N-乙酰半胱氨酸聯(lián)合頭孢西丁對金黃色葡萄球菌的體外藥敏試驗(yàn)研究

吳桐，谷海瀛,2

N-乙酰半胱氨酸聯(lián)合頭孢西丁對金黃色葡萄球菌的體外藥敏試驗(yàn)研究

吳桐1，谷海瀛1,2

1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)部，浙江寧波 315211；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化病實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315020

使用頭孢西丁（cefoxitin，F(xiàn)OX）分別與未處理的N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）和酸堿度調(diào)節(jié)至中性的NAC對金黃色葡萄球菌（，）ATCC29213、ATCC43300進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，檢測FOX與NAC聯(lián)合應(yīng)用對的作用，評估NAC的酸性特性在發(fā)揮藥物效果中的影響。微量肉湯稀釋法測定藥物最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）；棋盤法進(jìn)行聯(lián)合藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)晶紫染色法測定生物被膜（biofilm，BF）形成量，激光共聚焦顯微鏡觀察菌落成分變化。調(diào)節(jié)NAC至中性再次進(jìn)行上述試驗(yàn)。FOX對ATCC29213和ATCC43300的MIC分別為2μg/ml和32μg/ml，NAC對2菌株的MIC均為4mg/ml。酸度調(diào)節(jié)至中性的NAC對ATCC29213和ATCC43300的MIC均>64mg/ml。保持弱酸性的NAC與FOX間存在相加作用，BF含量、細(xì)菌數(shù)量、BF多糖成分均有所下降；中性的NAC與FOX聯(lián)合應(yīng)用時藥物間作用效果為無關(guān)甚至拮抗，未出現(xiàn)上述作用效果。NAC的存在一定程度上可增加體外條件下對FOX的敏感性，降低細(xì)菌數(shù)量和BF的形成量，且不因菌株耐藥性的不同而存在明顯差異，但這種作用依賴于NAC自身的酸性。

金黃色葡萄球菌；生物被膜；N-乙酰半胱氨酸；抗生物被膜

金黃色葡萄球菌（，）是常見的革蘭陽性病原菌之一，能夠持續(xù)定植于大約30%的健康成年人的鼻咽部，并在多達(dá)60%的人群中間歇定植，是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌之一[1]。據(jù)2021年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測顯示，在臨床革蘭陽性細(xì)菌分離株中高居首位，約31.2%，而其中耐甲氧西林的的檢出率高達(dá)30.0%[2]。盡管抗菌藥物不斷開發(fā)迭代，但目前對治療的選擇仍十分有限，在具有多藥耐藥性感染相關(guān)的最重要的ESKAPE組（屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌屬）中，也因較高的毒性和強(qiáng)大的可塑性及適應(yīng)性占據(jù)特殊地位，生物被膜（biofilm，BF）形成是維持感染和產(chǎn)生藥物耐受的一種重要方式[3-5]。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）（C?H?NO?S）是一種具有弱酸性的硫醇化合物，是谷胱甘肽合成的前體及活性氧清除劑，現(xiàn)常作為祛痰藥用于呼吸系統(tǒng)疾病的輔助治療[6]。NAC的廣泛應(yīng)用不僅因其具有良好的抗氧化性和自由基清除活性，還因其作為硫醇分子，性質(zhì)非常穩(wěn)定，人體對濃度高達(dá)1200mg/ml的NAC仍具有良好的耐受性[7]。

現(xiàn)有研究表明NAC對多種細(xì)菌具有抑制作用，能夠抑制細(xì)菌BF形成，并可與多種抗生素產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[8-10]。此外，有研究者認(rèn)為NAC可提高ATCC29213的β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感性，甚至10mmol/LNAC可將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant，MRSA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧籽跷髁置舾薪瘘S色葡萄球菌（methicillin- susceptible，MSSA），但相關(guān)試驗(yàn)依據(jù)缺乏[11]。FOX屬半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素，可作用于青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的合成來發(fā)揮其抗菌作用[12]。在美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）中，F(xiàn)OX被認(rèn)為是檢測葡萄球菌mecA基因介導(dǎo)的甲氧西林耐藥性的可靠藥物，并規(guī)定當(dāng)?shù)腇OX最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）>4μg/ml時可將其判定為MRSA。故本研究選取FOX與NAC對ATCC29213和ATCC43300進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，探究藥物對的作用，并評估NAC的弱酸性質(zhì)對藥物作用效果的影響，以期為相關(guān)感染的臨床治療藥物選擇提供一定的參考信息。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 試驗(yàn)菌株ATCC29213和ATCC43300均為購于北京北納生物科技有限公司的二代菌株。試驗(yàn)前使用MALDI TOF MS對菌株進(jìn)行鑒定。

1.1.2 試驗(yàn)菌液 新鮮無菌MHB液體培養(yǎng)基制備0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木海♂?000倍后用于試驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器

NAC和FOX購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；MHB培養(yǎng)粉購自英國OXOID公司；結(jié)晶紫購自美國Sigma公司；碘化丙啶和50%戊二醛購自上海麥克林生化科技有限公司；FITC-conA購自上海懋康生物科技有限公司。FOX藥敏凍干板、NAC藥敏凍干板、FOX與NAC聯(lián)合藥敏凍干板購自寧波迅檢生物科技有限公司。

生物安全柜購自蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司；比濁儀和VITEK MS質(zhì)譜儀購自生物梅里埃公司；全波長酶標(biāo)儀和–80℃超低溫冰箱購自賽默飛世爾科技有限公司；培養(yǎng)箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LEICA TCS SP8激光共聚焦顯微鏡購自德國徠卡公司。

NAC使用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 6.8～7.0。NAC藥敏凍干板濃度范圍為0.0625～64.0000mg/ml，F(xiàn)OX藥敏凍干板濃度范圍為0.125～128.000μg/ml，每列第12孔均為藥物空白孔。FOX與NAC聯(lián)合藥敏凍干板，橫排為FOX，1～11孔濃度梯度為1/128～8MIC；每列B～H孔添加NAC，濃度為1/16～4MIC；每塊藥敏凍干板的H1、A12孔為藥物空白孔[13]。

1.3 MIC測定

向藥敏凍干板中每孔加入110μl試驗(yàn)菌液，置于35°C環(huán)境中22h，觀察各培養(yǎng)孔中細(xì)菌的生長情況，確定藥物對ATCC29213和ATCC43300的MIC。

1.4 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)與部分抑菌濃度指數(shù)

向聯(lián)合藥敏凍干板中每孔加入110μl試驗(yàn)菌液，置于35°C環(huán)境中22h，觀察各培養(yǎng)孔中細(xì)菌的生長情況，根據(jù)部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）藥A聯(lián)合藥A單藥藥B聯(lián)合/藥B單藥對藥物之間的作用效果進(jìn)行判斷[14]。

1.5 結(jié)晶紫法測定BF形成量

藥敏板的選擇、菌液接種與培養(yǎng)同1.4。取出聯(lián)合藥敏板，棄去孔內(nèi)液體，使用無菌生理鹽水清洗2次；99%甲醇固定15min；0.2%結(jié)晶紫染液染色10min；無菌蒸餾水洗滌至無染液流出；每孔加入110μl 95%乙醇，混勻后測量各孔600nm處的吸光度[15]。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察藥物作用后BF變化情況

藥敏板的選擇、菌液接種與培養(yǎng)同1.4。根據(jù)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及FICI選擇合適的培養(yǎng)孔。取潔凈玻片編號，每載玻片上滴加170μl無菌蒸餾水，吸取10μl的培養(yǎng)物至玻片上的蒸餾水中，室溫晾干。80μl 2.5%戊二醛溶液，置于4℃環(huán)境中1.5h固定；PBS沖洗； 20.0μg/ml的FITC-conA熒光染液80μl，避光放置于4℃環(huán)境中30min；PBS沖洗；10.0μg/ml的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液100μl，置于37℃環(huán)境中、20min避光孵育；PBS沖洗，晾干，封片。LEICA TCS SP8激光共聚焦顯微鏡，分別在488nm和552nm發(fā)射波長的濾光器下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株S. aureus的藥物MIC

藥物對ATCC29213和ATCC43300的MIC見表1。對培養(yǎng)物吸光度的測定結(jié)果顯示，當(dāng)NAC的濃度超過0.125mg/ml時，細(xì)菌的數(shù)量開始出現(xiàn)顯著下降。而使用NaOH溶液將NAC的pH值調(diào)節(jié)至6.8～7.0時，NAC對ATCC29213和ATCC43300的MIC均顯示>64mg/ml，培養(yǎng)物吸光度僅在中性NAC達(dá)8mg/ml或更高時，才出現(xiàn)較明顯的下降，見圖1。

表1 藥物對S. aureus ATCC29213和ATCC43300的MIC

2.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)與FICI

根據(jù)藥物MIC值確定聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中藥物的濃度范圍，NAC為0.25～16.00mg/ml，ATCC29213的FOX濃度為0.015～16.000μg/ml，ATCC43300的FOX濃度為0.25～256.00μg/ml。

在未對酸堿度進(jìn)行調(diào)節(jié)的情況下，F(xiàn)OX和NAC聯(lián)用對ATCC29213和ATCC43300表現(xiàn)出相似的抗菌效果。在MSSA菌株ATCC29213的96孔藥敏培養(yǎng)板中，B4、C4、D4、D5、E4、E5、E6、E7孔中均未見細(xì)菌生長，通過計(jì)算FICI，僅D5、E5、E6、E7四孔內(nèi)藥物之間表現(xiàn)為相加作用，其余培養(yǎng)孔的藥物之間的相互作用均表現(xiàn)為無關(guān)；其中，E7孔作用效果最佳，其FICI值為0.625；D5、E6兩孔的FICI值相同，為0.75；E5孔FICI值最大，為1.0。

圖1 NAC酸堿度改變時兩株S. aureus菌液吸光度的變化（OD600）

A.ATCC29213；B.ATCC43300；C.中性條件下ATCC29213；D.中性條件下ATCC43300

注：OD600為600nm處的吸光度值；與藥物空白孔比較，*<0.05；#<0.01；△<0.001；▲<0.0001

對耐藥菌株ATCC43300，在聯(lián)合藥敏板FOX單藥孔中測得的MIC值為8μg/ml，故FICI計(jì)算中使用8μg/ml。在未調(diào)節(jié)酸堿度的情況下，B6、C6、D6、D7、E6、E7、E8、E9孔內(nèi)未見細(xì)菌生長，D7、E7、E8、E9孔顯示出兩種藥物之間具有相加作用，其FICI分別為0.750、1.000、0.750、0.625，其余培養(yǎng)孔則均表現(xiàn)為無關(guān)作用，見圖2。

2.3 藥物作用后S. aureus BF總生物量測定

使用結(jié)晶紫染色對BF總生物量進(jìn)行測定。未調(diào)節(jié)pH時，亞抑菌濃度FOX作用下ATCC29213和ATCC43300的BF含量均隨著NAC濃度的升高而降低，與同濃度FOX單獨(dú)作用相比，聯(lián)合用藥時BF分別減少37.3%～56.5%和28.1%～41.4%不等；與藥物空白孔相比，此時ATCC29213和ATCC43300 BF的最大減少量分別為49.7%和43.4%。同樣的聯(lián)合藥物濃度在中性條件下BF量則表現(xiàn)出與細(xì)菌數(shù)量相似的增加，甚至可高達(dá)70%，見表2。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

兩株激光共聚焦顯微鏡下所見BF熒光標(biāo)記特點(diǎn)相似，無藥物作用的培養(yǎng)物中標(biāo)記菌體的PI所發(fā)出的紅色熒光及標(biāo)記多糖類物質(zhì)的FITC-conA發(fā)出的綠色熒光亮度高、范圍大、聚集性強(qiáng)；亞抑菌濃度的FOX單獨(dú)作用時，紅和綠兩種熒光的強(qiáng)度略有下降，并變得更為分散，這種變化特點(diǎn)隨著藥物濃度的升高會變得更明顯。而在具有藥物相加作用的各孔中，標(biāo)記BF的綠色熒光更分散，熒光強(qiáng)度更弱，紅色熒光標(biāo)記的菌體數(shù)量大幅減少，熒光強(qiáng)度微弱；與之對應(yīng)的中性NAC聯(lián)合作用孔鏡下表現(xiàn)介于低濃度FOX單獨(dú)作用或無藥物作用時，紅和綠兩種熒光的亮度強(qiáng)、范圍大，且呈現(xiàn)出聚集趨勢，見圖3。

3 討論

本試驗(yàn)選取藥物敏感性不同的ATCC29213和ATCC43300進(jìn)行FOX和NAC的藥物聯(lián)合試驗(yàn)，并調(diào)節(jié)NAC至中性進(jìn)行試驗(yàn)，以觀察兩種藥物單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對菌株的影響，同時評估NAC弱酸特性在其中的作用。研究結(jié)果表明保持弱酸性質(zhì)的NAC單獨(dú)作用時已具備良好的抗菌、抗BF形成能力，當(dāng)與FOX聯(lián)合應(yīng)用時，可一定程度上增加ATCC29213和ATCC43300對FOX的敏感性，減少BF的形成量和其中的細(xì)菌數(shù)量、多糖成分含量。這可能與NAC競爭性抑制細(xì)菌對半胱氨酸的攝取、通過硫醇–二硫鍵交換還原蛋白質(zhì)并降低其交聯(lián)程度、在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中解離并酸化胞質(zhì)造成菌體蛋白變性和遺傳物質(zhì)的損傷相關(guān)[16-18]。但也有研究表明，NAC的抑菌效果與其pH之間沒有明顯關(guān)聯(lián)，1mmol/ml的NAC幾乎可完全裂解細(xì)菌培養(yǎng)物中的雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA），即使其變?yōu)橹行裕@種裂解也保持在50%左右，而細(xì)胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）對BF的發(fā)育和結(jié)構(gòu)的完整性來說至關(guān)重要，NAC破壞BF的關(guān)鍵或許在于eDNA的降解，但需進(jìn)一步探索[19-21]。

圖2 具有藥物相加作用的培養(yǎng)孔與同濃度FOX單獨(dú)作用、同濃度FOX與中性NAC聯(lián)用時S. aureus ATCC29213培養(yǎng)物OD600比較

A.ATCC29213；B.ATCC43300

注：<0.001

表2 NAC與FOX聯(lián)合藥敏板中S. aureus ATCC29213 BF結(jié)晶紫染色的吸光度（未調(diào)節(jié)pH，OD600）

圖3 藥物作用22h后S. aureus ATCC29213激光共聚焦下的熒光圖像（×40）

A.E6孔；B.D5孔；C.E7孔；D.H1孔；E.E6孔（pH6.8～7.0）；F.D5孔（pH6.8～7.0）；G.E7孔（pH 6.8～7.0）；H.A12孔

是臨床常見病原菌，其BF形成能力是產(chǎn)生藥物耐受的重要原因之一，與之相關(guān)的感染在治療和診斷上仍存在著較大的困難。本試驗(yàn)僅選取ATCC29213和ATCC43300進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，但除了單物種BF外，包含不同種、屬的混合BF在人類宿主中也十分常見。這種混合BF內(nèi)積累的生存阻力相對更大，其中的細(xì)菌更易通過抗性基因的水平轉(zhuǎn)移等方式增強(qiáng)自身抵抗力，導(dǎo)致實(shí)際治療中包括常規(guī)一線藥物在內(nèi)的多數(shù)抗生素難以根除這些與BF關(guān)聯(lián)的感染，給人類健康和疾病治療帶來艱巨挑戰(zhàn)[22]。因此，進(jìn)一步開展對臨床分離株及混合病原菌的聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)十分必要。

尋找針對細(xì)菌BF的新型治療方法是當(dāng)前的緊迫問題，其在臨床實(shí)踐中扮演著十分重要的角色，但新藥的開發(fā)費(fèi)用較高且過程緩慢，藥物再利用就成為另一種合理有效的解決辦法。本試驗(yàn)結(jié)果有助于支持使用NAC作為具有抗細(xì)菌BF應(yīng)用潛力的候選藥物用于預(yù)防和治療BF的形成。

[1] KWIECINSKI J M, HORSWILL A R.bloodstream infections: Pathogenesis and regulatory mechanisms[J]. Curr Opin Microbiol, 2020, 53: 51–60.

[2] 胡付品, 郭燕, 朱德妹, 等. 2021年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志, 2022, 22(5): 521–530.

[3] LEE A S, DE LENCASTRE H, GARAU J, et al. Methicillin-resistant[J]. Nat Rev Dis Primers, 2018, 4: 18033.

[4] MLYNARCZYK-BONIKOWSKA B, KOWALEWSKI C, KROLAK-ULINSKA A, et al. Molecular mechanisms of drug resistance in[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(15): 1–33.

[5] MOORMEIER D E, BAYLES K W.biofilm: A complex developmental organism[J]. Mol Microbiol, 2017, 104(3): 365–376.

[6] 楊中瀾, 王敏, 周莉莉, 等. 乙酰半胱氨酸的藥理作用與臨床應(yīng)用[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2021, 37(14): 1932–1936.

[7] CALVERLEY P, ROGLIANI P, PAPI A. Safety of N-acetylcysteine at high doses in chronic respiratory diseases: A review[J]. Drug Saf, 2021, 44(3): 273–290.

[8] PéREZ-GIRALDO C, RODRíGUEZ-BENITO A, MORáN F J, et al. Influence of N-acetylcysteine on the formation of biofilm byepidermidis[J]. J Antimicrob Chemother, 1997, 39(5): 643–646.

[9] POLLINI S, BONCOMPAGNI S, DI MAGGIO T, et al. In vitro synergism of colistin in combination with N-acetylcysteine againstgrown in planktonic phase and in biofilms[J]. J Antimicrob Chemother, 2018, 73(9): 2388–2395.

[10] MANOHARAN A, OGNENOVSKA S, PAINO D, et al. N-acetylcysteine protects bladder epithelial cells from bacterial invasion and displays antibiofilm activity against urinary tract bacterial pathogens[J]. Antibiotics (Basel), 2021, 10(8): 1–17.

[11] YANG F, ZHANG S, SHANG X, et al. Short communication: N-acetylcysteine-mediated augmentation of β-lactam antibacterial activity against methicillin- resistantisolated from bovine mastitis cases[J]. J Dairy Sci, 2019, 102(8): 6920–6922.

[12] SAENHOM N, KANSAN R, CHOPJITT P, et al. Evaluation of in-house cefoxitin screening broth to determine methicillin-resistant[J]. Heliyon, 2022, 8(2): e08950.

[13] LEBER A. Synergism testing: Broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods[M]. Washington, DC: ASM Press, 2016: 11–23.

[14] 丁麗, 陳佰義, 李敏, 等. 碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及報告專家共識[J]. 中國感染與化療雜志, 2023, 23(1): 80–90.

[15] KAMBLE E, SANGHVI P, PARDESI K. Synergistic effect of antibiotic combinations onbiofilms and their persister cell populations[J]. Biofilm, 2022, 4: 100068.

[16] DINICOLA S, DE GRAZIA S, CARLOMAGNO G, et al. N-acetylcysteine as powerful molecule to destroy bacterial biofilms. A systematic review[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(19): 2942–2948.

[17] NAGY P. Kinetics and mechanisms of thiol-disulfide exchange covering direct substitution and thiol oxidation-mediated pathways[J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 18(13): 1623–1641.

[18] KUNDUKAD B, SCHUSSMAN M, YANG K, et al. Mechanistic action of weak acid drugs on biofilms[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 4783.

[19] AMARAL E P, CONCEI??O E L, COSTA D L, et al. N-acetylcysteine exhibits potent anti-mycobacterial activity in addition to its known anti-oxidative functions[J]. BMC Microbiol, 2016, 16(1): 251.

[20] PANLILIO H, RICE C V. The role of extracellular DNA in the formation, architecture, stability, and treatment of bacterial biofilms[J]. Biotechnol Bioeng, 2021, 118(6): 2129–2141.

[21] MANOHARAN A, DAS T, WHITELEY G S, et al. The effect of N-acetylcysteine in a combined antibiofilm treatment against antibiotic-resistant[J]. J Antimicrob Chemother, 2020, 75(7): 1787–1798.

[22] TUCK B, WATKIN E, SOMERS A, et al. A critical review of marine biofilms on metallic materials[J]. NPJ Materials Degradation, 2022, 6(25): 1–12.

Effect of N-acetylcysteine combined with cefoxitin onin vitro drug susceptibility tests

WU Tong, GU Haiying

1.Health Science Center, Ningbo University, Ningbo 315211, Zhejiang, China; 2.Laboratory of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Medical School of Ningbo University, Ningbo 315020, Zhejiang, China

To conduct a combination susceptibility test of cefoxitin (FOX) with N-acetylcysteine (NAC) or NAC adjusted to neutral pH on() ATCC29213 and ATCC43300, aiming to evaluate the drugs effect and the acidic properties of NAC on.Minimal inhibitory concentration (MIC) of FOX and NAC were tested by broth microdilution method; Combining drug susceptibility experiment was tested by the checkerboard method. The biofilm biomass quantification was determined by crystal violet staining. Biofilm (BF) composition changes were visualized using confocal laser scanning microscopy. The experiment was performed again by using neutral NAC.MIC of FOX againstATCC29213 and ATCC43300 were 2μg/ml and 32μg/ml. MIC of NAC was 4mg/ml for both strains, while the MIC of neutral NAC was greater than 64mg/ml. Both strains show an additive effect between NAC and FOX when the pH was low, where the content of BF, the number of bacteria, and the polysaccharide component of BF decreased. However, the drug’s effects were shown as irrelevant or antagonistic when the pH was adjusted to neutral.NAC is able to increase the sensitivity ofto FOX and significantly destroys BF formation, and the acidity of NAC might be the key to its effects.

; Biofilm; N-acetylcysteine; Antibiofilm

R37

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.022

谷海瀛，電子信箱：guhaiying@nbu.edu.cn

（2023–04–27）

（2023–08–22）