基于急慢性疼痛的動物模型研究進展

劉曦，龔黎燕

基于急慢性疼痛的動物模型研究進展

劉曦，龔黎燕

浙江省腫瘤醫院疼痛康復科，浙江杭州 310022

疼痛管理是臨床醫學的重點研究內容之一。目前，急慢性疼痛的機制尚未完全明確。為更深入地開展基礎研究，需建立更多且更有針對性的動物模型以模擬各類型疼痛。本文就近年來在疼痛基礎研究中常用的部分急慢性疼痛模型研究進展作一綜述，為進一步研究疼痛機制及篩選相關治療藥物提供理論參考。

動物模型；嗎啡耐受；急性疼痛；慢性疼痛；癌性疼痛

疼痛被列為現代醫學第五大生命體征，疼痛管理是臨床關注的重點之一。按損傷持續的時間，疼痛可分為急性疼痛和慢性疼痛。《癌癥疼痛診療規范（2018版）》[1]對疼痛的定義：持續時間超過1個月的疼痛為慢性疼痛，新近產生、持續時間較短的疼痛為急性疼痛。動物模型廣泛應用于疼痛的相關研究中，主要應用于疼痛機制的研究及鎮痛藥物效能的評估中。本文就近年來在疼痛基礎研究中常用的部分急慢性疼痛模型研究進展作一綜述，為進一步研究疼痛機制及篩選相關治療藥物提供理論參考。

1 急性疼痛模型

根據疼痛的發生原理，急性疼痛可分為生理性和病理性。生理性疼痛是指增加的局部刺激使機體產生的反應性疼痛；病理性疼痛是由創傷或疾病狀態帶來的炎癥反應或神經損傷引起的，若遷延不愈可發展為慢性疼痛。目前更常見的分類方法是根據所模擬疾病的病理生理特點，將急性疼痛模型分為軀體痛模型和內臟痛模型兩類。

研究認為，軀體痛可通過福爾馬林模型進行模擬[2]。將1%的福爾馬林液注射至實驗鼠右后爪背側，其可出現兩個不同時相的疼痛反應。第一時相為注射后立刻出現的疼痛，持續時間約為10min；第二時相則從注射15～20min后開始，持續時間約為1h。在實驗研究中，常使用第二時相。兩時相疼痛的發生機制不同，如非甾體類鎮痛藥可減輕第二時相疼痛，但無法控制第一時相疼痛。大鼠和小鼠對福爾馬林注射的反應也有所不同：大鼠表現為爪趾抽縮，小鼠表現為舔舐。目前認為第二時相疼痛是周圍炎癥性疼痛，與中樞敏化作用相關，該模型可用于因組織損傷造成的痛覺過敏機制的探索。

內臟痛動物模型主要通過炎性刺激觸發并建立。例如，扭體試驗是將刺激性化學物質注入實驗動物體腔內，從而引發炎性疼痛[3]。將乙酸、緩激肽等試劑注入動物腹腔，觀察動物隨之表現出的臀部位置不正、腹部收縮等扭體反應，動物體位的改變幅度或收縮動作頻率數據可用于量化評估。該方法可制備相應急性膀胱炎模型、潰瘍性結腸炎模型等。福爾馬林也可用于經典急性內臟痛模型的構建，向大鼠結腸壁注射1.5%的福爾馬林，15min后大鼠會出現舔舐、身體收縮、扭頭等動作，從而證實建模成功。

2 疼痛行為學檢測

疼痛行為學檢測是對實驗動物施加急性、傷害性刺激，通過動物縮足或甩尾潛伏期、機械性刺激或溫度刺激閾值等反射行為學變化，評估動物是否出現觸誘發痛、機械性痛敏及冷熱刺激反應。該類操作模擬生理性急性疼痛，無法使實驗動物產生病理改變，因此不能單獨用于模型制作，但常被用于各類疼痛動物模型中痛閾變化的驗證。

機械性痛覺反應檢測通常采用Von Frey試驗[4]。該試驗方法最早于19世紀由Maximilian Von Frey提出。利用Von Frey纖維絲彎曲產生既定壓力，按壓力的小大順序刺激實驗動物腳底并記錄其機械縮足閾值；或以恒定壓力的Von Frey纖維絲以恒定的頻率反復刺激，測試實驗動物后腿收縮頻率，即機械縮足持續時間。其中，機械縮足閾值的測定標準后由Dixon和Chaplan等進一步優化[5-6]。目前，該方法已逐漸被更加便捷、精準的Von Frey電子儀所取代，以保證纖維絲連續、均勻施力。

經大鼠肛門插入可擴張的氣囊，通過注氣擴張結直腸可模擬內臟痛，評估動物的誘發痛行為。痛閾可通過腹壁撤回反射評分進行評價。該實驗評估標準為大鼠的行為模式改變程度，實驗結果主觀性較強。

冷熱刺激反應是嚙齒類動物疼痛評估的常用方法。甩尾實驗是基于實驗鼠對熱刺激回避反應的潛伏期進行測量的實驗[7]。其操作方式為對實驗鼠尾部施加熱刺激，記錄實驗鼠尾巴甩動時間。相比于甩尾實驗，熱板實驗的優點在于不用約束實驗鼠，從而減少因人為干擾可能形成應激導致的疼痛。哈格里夫斯試驗通過小鼠后爪移開某一熱刺激所需的時間評估研究對象的疼痛反應[8]。

將甩尾實驗中的遠端熱水浴替換為冰水混合物即可用于檢測冷閾值，即冷刺激反應。丙酮實驗通過將丙酮滴到實驗大鼠后肢局部造成冷刺激，這種刺激不會讓正常大鼠感到疼痛，但存在冷觸覺過敏大鼠則會有疼痛反應[9]。因正常小鼠對丙酮相當敏感，易產生疼痛反應，故小鼠不適合丙酮實驗；丙酮滴導致的抬足反應可能是由于冷刺激，也可能是由于化學刺激，甚至是丙酮滴的機械刺激。目前，冷平板實驗多使用半導體制冷平板，適用于冷刺激痛及冷痛覺過敏的神經生物學機制和藥物療效研究。相較于丙酮實驗，冷平板實驗受環境溫度和實驗動物體溫影響較小，但無法避免機械刺激的影響是其劣勢[10]。

上述經典檢測方式的局限性在于所檢測到的反應僅為健康實驗動物接受急性傷害性刺激后的變化，且因重復測試，動物可能會學習到行為反應，從而導致實驗數據不夠準確[11]。

3 慢性疼痛模型

慢性疼痛即病理性疼痛，其機制較急性疼痛更為復雜。根據成因，其可分為神經性疼痛、炎癥性疼痛和癌性疼痛，涉及機體的系統性病變，其特點為自發性疼痛、痛覺過敏和感覺異常[12]。神經病理痛模型、慢性炎癥疼痛模型及骨癌痛模型、嗎啡耐受癌性疼痛模型等均是目前研究的熱點模型。

3.1 慢性非癌性疼痛動物模型

使用炎性物質在實驗動物皮下、關節腔注射或通過機械、熱損傷組織，可在嚙齒動物中誘發炎癥損傷，從而構建慢性炎癥疼痛模型。與急性期疼痛模型不同，為確保疼痛持續時間及相關炎性機制的觸發，需使用效用更長的化學試劑，最常用的是福氏佐劑足底內注射，或肌內、關節腔注射[13]。這是一種包含滅活丁酸分歧桿菌的油包水乳劑，易于誘發濃度依賴性損傷，產生的炎性疼痛反應可持續2周，且有延長的超敏反應期，可用于構建慢性骨關節炎疼痛模型。類似的佐劑性關節炎也可通過四甲基十五烷、角叉菜膠、蛋白多糖等誘發[14]。

神經病理性疼痛模型是慢性疼痛研究中的另一種經典動物模型。最早的神經痛模型是坐骨神經慢性壓扎模型，用羊腸線輕度結扎大鼠坐骨神經干，在術后3～5d引發疼痛反應，并在5～7d左右達峰，可持續2個月以上[15]。該模型可進一步優化為脊神經結扎模型和保留性神經損傷模型，分別為結扎切斷L5脊神經、結扎切斷脛神經和腓總神經，可避免坐骨神經慢性壓扎模型中受羊腸線松緊度影響疼痛強度，甚至影響肢體運動的情況；且保留性神經損傷模型下大鼠對機械刺激更加敏感[16]。另外，可將炎性疼痛與神經病理痛結合，在坐骨神經周圍直接置管注入促炎分子酶原，制備坐骨神經痛模型。

臨床上較為棘手的燒傷痛是一種由炎癥性疼痛、痛覺性疼痛和神經性疼痛復合而成的特殊疼痛類型，可通過綜合上述疼痛模型進行模擬，也可將小鼠置于中間流有熱水的空心金屬板上，控制燒傷厚度制備符合需求的燒傷疼痛模型[17]。此外還存在一些較為特殊的慢性神經病理疼痛模型，如用于研究化療藥物致周圍神經病理性疼痛的模型[16]。為制備該模型，Slivicki團隊向小鼠腹腔內每隔1d注射1次紫杉醇，用于引發小鼠對機械刺激和冷刺激的痛覺超敏。

3.2 慢性癌性疼痛動物模型

癌性疼痛發生于60%～80%的晚期惡性腫瘤中，其危害性極大，是目前疼痛康復領域研究熱點之一[1]。研究發現癌性疼痛屬慢性疼痛，與非癌性疼痛的機制不同，尤其慢性癌性疼痛刺激下的大鼠脊髓小膠質細胞活性明顯與非癌性不同[18]。因而用于研究癌性疼痛的動物模型與非癌性也有所區別。

癌癥引起的骨痛多見于晚期惡性腫瘤的骨轉移中，以機械觸發痛和痛覺敏化為特征，但其機制目前尚不明確。小鼠骨癌痛模型于1999年被首次提出[19]。早期的骨癌痛模型集中于原發性骨癌痛的還原，所選細胞為可誘發骨肉瘤生長的纖維肉瘤。但事實上，乳腺癌與前列腺癌較多發生骨轉移，激發骨癌性疼痛的現象更加常見。Medhurst將含MRMT細胞的Hank’s液注射到大鼠脛骨骨髓腔內，成功制備大鼠乳腺癌細胞誘導的骨癌痛模型[20]。使用Walker256大鼠腹水癌細胞對該模型進一步完善，形成簡單、實用的骨癌痛大鼠模型[21]。與小鼠模型相比，大鼠體質量大，腫瘤細胞數量上的可控范圍更大；同時大鼠骨骼粗，造模實驗操作更方便。早年研究者大多用小鼠造模的主要原因是腫瘤細胞的細胞系多來源于小鼠。

以嗎啡為代表的阿片類藥物是世界衛生組織推薦的重度癌性疼痛的標準用藥[1]。嗎啡耐受會嚴重影響其鎮痛效果，易發展成為難治性疼痛，改善嗎啡的耐受性是癌性疼痛治療中亟待解決的問題。嗎啡耐受屬藥理學概念，是指重復應用嗎啡后，機體對嗎啡的反應性降低，導致鎮痛效力降低，藥效-劑量曲線右移[22]。臨床表現為持續給予嗎啡后鎮痛效果逐漸減弱甚至消失，需增加劑量才能獲得同等鎮痛效果。以嗎啡為代表的阿片類藥物的耐受機制至今未完全明確。在基礎醫學領域，各類炎癥細胞因子，尤其是與炎癥發展及腫瘤微環境息息相關的趨化因子家族受到廣泛關注[17-18,23]。臨床上常通過輪換阿片類藥物防治嗎啡耐受，研究推測阿片受體調控可能是其中的關鍵機制，而相關機制的深入研究需要建立有針對性的動物模型[20]。

最常用的慢性癌性疼痛嗎啡耐受前期模型是大/小鼠骨癌痛模型，建模成功后進一步建立嗎啡耐受模型，連續6～10d給予實驗鼠固定量嗎啡。給藥形式各異，可通過皮下注射，也可采用鞘內導管輸注[20]。疼痛模型建立的驗證可應用簡易的熱板和Von Frey試驗，通過機械痛閾和熱痛閾的變化充分反映嗎啡耐受的存在，可表現為劑量–反應曲線右移，也可被進一步量化為最大鎮痛效率[21]。建立該動物模型需要較多的實驗動物分組，以驗證誘導嗎啡耐受和接受實驗用藥、安慰劑的不同結果[20]。在操作中，實驗者需留意疼痛狀態下動物對其他類型刺激的敏感性，以避免干擾行為學參數的讀取[22]。目前的慢性癌性疼痛嗎啡耐受模型模擬疼痛性狀的能力較為成熟，模擬嗎啡耐受狀態的建模精度不足，部分實驗傾向于使用三重對照組（生理鹽水、嗎啡、嗎啡加實驗藥物），將重點置于比對實驗藥物對嗎啡耐受的影響，而對嗎啡耐受現象缺少足夠標準的驗證，存在對照組建立不完善、疼痛閾值測量間隔不統一等問題[24]。

4 模型動物的選擇

疼痛對嚙齒動物的行為具有顯著影響，基礎研究中常用的動物模型是雄性大鼠[25]。大鼠體型適中，行為訓練期短，易操作、模擬損傷是其優勢，小鼠飼養成本低、品系豐富。近年來，受轉基因小鼠、化學遺傳等因素影響，小鼠的應用也越來越多。狗等哺乳動物存在使用和飼養成本高等問題而極少使用。

研究發現，不足10%的小鼠研究使用遠交系小鼠；而大鼠研究中，超過80%均使用遠交系[26]。應用較多的C57BL/6近交系小鼠表現出對熱刺激的高敏感性及對損傷引起的超敏反應的快速恢復性。在慢性疼痛的相關研究中，選擇遠交系小鼠或許能更好地模擬患者的慢性疼痛，具有“廣泛性表型”的特征。慢性疼痛與復雜的生活史息息相關，應考慮這些因素對嚙齒動物模型產生的影響，使用更具有異質性的動物模型。目前，大部分研究中的建模動物選擇2～3月齡的大、小鼠，較適宜于急性疼痛的研究。綜上，疼痛研究中選用遠交系大/小鼠更具針對性，且應納入月齡較大且不同性別的動物。

5 小結與展望

在急慢性疼痛的機制研究和藥物篩選中，使用可靠的動物模型具有重要意義。然而，許多臨床疼痛是目前的動物模型僅通過行為學變化無法模仿的，如幻肢痛、頭痛、脊髓損傷導致的疼痛等。有學者提出，皮層可塑性可作為新的測量重點，補充行為學檢測的不足[27]。隨著基礎研究的不斷深入，各類疼痛動物模型將進一步優化，強調活體動物實驗結合人體組織的體外研究，得以雙向驗證新的疼痛靶點可能是動物疼痛模型臨床轉化的重點。

[1] 中華人民共和國國家衛生健康委員會. 癌癥疼痛診療規范(2018版)[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2018, 23(10): 937–944.

[2] 王紋紋, 雷靜, 尤浩軍. 內臟痛實驗動物模型的研究進展[J]. 生物化學與生物物理進展, 2022, 49(5): 858–866.

[3] 趙媛, 孔高茵, 周搏, 等. 脊髓IL-33在關節炎大鼠痛覺過敏中的表達[J]. 中國現代醫學雜志, 2020, 30(1): 8–12.

[4] JENNIFER R, LUCIE S, IRINA V R. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents[J]. Front Mol Neurosci, 2017, 10: 284.

[5] CHAPLAN S, BACH F, POGREL J, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J]. J Neurosci Methods, 1994, 53(1): 55–63.

[6] DIXON W. The up-and-down method for small samples[J]. Journal of the American Statistical Association, 1965, 60(312): 967–978.

[7] MIZOGUCHI H, FUKUMOTO K, SAKAMOTO G, et al. Maternal separation as a risk factor for aggravation of neuropathic pain in later life in mice[J]. Behav Brain Res, 2019, 359: 942–949.

[8] MURALIDHARAN A, SOTOCINAL S G, AUSTIN J S, et al. The influence of aging and duration of nerve injury on the antiallodynic efficacy of analgesics in laboratory mice[J]. Pain Rep, 2020, 5(3): e824.

[9] 呂繼鵬, 冷玉芳, 范俊, 等. 內臟痛動物模型的制備和特點[J]. 中國疼痛醫學雜志, 2021, 27(2): 133–139.

[10] 彭皓, 黃東. 嚙齒類動物疼痛評估方法的研究進展[J]. 中國疼痛醫學雜志, 2014, 20(7): 505–508.

[11] 張昆龍, 朱慧, 王正梅, 等. 動物痛行為學檢測方法的研究進展[J]. 神經解剖學雜志, 2020, 36(2): 215–220.

[12] DE CIANTIS P D, YASHPAL K, HENRY J, et al. Characterization of a rat model of metastatic prostate cancer bone pain[J]. Pain Res, 2010, 3: 213–221.

[13] ZHU X, XU Y, SHEN Z, et al. Rostral anterior cingulate cortex-ventrolateral periaqueductal gray circuit underlies electroacupuncture to alleviate hyperalgesia but not anxiety-like behaviors in mice with spared nerve injury[J]. Front Neurosci, 2022, 15: 757628.

[14] SLIVICKI R A, IYER V, MALI S S, et al. Positive allosteric modulation of CB1cannabinoid receptor signaling enhances morphine antinociception and attenuates morphine tolerance without enhancing morphine- induced dependence or reward[J]. Front Mol Neurosci, 2020, 13: 54.

[15] 黃軍凱, 陳祁青, 趙繼榮, 等. 根性神經痛動物模型的研究進展[J]. 中國現代醫學雜志, 2022, 32(21): 52–56.

[16] 張春鵬, 周慶輝. 骨癌痛模型研究進展[J]. 中國疼痛醫學雜志, 2018, 24(10): 774–777.

[17] JI H, JIN X, ZHANG Q, et al. A mouse model of cancer induced bone pain: From pain to movement[J]. Front Behav Neurosci, 2022, 16: 873750.

[18] 馬超, 陳靜, 劉丹丹, 等. 癌痛治療中嗎啡耐受機制研究進展[J]. 國際麻醉學與復蘇雜志, 2022, 43(7): 757–761.

[19] CURRIE G L, DELANEY A, BENNETT M I, et al. Animal models of bone cancer pain: Systematic review and Meta-analyses[J]. Pain, 2013, 154(6): 917–926.

[20] MEDHURST S J，WALKER K, BOWES M, et al. A rat model of bone cancer pain[J]. Pain, 2002, 72(1-2): 3–11.

[21] 代倩倩, 李心怡, 夏桂陽, 等. 慢性疼痛動物模型研究進展及在中醫藥研究中的應用[J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(24): 5866–5876.

[22] CORDER G, TAWFIK V L, WANG D, et al. Loss of μ opioid receptor signaling in nociceptors, but not microglia, abrogates morphine tolerance without disrupting analgesia[J]. Nat Med, 2017, 23(2): 164–173.

[23] LUO X, WANG X, XIA Z, et al. CXCL12/CXCR4 axis: An emerging neuromodulator in pathological pain[J]. Rev Neurosci, 2016, 27(1): 83–92.

[24] FORSTENPOINTNER J, RUSCHEWEYH R, ATTAL N, et al. No pain, still gain (of function): The relation between sensory profiles and the presence or absence of self-reported pain in a large multicenter cohort of patients with neuropathy[J]. Pain, 2021, 162(3): 718–727.

[25] AVONA A, BURGOS-VEGA C, BURTON M D, et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models[J]. J Neurosci, 2019, 39(22): 4323–4331.

[26] SADLER K E, MOGIL J S, STUCKY C L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals[J]. Nat Rev Neurosci, 2022, 23(2): 70–85.

[27] ZHUO M. Cortical plasticity as a new endpoint measurement for chronic pain[J]. Mol Pain, 2011, 7: 54.

（2023–03–03）

（2023–09–08）

R739.9

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.029

浙江省基礎公益研究計劃項目（LY19H290001）；浙江省康復醫學會科研基金項目（ZKKY2023005）

龔黎燕，電子信箱：1413472557@qq.com