基因檢測及骨髓切片活檢與血清TK1 在骨髓增生異常綜合征與溶血性貧血鑒別診斷中的研究

盧金金，曹天星

（河南省中醫藥大學第二附屬醫院河南省中醫院，河南 鄭州 450002）

MDS 是一種血液系統惡性疾病，與造血干細胞惡性克隆有關，多表現為造血障礙或衰竭、血細胞減少等[1-3]，臨床證實MDS 與白血病相關，約三成MDS 患者易進展至急性髓系白血病[4-5]。MDS 在老年群體中多發，其病因復雜尚未明確，可能與長期接觸強電磁場、輻射或有機溶劑有關[6-7]，目前臨床診斷MDS 的方式主要為骨髓細胞形態學及核型檢測[8-9]。MDS 臨床征象表現為貧血，但與HA、巨幼細胞貧血（Megaloblastic anemia，MA）、再生障礙性貧血（Aplastic anemia，AA）等形態學相似，HA 是由紅細胞存活率下降且滅亡速度超過骨髓代償而導致的貧血，是一種血液系統良性疾病[10-11]，在臨床上與低原始細胞MDS 核型表現相似，故難以鑒別，給臨床診斷帶來困難。為了讓患者早診斷、早治療、預后佳，對MDS 及HA 進行準確鑒定至關重要[12-13]。血清TK1 是細胞質中與細胞增殖相關的一種關鍵酶，其表達量與細胞增殖特性相關，其濃度上升預示著腫瘤細胞的增多[14-15]。目前，通過血清TK1 診斷MDS 與HA 的文章稀缺，使用ROC 曲線對其診斷價值做出分析的文章尚無，故本研究通過探究基因檢測、骨髓活檢切片及血清TK1 在MDS 與HA 患者中的診斷價值，為其臨床診斷及治療提供科學依據，現將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本院2016 年1 月至2020 年12月收治的63 例MDS 患者與57 例HA 患者作為研究對象，回顧性分析其臨床資料。納入標準：

（1）MDS、HA 的診斷標準均符合2008 年WHO 分類標準；（2）均經病理確診為MDS 或HA患者；（3）臨床資料完整；（4）貧血患者檢查前未服用影響造血功能藥物或行輸血。排除標準：（1）合并認知異常、精神疾病；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）合并妊娠、哺乳期婦女；（4）合并感染疾病；（5）合并重要臟器功能異常。

1.2 方法 收集所有患者性別、年齡、血紅蛋白、血小板計數等一般臨床資料。

骨髓活檢切片檢查：骨髓活檢針（B65-01 型）進行局部麻醉后行骨髓穿刺術，取長度≥0.3 cm骨髓標本，脫水包埋處理后切片3 μm 厚，染色后鏡下觀察樣本中是否存在幼紅細胞簇異常分布、幼稚前體細胞異常定位（Nomallocalization of immature precursors，ALIP）、單圓核及多圓核病態巨核細胞情況。

基因檢測：取2～3 mL 的骨髓標本，通過乙二胺四乙酸進行抗凝處理，依據2：1 比例加入Tizol提取mRNA 后逆轉錄cDNA，采用熒光定量PCR檢測患者基因突變、融合、數量異常增多情況。MDS組與HA 組涉及的經典基因異常主要為N-RAS 基因、FMS 樣的酪氨酸激酶3（Fms-like tyrosine kinase 3，FLT3）、急性粒細胞性白血病1 基因（Acute Myeloid Leukemia 1 Gene，AML1）、逆轉錄病毒結合位點-1（Cotropicvirusintegrationsite 1，EVI-1）、TEL 基因（ETV6 基因）、混合譜系白血病(Mixed lineage leukemia，MLL)基因、人體抑癌基因p53、干擾素調節因子1(Interferon regulatory factor-1，IRF-1)基因突變、融合或異常表達等。

采集所有患者清晨空腹肘靜脈血3 mL，采用3 500 r/min 離心10 min 后分離上層血清，將其放置在-70℃冰箱內保存待測。采用酶免疫點印跡化學發光法檢測所有患者血清TK1 水平（檢測結果如圖1-4），儀器為LAS4000 型化學發光成像分析儀，試劑盒購自上海語純生物科技有限公司，所有操作過程按照說明書由同一組檢驗人員嚴格執行。

圖1 TK1 染色陰性

圖2 TK1 染色弱陽性

圖3 TK1 染色陽性

圖4 TK1 染色強陽性

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，計數資料用n（%）表示，進行χ2檢驗；符合正態分布的計量資料用（）表示，行t 檢驗，采用ROC 曲線分析血清TK1 對區分MDS 與HA 的診斷價值，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般臨床特征資料比較 MDS 組與HA 組患者性別、年齡、血紅蛋白差異無統計學意義（P＞0.05），MDS 組患者血小板計數顯著低于B組，組間差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者一般臨床特征資料比較結果

2.2 兩組患者基因檢測分析比較 MDS 組患者基因異常30 例（47.62%），HA 組患者基因異常0 例（0.00%），差異有統計學意義（χ2=36.190，P=0.000＜0.05）。

2.3 兩組患者骨髓活檢切片特征比較 MDS 患者骨髓活檢分析結果顯示，出現32 例幼紅細胞簇異常分布、44 例ALIP 與34 例單圓核與多圓核病態巨核細胞，HA 組出現29 例幼紅細胞簇異常分布與5 例ALIP，未發現單圓核與多圓核病態巨核細胞；兩組患者ALIP 與單圓核與多圓核病態巨核細胞的組間差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組患者骨髓活檢切片特征比較結果

2.4 兩組患者血清TK1 水平比較 MDS 組血清TK1 水平顯著高于HA 組，組間差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 兩組患者血清TK1 水平比較結果

2.5 血清TK1 對區分MDS 與HA 的診斷價值分析ROC 曲線分析顯示，血清TK1 區分MDS 與HA診斷的AUC 為0.936，敏感度為93.7%，特異度為93.0%，數據結果均有統計學意義（P<0.05），見表4、圖5。

表4 血清TK1 對區分MDS 與HA 的診斷價值分析結果

圖5 血清TK1 對診斷MDS 與HA 的ROC 曲線

3 討論

MDS 患者存在白血病的征兆，已成為危害患者生命健康的惡性疾病，大量患者在MDS 病發后進展至急性髓系白血病[16-18]，且部分患者因誤診、錯診等因素導致錯過最佳的對癥治療機會，預后情況較差[19]。MDS 與HA 臨床表現缺乏特異性，兩類患者均存在貧血、乏力情況，常規使用藥物治療并不能達到理想的治療效果，且對于部分骨髓中原始細胞低的患者來說，增加了診斷的難度[20-21]。本研究通過分析基因檢測、骨髓活檢切片與血清TK1 在診斷MDS 與HA 患者中的區別，旨在為兩類患者的鑒別提供有效參考和依據，為患者治療及預后保駕護航。

本研究顯示兩組患者一般資料中血小板計數的差異有統計學意義（P<0.05），且MDS 患者比HA患者血小板計數顯著要低，這是由于MDS 患者的臨床表現多為貧血癥狀，或為外周血三系中的任意系減少、異常，故部分MDS 患者血小板會顯著降低，HA 患者的臨床表現亦為貧血，或外周血三系減少，但血小板計數的降低并不是它主要特點，故MDS 患者血小板計數低于HA 患者，但單純血小板這一數據的檢測結果，并不能作為診斷患者具體病情的科學指標。本研究中MDS 患者基因異常檢出率為47.62%，而HA 患者基因異常檢出率為0.00%，表面MDS 患者基因異常情況較HA 多，基因異常在臨床中多與惡性細胞繁殖、分化或惡性疾病進展、預后密切相關，故基因檢測能夠作為鑒別MDS 與HA 的有效輔助手段，能夠一定程度上提升MDS 患者的檢出概率。在MDS 患者診斷中，骨髓活檢切片能夠體現病態細胞分布異常情況與原始細胞在骨髓小梁旁呈現的簇狀定位[22]，本研究結果顯示MDS 患者骨髓活檢切片中出現ALIP、單圓核與多圓核病態巨核細胞的概率顯著高于HA 患者，但兩組患者幼紅細胞簇異常分布情況差異無統計學意義（P＞0.05），由此表明MDS 患者采取該種方式對MDS 粒系、巨核系病態的檢出率較高，能夠作為臨床輔助診斷的有效方式。TK1 是胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）的一種，主要在機體增殖細胞中表現，存在于脾臟、骨髓等組織中，通過細胞質進行表達，且與DNA 的作用機制相關。本研究中MDS 患者的血清TK1 表達量顯著高于HA 患者，且TK1 對診斷MDS 與HA 的敏感度較高，預示著能夠將血清TK1 作為鑒別診斷MDS的有效標志物，究其原因在于，隨著腫瘤中DNA的大量合成，腫瘤細胞增殖與分化的速度加快，TK1 表達量突增[23-24]。MDS 是一種造血干細胞惡性多克隆性疾病，該類患者骨髓及其余造血組織細胞異常，故TK1 在該類患者機體內水平較高，能夠將其作為細胞異常增殖動力學標志物，為臨床治療提供參考依據。

綜上所述，MDS 患者基因檢測中基因異常及骨髓活檢切片檢查中出現ALIP 和單圓核與多圓核病態巨核細胞的概率均高于HA 患者，且MDS患者血清TK1 表達量高于HA 患者，故基因檢測、骨髓活檢切片及血清TK1 均能作為輔助診斷區分MDS 與HA 的可靠指標，值得臨床參考借鑒。但本研究存在一定的不足，例如樣本數量有限，在今后的研究中將會進一步擴大樣本容量，使研究結果更具有說服力。