固相萃取-離子色譜法測定酵素中7種無機陰離子

鄧湘波，歐陽吉德，曹滂，賀偉

郴州市食品藥品檢驗檢測中心（郴州 423000）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供食用的酵素產品[1]。食用植物酵素因含有糖類、酶類及有機酸類等對人體有益的特定生物活性成分，被越來越多的群眾所接受。但自制酵素由于原材料及環境等因素影響，質量參差不齊。食用植物酵素中的氟化物、氯化物、亞硝酸鹽、溴化物、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等陰離子多寡在酵素液中嚴重影響酵素的質量安全，其含量是判斷酵素質量合格與否的重要指標，全方位分析酵素中陰離子含量，對指導酵素的安全使用，具有重要意義。

文獻報道常用測定陰離子的方法主要有離子選擇電極法、分光光度法和離子色譜法[2-4]，然而常規的方法普遍存在前處理過程繁瑣、結果干擾因素雜、靈敏度不高、結果重現性差等問題，離子色譜法較好地克服上述缺點。同時，固相萃取法前處理具有快速高效等優點。固相萃取與離子色譜相結合，良好地克服了干擾因素，易于操作重現，已在食品[5-6]、飲用水[7-8]、環境[9]、煙草[10]、藥品[11]等多個領域得到應用。但離子色譜法用于陰離子的測定大多集中在飲用水[11-12]，該方法在食用植物酵素中的無機陰離子的研究則鮮于報道。

試驗采用固相萃取-離子色譜法聯用技術，對食用植物酵素中的7種無機陰離子進行分析測定。以Dionex ICS-AS19為分析柱，以氫氧化鉀為淋洗液，在線梯度淋洗，建立一種可同時測定食用植物酵素中7種無機陰離子的固相萃取-離子色譜聯用法。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 樣品來源

10批次植物酵素樣品，分別來源于家庭個人自制及網絡采購酵素液。樣品1～2為家庭個人自制果蔬皮發酵所得混合酵素液，樣品3～4為家庭個人自制混合水果發酵所得混合酵素液，樣品5為家庭個人自制楊梅發酵所得楊梅酵素液，樣品6～7為家庭自制水果及蔬菜混合發酵所得酵素液，樣品8為網絡采購自制芒果發酵酵素液，樣品9為網絡采購自制檸檬發酵酵素液，樣品10為網絡采購自制楊梅發酵酵素液。

1.1.2 試驗試劑

7種陰離子混標（100 mg/L）、氟離子（1 000 mg/L）、氯離子（1 000 mg/L）、亞硝酸根離子（1 000 mg/L）、溴離子（1 000 mg/L）、硝酸根離子（1 000 mg/L）、磷酸根離子（1 000 mg/L）、硫酸根離子（1 000 mg/L）等8種標準儲備液：北京壇墨質檢科技有限公司；氫氧化鉀淋洗液（分析純，thermofisher）。

1.1.3 儀器與設備

ICS-1100離子色譜儀（美國Dionex公司）；RFC-30淋洗液自動發生器（美國Dionex公司）；AS-DV自動進樣器（美國Dionex公司）；ASRS300陰離子抑制器（美國Dionex公司）；變色龍色譜工作站，SMART 2 PURE智能一體化超純水系統（Thermo Fisher Scientific）；ML204型電子天平（梅特勒-多利多）；VISIPREP DL固相萃取裝置（SUPELCO）；SPE-C18固相萃取小柱（Agela Technologies）；LC-WCX弱陽離子固相萃取柱（上海安譜實驗科技股份有限公司）；200 μL微量移液器、1 000 μL微量移液器（德國Eppendorf）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理[14-15]

將食用植物酵素原液混勻，取適量酵素樣品轉移至50 mL離心管中，于5 000 r/min離心5 min，去除肉眼可見雜質。取5 mL離心后上清液，并將其用超純水稀釋至100 mL容量瓶中，待凈化。按照從上到下的順序，將10 mL注射器、C18柱和LC-WCX弱陽離子交換柱安裝在固相萃取儀上，依次用10 mL甲醇和10 mL水活化平衡固相萃取小柱。取待凈化酵素液10 mL至上端注射器中，依次通過C18柱及LC-WCX弱陽離子交換柱凈化，抽干并收集流出液，流出液過0.22 μm濾膜，待上機測定。

1.2.2 陰離子淋洗液的配制

由EGC Ⅲ KOH RFIC氫氧化鉀淋洗液自動電解發生器在線生成，淋洗液按表1梯度淋洗程序淋洗。

表1 梯度淋洗程序

1.2.3 混合標準應用液的配制

精密移取5 mL 7種陰離子混合標準儲備液，包括氟離子（100 mg/L）、氯離子（100 mg/L）、亞硝酸根離子（100 mg/L）、溴離子（100 mg/L）、硝酸根離子（100 mg/L）、磷酸根離子（100 mg/L）、硫酸根離子（100 mg/L），用超純水定容至50 mL容量瓶中，配制成最終質量濃度為10 mg/L的混合標準工作溶液，于4 ℃冷藏保存。

1.2.4 標準曲線的配制

精密移取適量7種陰離子混合標準工作液，用超純水定容至25 mL容量瓶中，混勻，配制成7種陰離子質量濃度均為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 mg/L的6個不同濃度的混合標準系列溶液。取上述標準工作系列溶液注入離子色譜儀進樣系統，記錄峰面積，繪制標準曲線。

1.2.5 色譜條件

以KOH溶液為梯度淋洗液，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，預處理后樣品溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，自動進樣器直接進樣，進樣量25 μL。經ASRS300陰離子抑制器后，通過IonPac AG19保護柱（4 mm×50 mm）及IonPac AS19分析柱（4 mm×250 mm）進行分離，電導檢測器記錄信號，單標保留時間定性，峰面積定量。

1.2.6 方法學驗證方法

以各陰離子的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并計算各陰離子質量濃度。連續檢測12次空白樣品，計算信噪比（rSN）大于3︰1的濃度為檢出限[14]。取5 mg/L標準溶液連續進樣6次，計算保留時間和峰面積相對標準偏差。將標準溶液加入酵素樣品溶液中，配制成1，2和5 mg/L高、中、低3個質量濃度，每個濃度測定6次，測得加標試樣中各陰離子濃度，扣除相應樣品空白，計算樣品加標回收率。

1.2.7 數據整理與統計

使用變色龍色譜工作軟件對數據進行處理，并對試驗結果的平均值進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

7種陰離子的線性質量濃度范圍和線性方程見表2，方法學驗證結果見表3。

表2 各陰離子的線性質量濃度范圍和線性方程

表3 方法學驗證結果

2.2 樣品檢測結果

運用固相萃取與離子色譜法聯用技術，對F-，Cl-，NO2-，Br-，NO3-，SO42-和PO43-7種陰離子進行定量檢測分析，色譜圖結果顯示（圖1），各陰離子色譜峰得到有效分離，峰形良好，分離度均大于3.2。經方法學驗證，各離子的檢出限分別為0.015，0.020，0.043，0.056，0.025，0.037和0.053 mg/L，標準曲線線性相關系數均大于0.999 1，在1，2和5 mg/L高中低3個梯度下各無機陰離子加標回收率分別在90.3%～96.8%，94.6%～96.9%和97.8%～105.7%之間，各陰離子精密度（n=6，SRSD）分別在2.1%～5.1%，0.7%～3.0%和1.1%～3.2%之間，整體小于5.1%。說明該固相萃取與離子色譜法聯用法可適用于食用酵素中陰離子濃度的定量檢測分析。

圖1 7種陰離子色譜圖

應用該方法，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，同時測定10批次自制植物酵素液中F-，Cl-，NO2-，Br-，NO3-，SO42-和PO43-7種無機陰離子的含量。從檢驗結果上看（表4），10批次自制植物酵素中的均檢出硫酸根離子，且硫酸根離子濃度很高，其中3批次個人自制酵素硫酸鹽含量均超過GB 5749—2022《生活飲用水衛生標準》中規定的250 mg/L的限值要求，存在較大的安全隱患。9批次檢出磷酸根離子，8批次檢出氯離子，其中2批次采購于網絡的自制酵素中氯化物明顯高于其他品種，需持續關注監測。氟化物、亞硝酸根、硝酸根3種物質雖有檢出，但檢測結果較低，安全風險相對較小。10批次自制酵素中均未檢出溴離子。

表4 樣品檢測結果 單位：mg/L

3 討論與結論

氟化物濃度過高，會對人體骨骼、組織器官和動植物的生長都有極大危害，導致人體氟骨癥[16-17]。氯離子可與有機物化合生成致癌物，溴化物可與消毒劑反應生成含溴消毒副產物等危害人體健康的物質[18]；硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量高，會干擾肌體對維生素A的利用，導致維生素A缺乏癥[19-20]。硫酸根離子直接受硫酸鈣溶解度的影響，既影響食用口感也對人體健康產生潛在影響[21]。磷酸根離子也會不同程度的人體和環境造成危害。

方法利用洗脫液生成功能，防止基線漂移，提高靈敏度，改善分離度并確保一致的峰積分。洗脫液生成消除傳統的IC洗脫液制備方法中對于酸和堿的處理需求，并且允許色譜分析工作人員運行全范圍的梯度和等度分離，且效率比手工制備洗脫液更高[22-24]。對含干擾物質的復雜水質樣品，須用相應的H型或Na性強酸性陽離子預處理柱進行有效去除后再進樣。

綜上所述，離子色譜法檢測食用植物酵素中的7種陰離子方法穩定可靠，但自制酵素離子成分參差不齊。國家尚無酵素相關的國家標準出臺，消費者沒有對酵素中的各種陰離子的濃度進行限值，中國發酵產業協會雖出臺食用植物酵素的團體標準，但也未對各種離子進行限值規定，建議盡早對酵素中陰離子限值做出相關規定。以消除酵素陰離子對消費者造成的安全隱患，同時也進一步促進規范酵素行業的健康發展。