皇冠梨渣中熊果苷的純化工藝

張樂樂, 楚艷艷, 楊 歐, 汪菲菲, 劉生杰

(1.阜陽師范大學 生物與食品工程學院,安徽 阜陽 236037;2.阜陽師范大學 信息工程學院食品系,安徽 阜陽 236041;3.安徽農業大學 茶與食品科技學院,安徽 合肥 230036)

皇冠梨主要產自河北趙縣,果實橢圓、果肉細膩多汁、風味酸甜,含有多種組生態與纖維素,適合加工果汁飲料.同時,皇冠梨具有補充營養利尿、清心潤肺等功效.以加工過程中產生的梨皮和梨核為原料進行再開發,不僅能夠增加附加經濟效益,而且可以減少環境污染.熊果苷是綠色植物中天然存在的糖苷類物質,具有抗微生物、抗氧化、抗炎活性[1].梨皮中含有豐富的熊果苷[2],梨中主要的多酚物質是熊果苷和兒茶素[3],其中熊果苷能迅速深入肌膚,有效抑制酪氨酸酶活性、黑色素合成和皮膚色素沉積,對色斑和雀斑有明顯的去除效果,在化妝品中有廣泛應用[4].通過對梨渣中的熊果苷進行提取和純化,為提高梨渣的附加價值提供參考依據.

1 實驗材料

1.1 實驗材料與試劑

梨渣:新鮮的皇冠梨榨汁后廢棄梨皮、梨核,置于干燥箱60 ℃至恒重,用粉碎機粉碎至粉末,過40目篩后備用.熊果苷標準品(arbutin),分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酪氨酸酶,無水乙醇,分析純,天津市永大化學試劑有限公司;無水甲醇,色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;乙酸乙酯,色譜純,西隴科學股份有限公司;HPD100大孔吸附樹脂,東鴻化工有限公司;D101大孔吸附樹脂,北京索萊科技有限公司;AB-8大孔吸附樹脂,廣州韋伯科技有限公司;還有其他常見玻璃儀器.

1.2 實驗儀器

RE52CS旋轉蒸發器,上海亞榮生化儀器廠;DGT-G電熱鼓風干燥箱,合肥華德利科學器材有限公司;LC-16高效液相色譜儀,島津儀器蘇州有限公司;超聲波清洗機,上海聲彥超聲波儀器有限公司;還有其他常見玻璃儀器.

1.3 實驗方法

1.3.1 熊果苷的提取

分別稱取適量梨皮、梨核、梨肉等樣品,按料液比1∶10(g/mL)分別加入無水乙醇,靜置過夜.然后超聲1 h,過濾得到熊果苷提取液,共過濾兩次.將兩次濾液合并后定容至50 mL,重復3次,備用.

1.3.2 熊果苷含量分析

(1)標準品溶液的制備.精確稱取0.000 7 g熊果苷標準品溶解于1.00 mL甲醇溶液作為儲備液,然后用甲醇逐級稀釋,分別配制成濃度依次為0.75、1.5、3、6、12、24 μg/mL的標準溶液,備用.

(2)待測品溶液的制備.采用1.3.1的實驗步驟得到濾液,分析備用.

(3)液相色譜條件.固定相:色譜柱WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相∶水—甲醇(體積比)=9∶1.流速0.5 mL/min.柱溫30 ℃.檢測波長:220 nm.進樣量:5 μL.

(4)標準曲線的繪制.根據熊果苷標準品的高效液相色譜圖,以熊果苷濃度對峰面積作圖,可得線性回歸方程,計算出梨皮、梨肉和梨核中的熊果苷含量.

1.3.3 方法學評價

(1)加標回收率.在樣品中分別加入高、中、低三個濃度標準儲備液,配置成加樣回收液,經平行提取,檢測含量并計算回收率.

(2)精密度實驗.取12 μg/mL的標準品溶液,按照1.3.2色譜條件,檢測6次,計算標準相對偏差(RSD).

1.3.4 大孔樹脂對熊果苷分離純化的影響

(1)大孔樹脂的預處理.分別取適量的AB-8 、HPD100和D101三種型號的大孔樹脂,活化后濕法上柱.經計算一個柱體積(BV)約為15 mL.

(2)三種大孔樹脂對梨渣中雜質的吸附情況.將濃縮好的梨渣樣品上樣后,用不同濃度的乙醇溶液(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)進行洗脫,洗脫體積為2 BV.所得流份按洗脫液分成若干等量樣品,進行薄層色譜檢測和高效液相色譜檢測.

(3)薄層色譜檢測.選用硅膠G254板為固定相,以乙酸乙酯∶甲醇(體積比)=3∶1為展開劑,在室溫下上行展開,取出,晾干,置碘蒸氣中熏蒸5 min后取出,在日光下檢視.

(4)高效液相色譜檢測.取經過三種大孔樹脂純化后效果最好的流份各1.00 mL,按照1.3.2色譜方法進行檢測.

1.3.5 酶活測定

酪氨酸酶活性抑制檢測方法,參照文獻[5]的實驗方法略做修改,反應體系組成見表1.依次添加溶液置于96孔板混勻,保溫30 ℃靜置2 h,然后于475 nm處測吸光度,每組平行實驗3次.酶活抑制率的計算公式為

式中,A1、A2、A3、A4分別表示反應體系1、2、3、4在475 nm處測得的吸光度.同時用含5%(質量濃度)煙酰胺的小白瓶(OLAY)作對照組.

表1 反應體系組成

1.3.6 數據分析

所有數據重復3次,用“平均值±標準差”表示.采用Origin Pro 8.6軟件繪圖分析.

2 結果與討論

2.1 梨渣中熊果苷含量分析

液相色譜法主要是依據保留時間和峰面積來定性定量檢測目標物[6].按照1.3.2的方法,利用高效液相色譜法鑒定梨渣提取物中的成分,結果如圖1所示.A圖是梨渣提取物的色譜圖,目標物質的出峰時間是10.322 min. B圖是熊果苷標準品的色譜圖,出峰時間是10.307 min.比較兩者的保留時間,可以確定梨渣中含有熊果苷.

圖1 梨渣提取物與熊果苷標準品液相色譜圖

圖2 梨不同部位熊果苷含量比較

根據熊果苷的濃度與峰面積之間的關系,得到標準曲線y=14170x+5044.3,R2=0.998 3.可以看出,熊果苷在0.75～24 μg/mL范圍內的線性關系良好.皇冠梨不同部位的熊果苷含量見圖2.結果發現,發現梨皮中熊果苷的含量為22.85±1.67 μg/g,梨肉為5.05±1.12 μg/g,梨核為8.42±0.60 μg/g,在梨皮中的熊果苷含量最多,其次是梨核,梨肉最低,結果與文獻[7]結果是一致的.郭靜[8]研究指出,熊果苷易溶于水可能與熊果苷的運輸有關,熊果苷在梨樹體內合成后,因其溶解性可能會造成隨著水分的運輸表現出分布不均勻現象.果皮是熊果苷含量最高的部位,可能是由于梨果皮存在蒸發現象,使得果實內的熊果苷向外緣富集所導致[9].

2.2 方法學評價

2.2.1 加標回收率

在樣品中分別加入高、中、低三個濃度的標準儲備液,配置成三種不同濃度的加樣回收液,按照上述條件進行分析,對添加3、6、12 μg/mL三個水平的梨皮中的熊果苷做樣品加樣回收實驗,平均加標回收率為97.22%、100.83%、100.44%,相對標準偏差(RSD)分別為1.42%、1.19%、1.96%,均小于2%,說明檢測的結果準確可靠.

2.2.2 精密度實驗

取12 μg/mL的熊果苷標準品溶液,按照上述高效液相色譜的條件,連續進樣6次進行實驗.計算相對標準偏差(RSD)=1.08%,說明精密度良好.

2.3 大孔樹脂分離純化效果

2.3.1 薄層色譜結果

將樣品經過大孔樹脂純化的不同流份進行薄層層析,三種型號的大孔樹脂純化結果見圖3～圖5.圖3是梨渣濃縮樣品經過AB-8大孔樹脂分離純化后的薄層色譜圖.其中1-13號為13個流份,14號是熊果苷標準品.可以看出,熊果苷的Rf=0.85,其中1-6號流份雜質較多;相比而言,7號流份的分離效果比較理想,含有的雜質較少,而8-13號流份拖帶現象嚴重.圖4是梨渣濃縮樣品經過HPD100大孔樹脂分離純化后的薄層色譜圖.1-13號為13個流份,14號是熊果苷標準品.可以看出,相比而言,4號流份的純化效果比較理想.

圖3 AB-8大孔樹脂分離后的流份薄層色譜圖 圖4 HPD100大孔樹脂分離后的流份薄層色譜圖

圖5 D101大孔樹脂分離后的流份薄層色譜圖

圖5是梨渣濃縮樣品經過D101大孔樹脂分離純化后的薄層色譜圖.其中,1-13號為13個流份,14號是熊果苷標準品.可以看出,5號流份的純化效果最好.6～12號流份可以檢出熊果苷,但是由于其他雜質的影響,拖尾比較嚴重.

比較以上不同薄層色譜板的分離純化效果,發現大孔樹脂AB-8分離得到的7號流份、大孔樹脂HPD100的4號流份、大孔樹脂D101的5號流份的純化效果比較理想,經高效液相色譜法進一步驗證,篩選出最佳分離效果的大孔樹脂.

2.3.2 高效液相色譜分析結果

將大孔樹脂AB-8分離得到的7號流份、大孔樹脂HPD100的4號流份、大孔樹脂D101的5號流份進行高效液相色譜分析,結果見圖6.A圖是AB-8的7號流份,B圖是HPD100的4號流份,C圖是D101的5號流份,根據高效液相色譜檢測得出的色譜圖結果,對比分析后得出D101的純化效果最好.

圖6 三種型號大孔樹脂的色譜圖

D101是非極性樹脂,AB-8樹脂屬于弱極性,HPD100屬于非極性樹脂[10].三種型號的大孔樹脂具有適中的孔徑和較大的比表面積,屬于弱極性樹脂,可以有效減少對極性雜質的吸附.通過對比,D101型號的大孔樹脂純化后的流份經過高效液相色譜分析,與前兩者相比,雜質去除效果明顯,分離純化效果最好.

2.4 測定酶活實驗結果

依據1.3.5實驗方法添加樣品于96孔板后,2 h后用酶標儀測定熊果苷對酪氨酸酶活性的抑制情況.配制3組平行實驗,利用相關數據經計算得出,大孔樹脂D101分離純化的5號流份對酪氨酸酶的抑制率為39.70±0.99%,5%煙酰胺的抑制率為57.20±0.19%.純化的熊果苷對酪氨酸抑制率低于5%煙酰胺的酶活抑制率,主要是由于提取的樣品中含有少量的雜質,但是美白活性及其作用機理還需要進一步研究.

3 結論

以皇冠梨為原料提取熊果苷,利用高效液相色譜法檢測出梨皮、梨核、梨肉中熊果苷的含量分別為22.85±1.67 μg/g, 8.42±0.60 μg/g,5.05±1.12 μg/g.對比AB-8、HPD100和D101三種型號的大孔樹脂對梨渣中熊果苷的純化效果,發現大孔樹脂D101的分離純化效果最好,其中5號流份的純度較高,其對酪氨酸酶的抑制率為39.70±0.99%,低于5%煙酰胺的抑制率57.20±0.19%.研究成果為后續的梨渣分離純化工藝提供了較好的實驗依據,也為其在美白領域的應用提供了思路和方法.