組織塊法重復培養牙周膜干細胞的生物學功能研究

張遠，鄭愷忻，賀瑞,，王進濤，沈悅，鐘良軍,

組織塊法重復培養牙周膜干細胞的生物學功能研究

張遠1，鄭愷忻2，賀瑞2,3，王進濤3，沈悅1，鐘良軍1,2

1.杭州師范大學附屬醫院牙周病診療中心，浙江杭州 310015；2.杭州師范大學口腔醫學院，浙江杭州 310015；3.杭州師范大學附屬醫院口腔醫學中心，浙江杭州 310015

對同一塊牙周膜組織重復培養獲得的原代牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）的生物學特性和功能進行比較，評價重復培養得到的PDLSC能否用于實驗研究和臨床治療。收集正畸治療拔除的前磨牙，組織塊法進行PDLSC原代培養。首次傳代后收集剩余的牙周膜組織重復進行組織塊法細胞培養，多次培養獲得原代PDLSC。每次培養的原代PDLSC進行擴增培養，選取第1、3、5次培養獲得的PDLSC分為A、B、C組。分別繪制細胞增殖曲線，STRO-1表面標記物表達的檢測鑒定，細胞周期分布檢測和觀察成骨誘導，測定各組PDLSC端粒長度和端粒酶表達水平。三組細胞的STRO-1表達均呈陽性；生長趨勢和擴增數量相似；A、B兩組細胞周期分布無顯著差異（>0.05），C組與A、B組比較細胞周期分布差異顯著（<0.05）；地塞米松誘導三組PDLSC成骨，21d時均有茜素紅染色陽性的鈣化結節；A、B兩組PDLSC端粒長度、端粒酶表達水平均無顯著差異（>0.05），C組PDLSC端粒長度顯著長于A、B組（<0.05），端粒酶表達水平顯著高于A、B組（<0.05）。通過同一塊牙周膜組織培養得到的PDLSC生物學功能相同，但在細胞安全性上是否能夠用于實驗研究和臨床治療有待進一步的探討。

牙周膜干細胞；組織塊法；端粒；端粒酶

牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）經過誘導可向脂肪細胞、成骨細胞、神經樣細胞分化，是具有多方向分化潛能的成體干細胞之一[1]。PDLSC獲取自拔牙后刮取牙周膜組織進行的原代細胞培養分離純化，而健康牙齒來源的PDLSC獲得難度高，從殘根或牙周病患者的非健康牙周組織中獲得PDLSC成功的報道較為少見。組織塊法培養能夠從同一塊牙周膜組織多次獲得原代PDLSC，但后續獲得的PDLSC的生物學特性、誘導分化潛能及安全性是否能用于實驗研究和臨床治療尚不清楚，本研究對此方法的可行性進行探討。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取因正畸治療需要拔除的前磨牙20顆，牙齒獲得均經患者本人及監護人同意，并簽署知情同意書。患者無全身系統性疾病、家族遺傳病和特殊服藥史，臨床檢查牙齒無牙體及根尖周病變，無牙周病變。將初次培養獲得的PDLSC和第3次、第5次重復培養獲得的PDLSC分別設為A組、B組和C組。本研究經杭州師范大學附屬醫院倫理委員會審查通過[倫理審批號：2021（E2）-KS-100]。

1.2 方法

1.2.1 PDLSC重復培養和分離純化 正畸減數牙拔出后立即用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）反復沖洗后轉運至干細胞實驗室，輕柔刮取根中1/3牙周膜組織，置入細胞培養瓶內，加入10%胎牛血清5ml，100μmol/L L-抗壞血酸，2mmol/L L-谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基，37℃、5% CO2孵育箱培養，首次7d換液，首次換液前不做細胞觀察，避免培養瓶晃動。當細胞生長達70%～80%融合時，消化并調整密度為10個/ml，接種于96孔板，每孔100μl。過夜培養，挑選單細胞孔標記，待細胞形成克隆后，消化并將多個單克隆來源的細胞懸液混合擴大培養。首次原代細胞培養后，保留全部牙周膜組織塊和部分原培養液，轉移至新細胞培養瓶中，加入含10%胎牛血清5ml，100μmol/L L-抗壞血酸，2mmol/L L-谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基，補足液體至5ml，培養方法和分離純化同首次PDLSC培養。如此重復，一次取材的牙周膜組織塊進行培養多次獲得原代PDLSC。

1.2.2 各組PDLSC增殖曲線的繪制 取A、B、C組PDLSC，培養至第三代，0.25%胰蛋白酶+EDTA消化后，調整細胞濃度為2×106個/L，分別接種至3塊96孔板中，每孔分別加入三組細胞懸液200μl，每組細胞設5個復孔，空白對照孔內加入200μl無菌PBS，37℃、5% CO2孵育箱培養；吸去第一天孔內培養液，加入新配置培養液200μl，避光條件下加入CCK-8溶液20μl，37℃、5% CO2培養箱內孵育3h；測定前充分搖勻，酶標儀450nm處測定OD值；連續測定12d，繪制細胞增殖曲線。

1.2.3 各組PDLSC STRO-1表達的檢測 取培養至第三代的A、B、C組PDLSC，細胞處理后取小鼠抗人STRO-1單克隆抗體母液2.5μl，加入到100μl無菌PBS中，混合均勻，滴加稀釋抗體工作液，4℃濕盒內過夜；次日37℃溫箱內復溫60min；PBS蕩洗，暗室中滴加1∶100稀釋的山羊抗小鼠FITC熒光二抗，37℃避光孵育60min；暗室中PBS蕩洗3次，每次3min；Heochst工作液處理5min，暗室PBS蕩洗3次，每次3min；避光條件下，熒光倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.4 各組PDLSC細胞周期的測定 取培養至第三代的A、B、C組細胞，每組設6個樣本，0.25%胰蛋白酶+EDTA消化，收集并調整細胞濃度為1×106/ml，70%乙醇固定，4℃孵育過夜；加入100μl RNase A，37℃水浴30min；避光條件下，加入400μl PI染色液，混合均勻，4℃避光孵育30min；流式細胞儀檢測，記錄激發波長488nm處紅色熒光。

1.2.5 茜素紅染色觀察三組PDLSC成骨 取培養至第三代的A、B、C組PDLSC，分為對照組CK-A、CK-B、CK-C和誘導組EG-A、EG-B、EG-C，分別按4×103密度接種于5cm培養皿內，EG組常規培養基中加入10% β-甘油磷酸鈉和1nmol/L地塞米松成骨誘導液10μl，CK組常規培養基中加入10% β-甘油磷酸鈉，37℃、5% CO2孵育箱培養，3d換液；成骨誘導培養至第21天，對EG組和CK組細胞進行茜素紅染色。

1.2.6 各組PDLSC端粒長度測定 取培養至第三代的A、B、C組PDLSC，每組6個樣本；提取各組細胞全組DNA，實時聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）測定各組PDLSC端粒相對長度。引物序列：tel1：5′GGTTTTTgaggggtgtgtggggg ggggtggggt3′；tel2：5′tcccgatatccctatcc ctatccctacctatc-cCTA3′；36B4u：5′CAGCAA GTGGGAAGGTGTTAATCC3′；36B4d：5′cccatct atcatcaacgggtacaa3′。實時PCR反應設置：取模板DNA 50ng，T反應tel1引物終濃度為270nmol/L，tel2引物終濃度為2900nmol/L，S反應36B4u引物終濃度為300nmol/L，36B4d引物終濃度為500nmol/L；實時PCR反應條件：95℃ 30s預變性，然后進行兩步循環法，T反應條件為95℃變性15s，54℃退火/延伸混合2min，共18個循環。S反應條件為95℃變性15s，58℃退火/延伸混合1min，共40個循環。每個樣品均做3個平行樣，取均值作為該樣品的Ct值；端粒相對長度的計算：T/S（T為端粒的拷貝數；S為單拷貝基因36B4基因的拷貝數）比率為[2 CtTelomere/2Ct36B4]–1=2–△Ct，相對T/S比率（樣品相對于參比樣品的T/S）為2–（△Ct樣品–△Ct參比樣品）=2–△△Ct，故使用2–△△Ct公式可求出每個處理組的相對T/S值，相對T/S值與樣品DNA的相對端粒長度對應。

1.2.7 各組PDLSC端粒酶表達的測定 Trizol提取各組PDLSC全組RNA；RevertAid Fist Strand cDNA Stynthesis Kit反轉錄試劑盒反轉錄得到全組cDNA；引物序列：管家基因（β-actin）引物序列S-β-actin-F：5′GGTGGGTATGGGTCAGAAAGA3′，S-β-actin-R：5′GGGGTACTTGAGGGTCAGGAT3′；目的基因引物序列S-TERT-F：5′GAAGAATGTGAAGAAGCTC GTC3′，S-TERT-R：5′CACTTTCATCTTCCACATCA GC3′；實時PCR反應設置：將反轉錄得到的cDNA稀釋8倍作為上機檢測的模板，上、下游引物終濃度為500nmol/L，反應體系20μl；實時PCR反應條件：95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火/延伸1min；使用△△Ct法計算TERT的表達量，即B、C組PDLSC細胞TERT表達量相對于A組細胞的變化倍數。

1.3 觀察指標

繪制三組PDLSC增殖曲線，觀察各組細胞的增殖生長情況；免疫熒光染色、流式細胞儀檢測三組細胞STRO-1表面標記物表達情況；比較三組PDLSC細胞周期分布情況；茜素紅染色觀察三組PDLSC成骨誘導；比較三組PDLSC端粒相對長度和端粒酶表達活性，評價多批次培養的PDLSC的生物安全性。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 PDLSC純化、增殖和鑒定

各組PDLSC增殖趨勢相似，第3天開始細胞數量開始增加，進入對數生長期，第8～9天時細胞增殖進入生長平臺期。第10天細胞數量開始下降，見圖1。

圖1 三組PDSLC的增殖曲線

倒置熒光顯微鏡下，STRO-1熒光特異性染色呈強綠色熒光，細胞形態呈梭形，細胞中央Hoechst襯核，呈強藍色熒光，見圖2。

2.2 各組PDLSC細胞周期的測定

A、B兩組細胞周期分布無顯著差異（>0.01），C組細胞周期分布與A、B組比較差異有統計學意義（<0.01），表1、圖3。

表1 三組PDLSC細胞周期分布（，%）

注：與C組比較，*<0.05

圖2 三組PDSLC STRO-1免疫熒光染色（×200）

圖3 三組PDLSC細胞周期分布圖

圖4 各組PDLSC成骨誘導茜素紅染色（×50）

2.3 各組PDLSC的成骨誘導

茜素紅染色三組PDLSC成骨誘導均呈陽性，各空白對照組均為陰性，見圖4。

2.4 各組PDLSC的端粒長度比較

A、B組PDLSC的端粒長度比較差異無統計學意義（>0.05），C組PDLSC的端粒長度顯著大于A、B組（<0.05），見圖5。

注：*>0.05

2.5 三組PDLSC的端粒酶表達比較

A、B組PDLSC的端粒酶活性比較差異無統計學意義（>0.05），C組PDLSC的端粒酶活性顯著高于A、B組（<0.05），見圖6。

圖6 三組細胞端粒酶表達比較

注：*>0.05

3 討論

Somerman等[2]通過組織塊法和酶消化法培養獲得牙周膜細胞，在此基礎上又衍生出組織塊法聯合酶消化法培養牙周膜原代細胞，目前PDLSC的培養主要通過上述3種方法，但只能分離純化得到一批原代PDLSC。PDLSC的獲得相對于其他種子細胞較為局限，只能通過健康牙的牙周膜組織進行培養，其獲取數量較少，另外通過細胞系購買獲取細胞數量有限且需要較高的實驗經費。本研究利用同一塊牙周膜組織重復培養分離純化得到多批次PDLSC，對其在實驗研究和臨床治療中的可行性和風險性進行初步評價，如通過重復培養的PDLSC與首次傳代培養的PDLSC的生物學特性和分化誘導能力一致，即可在一定程度上解決PDLSC獲取數量少的問題。

STRO-1是PDLSC表面標記物[3-4]。實驗結果顯示STRO-1在三組細胞中均有表達，表明同一塊牙周膜組織能多批次分離純化得到PDLSC。擴增趨勢與申濤等[5]報道結果一致，多批次分離純化得到的PDLSC具有與首次分離純化的PDLSC相似的克隆增殖能力。處于靜止期的細胞具有高度分化和增殖的能力[6]。在細胞周期分布的檢測中發現，三組PDLSC中大部分細胞處于靜止期，B組分離純化得到的PDLSC與A組細胞周期分布情況無顯著差異，這一結果可認為多批次獲得的PDLSC潛在的分化和增殖能力是相同的，C組PDLSC的G0/G1期細胞占比減少，其增殖和分化能力降低，可能的原因是培養批次過多會對細胞的分化和增殖能力產生影響。PDLSC具有較強的分化能力，通過誘導可分化為成脂細胞、成骨細胞、成軟骨細胞和神經元樣細胞[7-9]。在牙周病的研究和治療中，更多的關注在其成骨能力。地塞米松是經典的成骨誘導劑，對A、B、C三組PDLSC進行成骨誘導后，茜素紅染色均呈陽性，可觀察到茜素紅染色陽性的礦化結節。表明重復多次獲得的PDLSC均可向成骨細胞分化并誘導成骨。在細胞的增殖和誘導分化方面，多批次獲得的PDLSC與首次獲得的PDLSC相同。

端粒是真核細胞染色體末端的DNA重復序列和特異結合蛋白的復合體，其作用主要是使DNA免受不恰當的修復及防止端–端融合和核酸外切酶的降解[10-11]；端粒能夠維持細胞染色體的穩定，在一定程度上可被看做是細胞壽命的“時鐘”[12-13]。對干細胞而言，端粒的長度同樣具有重大意義，其是干細胞能進行增殖和多方向分化的保證，端粒的長度不能滿足細胞多次分裂和分化，那么其功能和作用亦無法體現。定量PCR可間接測定細胞端粒的相對長度[14]，C組PDLSC端粒顯著長于A、B組，表明其具有更高的分化增殖能力。端粒酶的作用是維持細胞的端粒長度，其過高表達是細胞惡性增殖的信號之一[15-17]。端粒酶活性測定中發現C組PDLSC的端粒酶活性高于A、B兩組，如進行體內實驗可能存在細胞過度增殖的惡變風險。

綜上，通過同一塊牙周膜組織重復培養獲得的PDLSC具有相似的生物學特性，且具有向成骨細胞分化的潛能，但重復培養次數過多會對細胞產生影響，存在安全性風險。該方法通過重復利用牙周膜組織塊多次獲得PDLSC，提高種子細胞的獲取數量，在一定程度上能用于實驗研究，但在臨床治療方面仍需進一步探索。

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Study on biological function of periodontal ligament stem cells in repeated culture by tissue block method

ZHANG Yuan, ZHENG Kaixin, HE Rui, WANG Jintao, SHEN Yue, ZHONG Liangjun

1.Periodontal Disease Diagnosis and Treatment Center, the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310015, Zhejiang, China; 2.Stomatology College, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310015, Zhejiang, China; 3.Stomatology Center, the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310015, Zhejiang, China

To compare the biological characteristics and functions of periodontal ligament stem cells (PDLSCs) obtained from repeated culture of the same periodontal ligament tissue, so as to evaluate whether the PDLSCs obtained from repeated culture can be used for experimental research and clinical treatment.PDLSCs were isolated from orthodontic extracted premolars and cultured in vitro. After the first passage, the remaining periodontal ligament tissue was collected and repeated for cell culture by tissue block method to obtain primary PDLSCs. PDLSCs from each culture were amplified and cultured. PDLSCs obtained from the first, third, and fifth culture were divided into groups A, B, and C. The cell proliferation curve was drawn, the expression of STRO-1 surface markers was detected, the cell cycle distribution was detected, and the osteogenic induction was observed. The telomere length and telomerase expression level of PDLSCs in each group were measured.The expression of STRO-1 was positive in all three groups. The growth trend and number of amplifications were similar. There was no significant difference in cell cycle distribution between group A and group B (>0.05), but there was significant difference in cell cycle distribution between group C and groups A and B (<0.05). Dexamethasone induced osteogenesis of PDLSCs in three groups, and alizarin red staining showed positive calcified nodules at 21 days. The telomere length and telomerase expression level of PDLSCs in groups A and B had no significant difference (>0.05), but the telomere length of PDLSCs in group C was significantly longer than that in groups A and B (<0.05), telomerase expression level was higher than that in groups A and B (<0.05).The biological function of PDLSCs derived from the same periodontal ligament tissue culture is the same, but whether PDLSCs can be used for experimental research and clinical treatment in terms of cell safety needs to be further explored.

Periodontal ligament stem cells; Tissue block method; Telomere; Telomerase

R781.2

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.28.002

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2021KY891）；杭州市生物醫藥和健康產業發展扶持科技專項項目（2021WJCY129）；杭州市科技局重大項目（Z20200046）

鐘良軍，電子信箱：zymdxx@163.com

（2023–05–31）

（2023–09–19）