UPLC-MS/MS測定牛奶中三氮脒和氮氨菲啶殘留

湯晨

上海德諾產品檢測有限公司（上海 200436）

三氮脒[diminazene aceturate，DIM；又名貝尼爾（Berenil?）]和氮氨菲啶[isometamidium chiorde，ISM；又名沙漠林（Samorin?）]，是國內外治療錐蟲病感染的應用最多的藥物之一[1-2]。錐蟲病嚴重影響動物的身體狀況和生產性能，從而給畜牧業造成巨大損失[3-4]。三氮脒只可用于治療錐蟲病，氮氨菲啶卻可以治療和預防錐蟲病[5-6]。然而藥物的不正當使用造成藥物殘留，特別是牛奶中的藥物殘留，它與治療劑量有直接關，更容易出現藥物殘留現象，危害食用者的身體健康[7]。我國在GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規定牛奶三氮脒的最大殘留限量值為150 μg/kg，氮氨菲啶的最大殘留限量值為100 μg/kg[8]。但我國對于牛奶中三氮脒和氮氨菲啶的檢測方法并不完善，因此有必要對牛奶中的三氮脒和氮氨菲啶殘留量的檢測進行研究。

已報道研究方向主要用高效液相色譜法（HPLC）檢測三氮脒，并無使用高效液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）檢測的研究報道，而同時檢測三氮脒和氮氨菲啶的研究也僅有高效液相色譜法（HPLC）。高效液相色譜-串聯質譜法的靈敏度高，選擇性好，是一種集高效分離和多組分定性、定量與一體的方法，關于牛奶中的三氮脒與氮氨菲啶的檢測，尚無高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測三氮脒和氮氨菲啶的國家標準和相關報道。

周雨卉等[9]采用不同提取液，用高效液相色譜法同時測定牛組織中的三氮脒和氯化氮氨菲啶，GB/T 22974—2008[10]用液相色譜串聯質譜法僅檢測牛奶中的氮氨菲啶，此次試驗從三氮脒和氮氨菲啶的理化性質出發，在前人研究[9-10]的基礎上，建立用超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測牛奶中三氮脒和氮氧菲啶的方法。通過簡單的樣品前處理，使用超高效液相色譜-串聯質譜儀進行分析，為牛奶中三氮脒和氮氨菲啶殘留的分析提供一種新檢測途徑，也為我國加強獸藥監控、提高牛奶質量提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純）；乙酸、正己烷（分析純）；超純水（H2O，電阻率18.2 MΩ·cm）；鹽酸氮氨菲啶（質量濃度100 mg/L，上海安譜實驗科技股份有限公司）；三氮脒（純度99%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

6470B液相色譜-串聯質譜儀（配有電噴霧離子源及MassHunter數據處理系統）、1290II液相色譜儀（美國Agilent公司）；230V渦旋混勻器（美國Talboys公司）；RV10旋轉蒸發儀（德國IKA集團）；ST16R高速冷凍離心機（德國Thermo公司）；AB-135S電子天平（梅特勒托利多集團）；2300TH超聲波清洗器（上海安譜科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：取1 mL氮氨菲啶標準溶液至于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成質量濃度10 μg/mL的標準儲備液；稱取10 mg三氮脒標準品于10 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成10 μg/mL的標準儲備液，-18 ℃避光存。

混合標準工作液：分別移取適量體積的標準溶液，用15%（V/V）乙腈水溶液稀釋成所需的混合標準溶液，臨用現配。

提取液：乙腈[含0.2%（V/V）的50%（V/V）乙酸水溶液]，乙腈中加入200 μL乙酸-水（1+1，V/V）溶液，混勻。

1.3.2 樣品的制備和提取

準確稱取5 g（精確到0.01 g）牛奶試樣于50 mL離心管中，加入20 mL提取液乙腈（含0.2%的50%乙酸溶液），蓋上蓋混勻，均質2 min，按6 000 r/min離心10 min，將上層溶液轉移至雞心瓶中，殘渣用20 mL提取液超聲提取10 min，按6 000 r/min離心5 min，合并2次提取液于雞心瓶中，待凈化。

1.3.3 凈化

將雞心瓶中的提取液于40 ℃水浴旋轉蒸發至干，加1 mL 15%（V/V）乙腈水溶液復溶，充分旋渦溶解殘余物，加1 mL正己烷振蕩混合1 min，轉移至10 mL離心管中，按6 000 r/min離心5 min，棄上層正己烷液。加1 mL正己烷，重復提取1次。取下層清液，過0.22 μm濾膜后，上機檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動性A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃；進樣量2 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及其梯度條件

1.5 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為多反應監測（MRM）；離子源溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；電噴霧電壓4.0 kV；噴霧氣55.0 psi。三氮脒及氮氨菲啶的母離子、子離子、保留時間等見表2，總離子流圖見圖1。

圖1 三氮脒及氮氨菲啶的總離子流圖

表2 三氮脒及氮氨菲啶的質譜參數

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優化

2.1.1 提取液的優化

以牛奶為基質，考察乙腈、乙腈[含0.2%（V/V）的50%（V/V）乙酸水溶液]、乙腈[含0.4%（V/V）的50%（V/V）乙酸水溶液]這3種溶液作為提取液的提取效果。準確稱取5.00 g牛奶樣品，加入250 ng/mL混合標準溶液，在相同條件下，經3種提取液提取后，檢測查看提取效果，測得的目標物回收率見圖2。結果顯示，由于牛奶中蛋白質含量高，乙腈可以有效地沉淀蛋白質，牛奶又呈弱堿性，而三氮脒和氮氨菲啶為偏堿性藥物，在堿性環境下不容易被提取出來，加入乙酸可以降低提取液pH，提高對目標物的提取效果。因此，乙腈（含0.2%的50%乙酸溶液）作為提取液時，目標物的回收率最好。

圖2 不同體積分數的50%乙酸水溶液對三氮脒和氮氨菲啶回收率的影響

2.2 定量檢測

2.2.1 檢出限、定量限、線性范圍

用牛奶的空白基質將三氮脒和氮氨菲啶配制成50～1 000 ng/mL的基質標準曲線，分別對三氮脒和氮氨菲啶進行分析，以添加藥物的質量濃度（X，ng/mL）對應以相應色譜峰面積（Y），建立標準曲線。結果表明，三氮脒和氮氨菲啶的線性范圍良好，各項相關系數（r）＞0.999，在相應質量濃度范圍內具有良好線性關系。

添加混合標準溶液于5 g空白樣品中（即5 μg/kg的添加水平），使用優化后的樣品經前處理方法后，上機檢測，測得三氮脒和氮氨菲啶的信噪比rSN均≥3，即檢出限為5 μg/kg，以2倍檢出限定為定量限，即定量限為10 μg/kg。結果見表3。

表3 線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限

2.2.3 方法回收及精密度

準確稱取多份5 g空白樣品，進行加標回收試樣。加入三氮脒、氮氨菲啶混合標準溶液，進行SLOQ，2SLOQ和10SLOQ的加標回收試驗，每個添加量重復6次，經前處理及儀器測定，得加標回收額定值。表4顯示，加標回收率在80.8%～95.3%之間，SRSD結果范圍為2.0%～4.2%（n=6），符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》的要求，表明試驗方法的準確性較高，可用于牛奶中樣品中三氮脒和氮氨菲啶的同時測定。

表4 加標回收試驗結果

3 結論

試驗建立的超高效液相色譜-串聯質譜檢測牛奶中三氮脒和氮氨菲啶酸方法的回收率、靈敏度和重復性均符合殘留分析的要求。該方法前處理操作簡便，試劑消耗少，適合于牛奶中三氮脒和氮氨菲啶的殘留檢測。試驗為牛奶中三氮脒和氮氨菲啶殘留的分析提供一種新檢測途徑，也為我國加強獸藥監控、提高牛奶質量提供支持。