溶液劑內標溶液，用甲醇水（1+1，V/V）配制成三聚氰胺質量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL的標點，每份溶液含內標濃度10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標，三聚氰胺與內標物峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表6。
表6 三聚氰胺標準曲線 單位：%
2.5.3 方法的準確度和精密度
分別設置低濃度、中濃度、高濃度3組試樣，每組試樣中分別加入一定量三聚氰胺標準溶液、三聚氰胺內標物，配制濃度分別為低濃度2 μg/kg、中濃度5 μg/kg和高濃度10 μg/kg這3組試樣。低、中、高3組水平平行測定3次。以測定結果與理論加標量的比值表示加標回收率，以3次測定結果的SRSD值表示精密度，結果見表7。
表7 內標法測得的相對標準偏差 單位：%
結果表明，試驗方法測定老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋菲骄訕嘶厥章试?00.7%～104.5%之間，SRSD在0.3%～2.9%之間，表明該方法準確度高、平行性好，方法成熟、可靠。
3 結論
采用液質聯(lián)用檢測含乳型老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋泛浚蛩x樣品中含有大量膠基，無法直接提取所含三聚氰胺，因此試驗優(yōu)化樣品中膠基溶解的方法，考察樣品中的基質效應。比較外標法和內標法降低液質聯(lián)用儀在檢測中帶來的基質效應影響，試驗結果表明僅選用基質加標的方法無法徹底消除樣品中的基質效應，基于此也無法獲得準確的結果，試驗選用內標法取得很好的效果。方法學驗證表明，試驗方法具有方法簡便、靈敏度高、準確度好、穩(wěn)定性強等特點，適用于對含乳型老酸奶、牛軋?zhí)堑群z基食品中三聚氰胺的測定。
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乳制品中大多可能含有三聚氰胺，要想檢測出三聚氰胺，可采用氣相色譜-質聯(lián)用法、氣相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等。
試驗采用液相色譜-質譜聯(lián)用法，會產生一定的基質效應。基質效應指樣品中除待測組分之外的其他組分（基質），經常會對待測組分的分析造成一定的干擾，會對待測組分的測定造成增強或者抑制。因此需對其產生的基質效應進行評價，并采用外標法或者內標法對其進行消除。
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1.2 材料與試劑
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1.3 試驗條件
色譜柱采用強陽離子交換與C18混合填料，混合比例（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相為乙酸銨溶液-乙腈（1︰1，V/V），乙酸調至pH 3；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；氣簾氣30 psi；霧化氣30 psi；輔助加熱氣30 psi；離子化溫度450 ℃。
表1 三聚氰胺及其內標質譜參數
1.4 試驗方法
樣品經2.1的方法溶解后，參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[14]第二法液相色譜-質譜/質譜（LC-MS/MS）法中4.4.1.1提取方法進行提取、4.4.2凈化方法進行凈化。
1.5 標準溶液的配制
三聚氰胺標準儲備液：準確稱取10 mg三聚氰胺標準品至10 mL容量瓶中，用甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質量濃度1 mg/mL的三聚氰胺儲備液。
三聚氰胺內標儲備液：準確吸取1 mL三聚氰胺內標溶液至10 mL容量瓶中，甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質量濃度10 μg/mL的三聚氰胺內標儲備液。
2 結果與分析
2.1 膠基的溶解
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表2 老酸奶、牛軋?zhí)侨芙馇闆r
由表2說明：純水對老酸奶、牛軋?zhí)悄z基的溶解效果最好，原因可能是老酸奶、牛軋?zhí)侵芯忻髂z，明膠是一種大分子物質并且易與水結合，雖然3種溶解試劑中均含有水，但明膠不溶于乙醇；甲醇易被氧化生成甲醛，明膠遇到甲醛時，明膠成為不可逆的凝狀膠體，且不溶于水，3種溶解試劑中純水溶解效果較好。故后續(xù)試驗采用3 mL純水作溶劑溶解乳制品老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分兴z基。
2.2 基質效應的評價
采用提取后添加法測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應強度，通過式（1）計算二者相對比值評價基質效應。
式中：A和B分別表示純溶劑與基質溶液中分析物的峰面積；若B/A＞1，表示基質對分析物的響應產生增強效應；若B/A＜1，表示基質對分析物的響應產生抑制效應；若B/A=1，表示不存在基質效應。B/A介于0.8～1.2時，可不用消除基質效應；B/A＜0.8或B/A＞1.2，基質效應干擾強烈[5]，需要消除或降低基質效應對檢測結果的影響。
表3數據表明：試樣中基質效應均＜0.8，表明基質對分析物的響應產生抑制效應，且因基質效應遠小于0.8，表明基質效應的干擾強烈，需要消除或降低基質效應對檢測結果的影響，否則試驗結果偏差較大。
表3 基質效應的評價
2.3 外標法對基質效應的消除
2.3.1 隨行加標
分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，編號。樣品經2.1的方法溶解后，分別加入一定量的三聚氰胺標準中間液，按照1.4進行樣品處理，配制成標準質量濃度分別為1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個標樣。另取9個空白樣品，分別配成質量分數2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標回收試驗，結果見表4。
表4 外標法加標回收率、精密度（n=3） 單位：%
2.3.2 基質配標
設置1～6號空白試樣，分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，按2.1的方法溶解后，按1.4對老酸奶和牛軋?zhí)沁M行樣品處理，配制成6個空白溶液，用空白溶液配制成標準質量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個標樣。進液質聯(lián)用儀，測定對應的峰面積，以三聚氰胺濃度為橫坐標，以三聚氰胺峰面積為縱坐標，繪制得三聚氰胺標準曲線。另取9個空白樣品，分別設置成濃度2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標回收試驗，結果見表4。
2.4 內標法對基質效應的消除
取6個10 mL容量瓶，分別加入一定量的三聚氰胺標準溶液，每個容量瓶中加入一定量的三聚氰胺內標中間液，配制成三聚氰胺質量濃度為1，2，4，8，16和20 ng/mL的標點，每份溶液含內標質量濃度為10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標，三聚氰胺與內標物峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。測定對應的峰面積，繪制得到標準曲線。另分別設置低、中、高3組試樣，每組試樣中取3個溶解后的樣品各加入20 μL三聚氰胺內標物，低濃度2.434 μg/kg、中濃度5.079 μg/kg和高濃度10.16 μg/kg這3組試樣。每組樣品重復測定3次，測定其平均加標回收率，結果見表5。
表5 內標法加標回收率、精密度（n=3） 單位：%
結果表明，內標法所測得的三聚氰胺平均加標回收率均在100%左右，均高于外標法所測得的平均加標回收率，表明內標法準確度好，徹底消除因基質效應對結果的影響。
2.5 方法學驗證
2.5.1 三聚氰胺及其內標質譜圖
如圖1～圖3所示，三聚氰胺及其內標母離子分別為127.1和130.2，三聚氰胺子離子特征離子峰選取68.0和85.0，三聚氰胺內標子離子特征離子峰為70.1和87.1。在此條件下，三聚氰胺及其內標物響應值最高。
圖1 三聚氰胺及其內標一級質譜圖
圖2 三聚氰胺內標二級質譜圖
圖3 三聚氰胺二級質譜圖
2.5.2 標準曲線方程和線性范圍
準確吸取不同體積的三聚氰胺標準溶液劑內標溶液，用甲醇水（1+1，V/V）配制成三聚氰胺質量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL的標點，每份溶液含內標濃度10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標，三聚氰胺與內標物峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表6。
表6 三聚氰胺標準曲線 單位：%
2.5.3 方法的準確度和精密度
分別設置低濃度、中濃度、高濃度3組試樣，每組試樣中分別加入一定量三聚氰胺標準溶液、三聚氰胺內標物，配制濃度分別為低濃度2 μg/kg、中濃度5 μg/kg和高濃度10 μg/kg這3組試樣。低、中、高3組水平平行測定3次。以測定結果與理論加標量的比值表示加標回收率，以3次測定結果的SRSD值表示精密度，結果見表7。
表7 內標法測得的相對標準偏差 單位：%
結果表明，試驗方法測定老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋菲骄訕嘶厥章试?00.7%～104.5%之間，SRSD在0.3%～2.9%之間，表明該方法準確度高、平行性好，方法成熟、可靠。
3 結論
采用液質聯(lián)用檢測含乳型老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋泛浚蛩x樣品中含有大量膠基，無法直接提取所含三聚氰胺，因此試驗優(yōu)化樣品中膠基溶解的方法，考察樣品中的基質效應。比較外標法和內標法降低液質聯(lián)用儀在檢測中帶來的基質效應影響，試驗結果表明僅選用基質加標的方法無法徹底消除樣品中的基質效應，基于此也無法獲得準確的結果，試驗選用內標法取得很好的效果。方法學驗證表明，試驗方法具有方法簡便、靈敏度高、準確度好、穩(wěn)定性強等特點，適用于對含乳型老酸奶、牛軋?zhí)堑群z基食品中三聚氰胺的測定。
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