金銀花提取物對冷藏豬肉丸品質的影響

李佳珊，楊爍，尚宏麗

錦州醫(yī)科大學食品與健康學院（錦州 121001）

肉丸是一種具有豐富的營養(yǎng)價值的傳統(tǒng)肉糜產品，由于其食用方便而受到廣大消費者的青睞[1]。肉丸制品在加工過程中易發(fā)生脂肪和蛋白質氧化，致使肉丸的香味、口感、色澤等方面出現(xiàn)較大問題，從而降低產品的品質[2]。近年來，丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯（BHT）等作為食品中的抗氧化劑在食品安全領域得到廣泛應用，但其對食品安全的影響尚不明確[3]。食品添加劑的安全性要基于攝入劑量，所以開發(fā)和利用天然的抗氧化劑成為一個熱門課題。天然抗氧化劑主要是多酚類化合物，這些物質廣泛存在于天然植物中，如常用的茶多酚和迷迭香提取物[4]，其酚羥基鄰位酚羥基易于氧化，對活性氧和其他自由基也有較強的捕捉能力，因此其抗氧化性很強，它取代合成抗氧化劑是一種趨勢[5]。

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬新開的干花蕾，具有抗病原微生物、抗炎[6]、解熱保肝、降血脂[7]、止血及免疫調節(jié)作用，在臨床上被廣泛用于多種感染、炎癥、高血脂及腫瘤治療[8]。就金銀花提取物而言，綠原酸為典型抗氧化功效成分，具有廣闊的應用前景，其具有非常強大的抗氧化、抗癌變、促進類脂代謝等生理功能[9]。

金銀花提取物的研究，多集中在其功能性成分的提取和應用方面，或在生物活性等方面的研究[10]，國內外鮮見有關金銀花提取物對肉丸貯藏過程中脂肪及蛋白氧化作用的研究[11]。試驗以中式肉制品豬肉丸為原料，與生產上普遍使用的合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯（BHT）進行比較，加入不同濃度金銀花提取物，測定豬肉丸中硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、蛋白質羰基、巰基含量和品質變化，采用傅里葉紅外光譜測定蛋白質二級結構，評價金銀花提取物對豬肉丸品質的影響，為提高豬肉制品冷藏保鮮技術提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬肉、食鹽、白砂糖、白胡椒粉、淀粉、味精（均為市售）；金銀花提取物（冠贏生物科技有限公司）；濃鹽酸、NaCl、MgCl2、氯化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸胍、氯化鎂、甲醇、溴化鉀、乙醇、三氯乙酸（TCA）：廣東光華科技股份有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、二丁基羥基甲苯（BHT）：天津渤海化工有限公司；2-硫代巴比妥酸、PBS、2,4-二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）、考馬斯亮藍：合肥千盛生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

JM型電子天平（東莞市南城長協(xié)電子有限公司）；SIGMA型高速冷凍離心機（上海力辰科學儀器有限公司）；美菱絞肉機（寧波創(chuàng)十智能科技有限公司）；300L型均質機（寶派環(huán)保科技有限公司）；DS/RE-205型真空旋轉蒸發(fā)儀（鄭州東晟儀器設備有限公司）；721G紫外可見分光光度計（浙江賽德儀器有限公司）；PHS-3C型pH計（力辰儀器有限公司）；JC-HW30A型傅里葉紅外光譜儀（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司）；FD型真空冷凍干燥機（廣東中冷制冷有限公司）；HW-S12型型恒溫水浴鍋（鄭州榮翔儀器有限公司）；ST-16A型質構儀（山東盛泰儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬肉丸的基本配方

豬瘦肉2 kg、食鹽30 g、白砂糖20 g、白胡椒粉7 g、淀粉100 g、味精2 g，將這些原料放入粉碎機中粉碎成糊狀后，按一定比例混合均勻即可制成成品。豬瘦肉用4 mm孔平板絞肉機絞碎，加原料及0.6 kg清水。空白對照組為豬肉丸的基本配方，處理組分別添加0.01%，0.03%和0.05%金銀花提取物和0.02% BHT。

1.2.2 豬肉丸的制作

對原料肉進行處理，將其絞肉和分組，添加配料，在添加不同濃度金銀花提取物及BHT的同時，攪拌均勻。將混合物蓋上保鮮膜，放入冰箱冷藏3～4 h，以確保其穩(wěn)定性。再制成每個約4 g的圓形肉丸，把豬肉丸放在聚丙烯盤子里，用一層聚乙烯的塑料薄膜包裹，放置于4 ℃冰箱里備用，在冷藏開始后的第1，第4，第7和第10天取樣，測定豬肉丸的脂肪氧化TBARS值、蛋白質二級結構、質構變化等指標。

1.3 各指標測定方法

1.3.1 豬肉丸的TBARS值測定

參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標準食品中丙二醛的測定》[12]中的方法測定TBARS值。

1.3.2 豬肉丸羰基含量的測定

采用DNPH法，參照Levine等[13]的方法并略加修改。10 g豬肉丸試樣在10 g 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7）中均勻混合，取2支試管，每支試管中加入2 mL混合溶液和2 mL 20% TCA混合，離心（10 000 r/min，5 min）。一份沉淀物用來測定蛋白質量濃度，另一份沉淀物加入2 mL濃度10 mmol/L的二硝基本肼，在4 ℃下靜置1 h，按12 000 r/min離心15 min，棄去上清液，沉淀干燥后，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍（緩沖液pH 8.7），在50 ℃下保溫45 min，在370 nm波長下測吸光度。羰基含量（nmol/mg）由式（1）計算得到。

式中：2.2×104為摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）；106為單位轉換系數(shù)；ρ為用鹽酸胍作空白在280 nm波長處測得的蛋白質量濃度，mg/mL。

1.3.3 豬肉丸巰基含量的測定

采用DTNB法，具體參考Yang等[14]的方法。由式（2）計算得到，結果以在蛋白質中含有的游離巰基物質的量表示，單位為nmol/mg。

式中：1.36×104為摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）；106為單位轉換系數(shù)；ρ為采用考馬斯亮藍法[15]在595 nm波長處所測得的肉樣蛋白質量濃度，mg/mL。

1.3.4 豬肉丸質構特性的測定

將豬肉丸切割為2 cm×2 cm×2 cm正方體試樣，在TPA模式下，使用質構儀檢測其硬度、彈性、回復性和咀嚼性，并作3個平行試驗。質構儀的主要參數(shù)：探測器型號P/50；測量前、測量時、測量后探測器速度分別為5.00，2.00和5.00 mm/s，壓縮率50%，觸發(fā)器類型為自動，觸發(fā)器質量5.0 g；檢測時間間隔5 s。

1.3.5 豬肉丸蛋白質二級結構的測定

參考Oldenhof等[16]方法，稍加修改。將豬肉丸蛋白樣品于-80 ℃冷凍8 h，再于冷凍干燥機中干燥12 h，取出5 mg樣品放入研缽，用500 mg溴化鉀研磨成粉狀。使用傅里葉紅外光譜儀，將干燥樣品粉末鋪在晶片上對其進行掃描，掃描范圍500～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描積累32次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準偏差”的方式表示。使用SPSS 2.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并對其進行方差分析和差異顯著性分析（P＜0.05），使用Origin繪圖軟件對其進行作圖。

2 結果與分析

2.1 金銀花提取物對豬肉丸脂肪氧化TBARS值的影響

肉類食品中的油脂在儲藏和加工中容易被氧化，引起色澤變化和味道變化，嚴重影響食品的品質。金銀花提取物對豬肉丸的脂肪氧化作用如圖1所示。冷藏1 d，TBARS組均未見顯著性差異（P＞0.05）。冷藏期間，每個處理組豬肉丸的TBARS都隨時間的延長而升，表明其脂肪的氧化作用也隨之增強。隨著冷藏時間的延長，脂肪氧化TBARS會隨之升高[17]。冷藏4～10 d時，添加0.03%金銀花提取物的TBARS值都明顯低于空白對照組（P＜0.05），0.03%金銀花提取物的作用比0.01%和0.05%的效果更好，表明金銀花提取物具有更好的抗氧化作用。在4～10 d的冷藏過程中，對照組0.02% BHT的TBARS值明顯降低（P＜0.05）。冷藏7 d后，0.02% BHT組TBARS值明顯低于0.03%處理組（P＜0.05），這說明BHT在抑制脂肪氧化方面的作用要強于金銀花提取物，后續(xù)可以考慮兩者結合使用，適當降低合成抗氧化劑用量。將不同植物提取物添加到肉制品中，可抑制脂肪氧化和蛋白質氧化，提高肉的品質，延長其保質期[18]。

圖1 金銀花提取物對豬肉丸冷藏過程中脂肪氧化TBARS的影響

2.2 金銀花提取物對豬肉丸羰基含量的

蛋白氧化會影響肉的品質，導致營養(yǎng)價值下降[22]。羰基化合物的產生是蛋白質氧化過程中最重要產物中的一種，通常用其含量表述蛋白質的氧化程度。肉制品的顏色、嫩度和凝膠特性等品質由蛋白質氧化程度的大小決定，此外，蛋白質羰基化還會對肽鏈的一級結構造成破壞，從而對蛋白質的疏水性產生影響[23]。所以，抑制蛋白氧化對提高肉制品品質是至關重要的。

如圖2所示，在冷藏期間4個處理組豬肉丸中的羰基含量均明顯降低（P＜0.05）。在前4 d，各處理組肉丸中的羰基含量變化不大，表明在貯藏初期加入金銀花提取物對豬肉丸中的羰基含量無顯著變化；冷藏至7 d后，如圖2所示，羰基含量從38 nmol/kg降低到30 nmol/kg，存在顯著差異，其中添加0.03%金銀花提取物處理后，豬肉丸中的羰基和蛋白質氧化率均較低。研究結果表明，加入金銀花提取物能有效地減少豬肉丸中蛋白質的氧化，且以0.03%的效果最好。

圖2 金銀花提取物對豬肉丸冷藏過程中羰基含量的影響

2.3 金銀花提取物對豬肉丸中巰基含量的影響

在肉丸貯藏期間，蛋白氧化是引起肉類品質下降的主要原因。蛋白過多的氧化作用會導致蛋白的交聯(lián)及羰基的產生，進而影響蛋白的功能性質。因為半胱氨酸中的巰基不穩(wěn)定，所以很容易被氧化形成二硫鍵，導致半胱氨酸側鏈上的巰基丟失，因此，巰基含量的改變能夠直接反映蛋白的氧化程度[22]。而硫酸根的減少，則會增加蛋白的氧化程度。從圖3可以看出，各處理組的巰基含量都有下降趨勢，對照組巰基含量從11.6 nmol/kg下降到5.2 nmol/kg，速度最快。添加金銀花提取物和BHT均會對巰基含量產生顯著的影響（P＜0.05）。1 d后，處理與對照兩組間的巰基含量比較，均未見明顯變化（P＞0.05）。從第4天開始，0.01%和0.03%金銀花提取物和第7 d的0.05%金銀花提取物處理組開始顯著抑制巰基含量的降低（P＜0.05），表明金銀花提取物對巰基有較好的保護作用，在貯藏過程中，金銀花提取物能夠抑制豬肉丸中巰基基團的減少，也就是能夠抑制蛋白質的氧化。冷藏10 d后，在各處理（0.01%，0.03%和0.05%）組和0.02%BHT組之間，巰基水平沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 金銀花提取物對豬肉丸冷藏過程中巰基含量的影響

2.4 金銀花提取物對豬肉丸冷藏過程中質構特性的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，植物提取物能夠有效抑制肉中脂肪和蛋白等物質的氧化，從而提高肉制品的品質[23]。從表1可以看出，所有處理組的豬肉丸硬度隨著冷藏時間的延長，都呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。在10 d的冷藏期間，加入金銀花提取物（0.01%和0.05%）的豬肉丸的硬度與對照相比無顯著性差異，而加入0.03%的金銀花提取物的豬肉丸的硬度在7 d后顯著提高（P＜0.05），表明金銀花提取物對豬肉丸的硬度有顯著差異 。金銀花提取物處理組的豬肉丸彈性變化不明顯（P＞0.05）。結果表明，隨著金銀花提取物添加量的增多，豬肉丸的回復性明顯提高（P＜0.05），0.05%金銀花提取物處理組最明顯，0.03%金銀花提取物處理組其次。與對照組比較，10 d時，加入金銀花提取物處理組的豬肉丸咀嚼性較對照有明顯改善（P＜0.05），而加入0.05%金銀花提取物的豬肉丸在第1天的咀嚼性也有明顯改善。肉制品的質構特性與其本身所含的蛋白質、脂肪和水分之間密切相關。蛋白質氧化導致羰基含量增加、蛋白質交聯(lián)，脂肪氧化會對肌纖維膜的完整性產生破壞，此情況會造成肉制品中的水和脂肪丟失，從而對肉制品的質構特性產生影響[24]。

表1 豬肉丸冷藏過程中的質構特性

2.5 不同濃度金銀花提取物對豬肉丸蛋白質二級結構的影響

不同處理組試樣（400～3 600 cm-1）的紅外光譜分析結果如圖4所示。在對紅外光譜中，主要通過肽鍵C＝O的伸縮振動進行對比，其中也包括Cα—C—N的彎曲振動、C—N的伸縮振動、N—H的面內彎曲振動，從而為蛋白質二級結構的信息提供可能，表現(xiàn)出金銀花提取物處理對豬肉丸樣品的蛋白質結構變化的影響。酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）是一種與蛋白構象、二級結構密切相關的振動信號[25]。金銀花提取物添加量由0.01%增加至0.03%時，α-螺旋含量降低（P＞0.05），β-折疊含量增加，而β-轉角和無規(guī)卷曲的相對含量差異不顯著（P＞0.05）。圖5表現(xiàn)出不同處理組豬肉丸中蛋白二級結構含量的變化。金銀花提取物從0.03%升高到0.05%，α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲的相對含量差異不顯著（P＞0.05）。由此可以得知，經過不同濃度金銀花提取物處理的豬肉丸樣品，其蛋白質二級結構由松散變得規(guī)律、完整。蛋白質結構可以從α-螺旋和β-折疊判斷，而無規(guī)卷曲和β-轉角則是蛋白結構的隨機變化。其中，0.03%金銀花提取物處理組的豬肉丸表現(xiàn)出最高的α-螺旋含量，最低的β-轉角和無規(guī)卷曲含量，表明金銀花提取物在豬肉丸中的最適添加量為0.03%。

圖4 不同處理組豬肉丸蛋白質的紅外光譜圖

圖5 各組二級結構含量情況

3 結論

試驗將金銀花提取物（0.01%，0.03%和0.05%）分別添加到豬肉丸中，置于4 ℃（1，4，7和10 d）冷藏后，采用人工合成抗氧化劑BHT作為對照，采用不添加抗氧化劑作為空白對照，考察其對保鮮效果的影響。結果顯示：添加金銀花提取物的豬肉丸，其抗氧化性顯著提高；加入0.03%和0.05%的金銀花提取物能明顯降低TBARS，使羰基含量明顯減少，而巰基含量明顯增加；紅外光譜結果表明，隨著提取物添加量的增加，樣品蛋白質二級結構中的α-螺旋結構數(shù)量也跟著增加，而無規(guī)卷曲結構的數(shù)量則顯著降低；金銀花提取物處理后，豬肉丸的咀嚼性得到顯著提高，但對肉丸的硬度和彈性沒有顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn)，金銀花提取物是一種天然抗氧化劑，可保證食品質量的同時，有效地延長食品的保質期，提高食品安全水平，是一種極具有應用前景的新型食品添加劑，在未來生產改良的肉制品方面具有很大的應用潛力。