CBX4 基因rs1285251 位點單核苷酸多態性與子宮肌瘤的關系研究

陸美茵 朱東艷 光曉燕 李劍

子宮肌瘤是女性生殖系統最常見的腫瘤, 好發于30～50 歲女性, 發病率高達33%［1］, 但其確切的病因尚未闡明。已有研究提示, 子宮肌瘤具有遺傳易感性, 其發病與特定基因的多態性密切相關, 如雌激素代謝通路基因COMT、SULT1A 以及DNA 損傷修復與細胞增殖基因XPC、XRCC1［2-5］。從遺傳學層面揭示子宮肌瘤的易感因素, 對該疾病的早期篩查、治療抉擇及預后監測無疑具有重要意義。色素框同源蛋白4(chromobox protein homolog 4, CBX4) 隸 屬 多 梳 蛋 白 家族(polycomb-group proteins, PcG), 是多梳抑制復合物1(poly-comb repressive complex 1, PRC1)的 重 要 組 成 蛋白［6］。CBX4 通過對H3K9me3、H3K27me3 等染色體組蛋白的泛素化修飾, 促進染色體重塑而抑制下游基因轉錄, 以此調控DNA 修復、細胞增殖、分化及衰老等生理或病理機能［7-9］。既往研究表明, CBX4 基因多態性與多種腫瘤發病風險或預后相關。Tan 等［10］報道該基因rs2289728 位點GA 基因型攜帶者罹患肝細胞肝癌的風險顯著升高, Luo 等［11］發現其rs77447679 位點CA 基因型是胃癌的易感因素。作者在子宮肌瘤易感基因篩查工作中, 發現CBX4 基因rs1285251 位點單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)與子宮肌瘤發病及臨床病理特征間關系密切, 該位點有望成為子宮肌瘤風險預測的新靶標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年2 月～2020 年1 月在深圳市寶安區婦幼保健院就診的子宮肌瘤患者419 例作為病例組, 所有患者均通過術后組織病理學確診為子宮平滑肌瘤, 年齡21～49 歲, 平均年齡(36.1±7.5)歲。選取同期在本院體檢的499 例健康女性作為對照組,經B 超檢查排除子宮肌瘤, 年齡23～50 歲, 平均年齡(36.7±8.8)歲。兩組研究對象的一般資料比較, 差異無統計學意義(P＞0.05), 具有可比性。兩組研究對象均為漢族, 均排除了惡性腫瘤、其他女性生殖系統疾病、內分泌疾病且近半年內無激素類藥物治療史。研究獲得寶安區婦幼保健院醫學倫理委員會批準, 入組者均簽署研究知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 EDTA 采血管采集兩組研

究對象2 ml 肘靜脈外周血, 置于-20℃冰箱保存。使用MagaBio plus 全血基因組DNA 純化試劑盒(杭州博日科技股份有限公司)抽提DNA, 紫外分光光度計檢測DNA 濃度及純度, 操作嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.2 基因分型 利用NCBI dbSNP 數據庫和SNPinfo數據庫, 以漢族女性人群最小等位基因頻率＞5%為檢索條件, 查詢CBX4 基因位點的SNP。本研究選擇其中的rs1285251(IVS2 C＞T)位點為研究對象。采用MassARRAY (Agena Bioscience 公 司, 美 國) 方 法予CBX4 基因SNP 分型檢測［12］：①樣本DNA 行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。反應總體積5 μl, 反應條件94℃ 4 min, 94℃ 20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 45 個循環, 72℃ 3 min。②蝦堿性磷酸酶去除體系中游離dNTPs。③單堿基延伸, 反應總體積9 μl, 反應條件94℃ 4 min, 94℃ 5 s, 52℃ 5 s, 72℃ 5 s, 40 個循環。④MassARRAY Nanodispenser RS1000 點 樣 儀, 將 延伸產物移至SpectroCHIP (Agena)芯片。⑤基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析芯片數據, TYPER 4.0 軟件予結果分型。擴增引物序列為5'-ACGTTGG ATGCCACTTTGCTTCGCACAGAG-3', 5'-ACGTTGGA TGTCAGGAGGCAGAAGCTCAG-3'。延伸引物序列為5'-CACCTCTGGCCCTCC-3'。

1.3 統計學方法 采用SPSS27.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t 檢驗；遺傳平衡分析采用Hardy-Weinberg 平衡檢驗；基因型頻率及等位基因頻率以率(%)表示, 采用χ2檢驗；單變量和多變量Logistic 回歸計算相對優勢比(odd ratio, OR)與95%可信區間(confidence interval,CI)。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Hardy-Weinberg 平衡檢驗結果 病例組和對照組CBX4 基因rs1285251 位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(χ2=2.110、3.205, P=0.146、0.073＞0.05)。結果提示納入的研究對象具有群體代表性。見表1。

2.2 兩組基因型頻率及等位基因頻率分布比較 病例組與對照組CBX4 基因rs1285251 位點基因型頻率及等位基因頻率分布比較, 差異均具有統計學意義(P＜0.05)。病例組人群TT 基因型較對照組人群更為常見(占比依次為12.17%、6.41%), 等位基因T 頻率亦顯著高于對照組(占比依次為32.58%、28.36%)。見表2。

2.3 CBX4 基因多態性與子宮肌瘤發病風險的關系與CC基因型相比, 攜帶TT基因型人群子宮肌瘤發病風險明顯升高［OR=2.046, 95%CI=(1.268, 3.301), P=0.003＜0.05］, 校正年齡后仍有統計學差異［OR=1.951,95%CI=(1.138, 3.344), P=0.015＜0.05］。再 對 該 位 點 顯性與隱性模型進行分析, 結果顯示隱性模型條件下,TT 基因型攜帶者與TC+CC 基因型相比罹患子宮肌瘤的風險更高［OR=2.023, 95%CI=(1.273, 3.212), P=0.003＜0.05］, 校正年齡后仍有統計學差異 ［OR=2.018,95%CI=(1.201, 3.393), P=0.008＜0.05］。顯性模型條件下各基因型與子宮肌瘤發病風險無關(P＞0.05)。見表3。

2.4 CBX4 基因多態性與子宮肌瘤臨床病理特征的分層分析 進一步評價了隱性模型條件下, CBX4 基因多態性與子宮肌瘤臨床病理特征間的關聯度。分層分析顯示, 攜帶TT 基因型的＜40 歲女性子宮肌瘤患 病 風 險 明 顯 升 高［OR=1.811, 95%CI=(1.054, 3.110),P=0.031＜0.05］, 校正年齡后仍有統計學差異［OR=1.839,95%CI=(1.036, 3.264), P=0.037＜0.05］；但TT 基因型并未影響≥40 歲女性罹患肌瘤的風險。此外, TT 基因型攜帶者出現多發性肌瘤［OR=2.432, 95%CI=(1.406,4.209), P=0.001＜0.05］、校正年齡后仍有統計學差異［OR=2.726, 95%CI=(1.438, 5.167), P=0.002＜0.05］, 肌壁 間 肌 瘤［OR=2.145, 95%CI=(1.320, 3.485), P=0.002＜0.05］、校正年齡后仍有統計學差異［OR=2.025,95%CI=(1.170, 3.504), P=0.012＜0.05］及大體積肌瘤(最大 肌 瘤 長 徑≥5 cm)［OR=2.124, 95%CI=(1.300, 3.470),P=0.003＜0.05］、校正年齡后仍有統計學差異［OR=2.138,95%CI=(1.231, 3.714), P=0.007＜0.05］的風險顯著增加。上述結果提示rs1285251 位點對子宮肌瘤患病風險的影響與年齡、腫瘤數量、腫瘤位置與最大肌瘤長徑相關聯。見表4。

表1 兩組Hardy-Weinberg 平衡檢驗結果［n(%)］

表2 兩組基因型頻率及等位基因頻率分布比較［n(%)］

表3 Logistic 回歸分析CBX4 基因多態性與子宮肌瘤的關系

表4 CBX4 基因多態性與子宮肌瘤臨床病理特征的分層分析

3 討論

子宮肌瘤是常見的婦科生殖腫瘤。盡管其表現為良性生物學行為, 肌瘤所導致的異常子宮出血、疼痛、繼發性不孕及感染等病變則嚴重危害女性身心健康及生活質量［13,14］。隨著精準醫學時代的來臨, 從基因篩查層面提高肌瘤易感人群的識別度、探尋肌瘤生物學特征的預測靶點, 對子宮肌瘤早期預防監測、優化治療方案及降低并發癥風險均具有重要意義。

CBX4 編碼基因位于17q25.3, 全長6.24kb, 包含5 個外顯子與4 個內含子區［15］。本次研究中, 作者首次報道了CBX4 基因rs1285251 位點SNP 與子宮肌瘤發病及臨床病理特征間的關系。結果表明與TC 或CC基因型攜帶者比較, TT 基因型攜帶人群罹患子宮肌瘤風險顯著升高。分層研究顯示, 該位點的風險效應存在于＜40 歲的女性。由于該年齡段女性處于育齡期,早期預測子宮肌瘤的發病風險無疑有助于加強預防監測, 保障生殖健康。大體積肌瘤、多發性肌瘤及肌壁間肌瘤都易于造成宮腔狹窄和子宮牽張, 是導致子宮出血、繼發不孕與腹部墜脹疼痛的重要原因, 常需要臨床治療干預［16-19］。作者的研究提示TT 基因型恰是上述肌瘤特征的遺傳易感因素, 因此, 其對相關人群的治療決策有重要參考價值。

rs1285251 定位于CBX4 基因2 號內含子區［10］, 該SNP 位點C/T 堿基轉換是否對CBX4 功能有調控作用目前尚不清楚。作者通過eOTLQen 平臺(www.eqtlgen.org)對rs1285251 予以表達數量性狀位點(expression quantitative trait loci, eQTL)分析［20］, 發現該位點T 堿基轉換能顯著上調CBX4mRNA 表達水平(資料未顯示)。Berta 等［21］和Chuang 等［22］均證實與正常子宮肌壁比較, 子宮肌瘤組織中CBX4mRNA 表達水平明顯升高, 并認為CBX4 高水平表達可能參與子宮肌瘤形成。由此推測, rs1285251 位點C/T 堿基轉換, 可能通過促進CBX4 表達進而誘導子宮肌瘤的發生。事實上,CBX4 過表達已被證明在結腸癌、乳腺癌及骨肉瘤等多種腫瘤發生演進中發揮作用［15,23-25］。作者擬在其后的工作中對上述假說做進一步探索。

綜上所述, CBX4 基因rs1285251 位點TT 基因型是子宮肌瘤易感因素, 其與發病年齡(＜40 歲)和肌瘤臨床病理特征(大體積肌瘤、多發性肌瘤及肌壁間肌瘤)顯著相關, 可為肌瘤的早期監測與個體化防治提供指導參考。