WT161抑制小鼠破骨細(xì)胞分化及骨吸收的研究

郭狄，應(yīng)曉芳，鄭巧萍，陳利華，章禮煒，姚燦

WT161抑制小鼠破骨細(xì)胞分化及骨吸收的研究

郭狄1，應(yīng)曉芳1，鄭巧萍2，陳利華1，章禮煒1，姚燦1

1.浙江省臺州醫(yī)院骨科，浙江臨海 317000；2.浙江省臺州醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江臨海 317000

研究WT161對破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的作用及機(jī)制。取8周齡雄性C57BL/6小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)探究不同濃度WT161對BMM增殖的作用；通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察各濃度WT161對破骨細(xì)胞分化的影響；通過骨吸收試驗(yàn)探究各濃度WT161對破骨細(xì)胞骨吸收功能的作用；通過蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)檢測WT161對核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65及活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1）信號通路的影響。CCK-8結(jié)果顯示當(dāng)WT161濃度>0.63μmol/L時(shí)，WT161對BMM具有顯著的抑制增殖作用；誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化時(shí)，WT161抑制BMM分化為破骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞數(shù)目及鋪展率明顯減少；骨吸收試驗(yàn)顯示W(wǎng)T161可顯著抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能；蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果表明，WT161抑制NF-κB p65的磷酸化及下游NFATc1的表達(dá)。WT161通過抑制NF-κB及下游的NFATc1信號通路從而抑制破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能。

WT161；破骨細(xì)胞；骨吸收；信號通路

骨質(zhì)疏松癥是中老年人群常見疾病，隨著年齡的增加，其發(fā)病率明顯上升[1]。引起骨質(zhì)疏松的主要原因是骨形成和骨吸收之間的動態(tài)平衡紊亂，導(dǎo)致骨量逐漸丟失及骨組織中微結(jié)構(gòu)進(jìn)行性退變，從而引起骨的脆性增強(qiáng)，在輕微外力的影響下即可出現(xiàn)骨折[2]。目前，臨床治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物為雙膦酸鹽類、雌激素等，前者能有效抑制骨吸收從而起到提升骨密度的目的[3]，但長期使用雙膦酸鹽類存在著頜骨壞死、非典型骨折等嚴(yán)重不良反應(yīng)，其余抗骨質(zhì)疏松藥物也存在著諸多缺陷[4]。因此，臨床上需要新的既能有效提高骨密度、不良反應(yīng)又輕微的藥物。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙酰酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）在破骨細(xì)胞的分化中起重要作用，基因敲除HDAC6能明顯抑制破骨細(xì)胞的分化[5]。WT161是HDAC6的選擇性抑制劑，先前研究顯示其對乳腺癌及多發(fā)性骨髓瘤具有明顯的抑制作用，但其對破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能是否具有作用目前尚不清楚[6-7]。本研究旨在探究WT161對破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的影響及潛在機(jī)制，為臨床抗骨質(zhì)疏松治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究使用的SPF級雄性C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXL（浙）2019-0030]。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

WT161購自Selleck（上海藍(lán)木化工有限公司）；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）受體激活蛋白配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）均購自美國R&D公司；alpha MEM購自Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司；CCK-8細(xì)胞增殖–毒性檢測試劑盒購自七海生物有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒購自美國Sigma公司；特異性抗體NF-κB p65、p-NF-κB p65，特異性抗體活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1）購自美國Santa Cruz生物公司。

1.3 骨髓巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)及破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)

引頸處死8周齡小鼠后，無菌狀態(tài)下取出小鼠脛骨及股骨，利用1ml無菌針筒吸取適量培養(yǎng)基，將骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞沖出。將沖出的細(xì)胞培養(yǎng)于含30ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基（alpha MEM含10%FBS及1%雙抗）中，培養(yǎng)皿置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，隔天換液。細(xì)胞用于破骨分化時(shí)，將骨髓巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）按需種板，24h后用含30ng/ml M-CSF及50ng/ml RANKL的完全培養(yǎng)基（alpha MEM含10%FBS及1%雙抗）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，隔天換液，待成熟破骨細(xì)胞分化而成。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

把BMM按8×103個(gè)/孔的密度分別接種于兩塊96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，即每塊板種30個(gè)孔。培養(yǎng)1d后，用含30ng/ml M-CSF和各濃度梯度的WT161（0、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00及20.00μmol/L）分別培養(yǎng)48h及96h，0濃度為對照組，含不同濃度WT161的為藥物組。每個(gè)孔中分別滴入10μl CCK-8檢測液，隨后根據(jù)說明書測試每孔的吸光度。

1.5 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)及染色

把BMM根據(jù)8×103個(gè)/孔分別接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用含30ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后，把培養(yǎng)基換成加有30ng/ml M-CSF及50ng/ml RANKL的完全培養(yǎng)基及不同濃度的WT161（0、0.16、0.31及0.63μmol/L），繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5d，隔天換液。5d后，將培養(yǎng)基吸除，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后用4%多聚甲醛固定20min，隨后再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，最后進(jìn)行TRAP染色。染色成功后通過倒置顯微鏡觀察并拍攝各孔情況，使用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞核多于3個(gè)的破骨細(xì)胞數(shù)目及鋪展率。

1.6 牛骨片骨吸收試驗(yàn)

將BMM用破骨細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3d后消化，按2.4×104個(gè)/孔分別接種至放有牛骨片的96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用上述相同成分培養(yǎng)基及不同濃度WT161（0、0.16、0.31及0.63μmol/L）繼續(xù)誘導(dǎo)3d。在誘導(dǎo)6d之后利用軟毛刷將牛骨片表面的細(xì)胞仔細(xì)刮除，將牛骨片進(jìn)行電子顯微鏡掃描。

1.7 蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)

檢測NF-κB p65時(shí)，將BMM培養(yǎng)在含有30ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基的6孔板中，當(dāng)各孔中的細(xì)胞密度接近80%后，對照組不加WT161誘導(dǎo)，藥物組培養(yǎng)基中加入0.63μmol/L的WT161誘導(dǎo)4h。隨后按60、30、20、10、5、0min對各孔細(xì)胞加入RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)。檢測NFATc1時(shí)，將BMM培養(yǎng)在含有30ng/ml M-CSF完全培養(yǎng)基的6孔板中，當(dāng)各孔中的細(xì)胞密度接近80%后，對照組加入RANKL分別培養(yǎng)0、1、3、5、7d，藥物組培養(yǎng)基中加入0.63μmol/L的WT161及RANKL分別培養(yǎng)0、1、3、5、7d，快速吸除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗3次，每孔加入100μl PMSF/RIPA（1∶100）細(xì)胞裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解。將蛋白樣本吸入EP管后，每管按1∶4添加5×Loading buffer混勻，100℃煮沸10min后進(jìn)行電泳。用10% SDS-PAGE將蛋白樣本進(jìn)行分離后，切取目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，后用相應(yīng)一抗在4℃冰箱中孵育過夜，第2天二抗搖床孵育1h后進(jìn)行條帶顯色，結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 WT161抑制BMM的增殖

根據(jù)48h及96h的CCK-8毒性試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)濃度>0.63μmol/L時(shí)，WT161對BMM產(chǎn)生明顯的毒性作用，BMM的增殖明顯受到抑制，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見圖1。

2.2 WT161抑制BMM分化為破骨細(xì)胞

根據(jù)CCK-8試驗(yàn)結(jié)果，選取0.16、0.31及0.63μmol/L 3個(gè)濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。經(jīng)5d破骨分化誘導(dǎo)后，對照組中分化出大量典型的成熟破骨細(xì)胞（細(xì)胞核>3個(gè)）；而藥物組中，破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少。同時(shí)，抑制作用隨著濃度的增加而增加，高濃度組甚至幾乎無明顯破骨細(xì)胞生成，見圖2。

2.3 WT161抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能

電鏡掃描各組牛骨片。在對照組中，各牛骨片的表面形成大量明顯的骨陷窩；而在藥物組中，牛骨片表面骨陷窩形成顯著減少，尤其是在高濃度組，牛骨片表面幾乎無骨陷窩形成，見圖3。

2.4 WT161通過抑制NF-κB p65的磷酸化及下游的NFATc1表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化

蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)0.63μmol/L濃度的WT161干預(yù)后，NF-κB p65的磷酸化及下游的NFATc1的表達(dá)顯著下降，見圖4。

3 討論

正常的骨組織由密度較低、規(guī)則網(wǎng)狀分布的松質(zhì)骨和密度較高、規(guī)則平行板層排列的皮質(zhì)骨組成，兩者的特性共同決定骨組織的生物力學(xué)特性[8]。年齡、激素及其他疾病等因素均可破壞成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的動態(tài)平衡，導(dǎo)致骨小梁等微結(jié)構(gòu)破壞，骨密度下降，從而逐漸降低骨的強(qiáng)度，增加骨的脆性，引起骨質(zhì)疏松[9]。當(dāng)不慎跌倒、摔落時(shí)，即使較小的暴力也易引起骨折，即骨質(zhì)疏松性骨折。因此，如何糾正成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡也成為治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵所在。當(dāng)前，臨床上抗骨質(zhì)疏松藥物較多，從功能上主要分為抑制破骨細(xì)胞及促進(jìn)成骨細(xì)胞兩類，前者常用的有雙膦酸鹽類、雌激素、降鈣素等，后者包括特立帕肽等。這些藥物雖能提高骨密度，減少骨折發(fā)生概率，但仍存在治療周期長、治療率低、依從性差、不良反應(yīng)多等諸多缺陷[3]。

圖1 CCK-8試驗(yàn)檢測不同濃度WT161對細(xì)胞的毒性作用

A.48h后不同濃度WT161對細(xì)胞的毒性作用；B.96h后不同濃度WT161對細(xì)胞的毒性作用

注：與對照組比較，*<0.05

圖2 不同濃度的WT161對破骨細(xì)胞數(shù)量及鋪展率的影響

A.不同濃度WT161處理后的破骨細(xì)胞（TRAP染色，×100）；B.不同濃度WT161處理后的破骨細(xì)胞數(shù)目比較；C.不同濃度WT161處理后的破骨細(xì)胞鋪展率比較

注：與對照組比較，*<0.05

圖3 不同濃度WT161對破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響

A.不同濃度WT161處理后的破骨細(xì)胞骨吸收后的牛骨片；B.不同濃度WT161處理后牛骨片骨吸收率比較

注：與對照組比較，*<0.05

圖4 WT161對NF-κB p65的磷酸化及下游NFATc1表達(dá)的影響

A.不同時(shí)點(diǎn)NF-κB p65磷酸化的蛋白條帶圖；B.不同時(shí)點(diǎn)NFATc1的蛋白條帶圖；C.不同時(shí)點(diǎn)p-NF-κB p65表達(dá)比較；D.不同時(shí)點(diǎn)NFATc1表達(dá)比較

注：與對照組比較，*<0.05

WT161屬長鏈異羥肟酸類抑制劑，為HDAC6的選擇性抑制劑。前期研究顯示其與硼替佐米聯(lián)合使用可明顯增強(qiáng)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的抑制作用[7]，但WT161是否對破骨細(xì)胞的形成及骨吸收功能有抑制作用目前尚未證實(shí)。本研究探索WT161對BMM分化為破骨細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示在對BMM無明顯細(xì)胞毒性的濃度下，WT161能顯著抑制破骨細(xì)胞分化，且濃度越高，抑制作用越明顯。同時(shí)，牛骨片的骨吸收試驗(yàn)證實(shí)WT161對破骨細(xì)胞的骨吸收功能也有濃度依賴性的抑制作用。

在BMM分化成破骨細(xì)胞的過程中，RANKL起著非常關(guān)鍵的作用[10]。當(dāng)RANKL和破骨前體細(xì)胞中的受體結(jié)合后，將激活多條信號通路從而啟動破骨細(xì)胞分化過程，其中包括絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt信號通路、NF-κB信號通路等多條上游通路及下游的c-Fos和NFATc1信號通路[11-12]。本研究結(jié)果證實(shí)，WT161通過抑制NF-κB p65的磷酸化從而抑制NF-κB及下游的NFATc1表達(dá)，最終起到抑制破骨細(xì)胞分化的作用。

綜上，WT161可抑制BMM向破骨細(xì)胞分化，且能抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，分子機(jī)制研究證明WT161通過作用于NF-κB及下游的NFATc1信號通路發(fā)揮抑制作用。

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Inhibitory effect of WT161 on osteoclast differentiation and bone resorption in mice

GUO Di, YING Xiaofang, ZHENG Qiaoping, CHEN Lihua, ZHANG Liwei, YAO Can

1.Department of Orthopedics, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Linhai 317000, Zhejiang, China; 2.Department of Critical Care Medicine, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Linhai 317000, Zhejiang, China

To study the effect and mechanism of WT161 on osteoclast differentiation and bone resorption.Bone marrow-derived macrophage (BMM) from male C57BL/6 mice aged 8 weeks was cultured as primary cells. The effect of WT161 on the proliferation of BMM was investigated by CCK-8 cytotoxicity test. The effect of WT161 on osteoclast differentiation was observed by tartrate resistant acid phosphatase staining. The effects of WT161 on osteoclast bone resorption were investigated by bone resorption test. Western blotting was used to detect the effects of WT161 on nuclear factor-κB (NF-κB) p65, p-NF-κB p65 and nuclear factor-activated T cell 1 (NFATc1) signaling pathway.The results of CCK-8 showed that WT161 had significant inhibitory effect on proliferation of BMM when the concentration of WT161 was greater than 0.63 μmol/L. When osteoclast differentiation was induced, WT161 inhibited the differentiation of BMM into osteoclasts, and the number and spread rate of osteoclasts were significantly reduced. Bone resorption test showed that WT161 could significantly inhibit osteoclast bone resorption. Western blotting assay showed that WT161 inhibited the phosphorylation of NF-κB p65 and the expression of NFATc1.WT161 inhibited the differentiation and bone resorption of osteoclasts by suppressing the expression of NF-κB and NFATc1.

WT161; Osteoclast; Bone resorption; Signaling pathway

R681

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.28.011

臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（22ywa06）

姚燦，電子信箱：yaoc@enzemed.com

（2022–12–20）

（2023–09–13）