莢膜甲基球菌蛋白的急性毒性和亞慢性毒性研究

張思微， 聶 雅 ， 劉 瑜， 高嫣珺， 卜仕金

（1.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇揚州 225009）

隨著全球畜牧和水產養殖業的發展， 魚粉作為飼料的主要蛋白原料需求日益增加 （彭凱等，2022）。近年來，大宗飼料蛋白原料供應匱乏，魚粉因其蛋白含量高、氨基酸平衡和適口性好等優點，價格居高不下（Guo 等，2022）。 植物蛋白如大豆粉、玉米粉等，來源廣泛且價格低，是理想的魚粉替代品（Gatlin 等，2007），但植物蛋白含有抗營養物質、氨基酸不平衡和纖維素含量高等缺點，限制了其進一步使用 （Hansen 等，2011；De Francesco等，2004），不受海洋資源、農業用地和氣候變化限制的可持續蛋白質的需求不斷增加（Dalton，2005），因此通過回收秸稈、溫室廢氣等從細菌、真菌和微藻中獲得的單細胞蛋白（SCP）具有廣闊的應用前景（o/verland 等，2010）。 甲烷是天然氣的主要成分，在自然界中分布廣泛且供應充足，是產生菌體蛋白的理想培養基（傅曉瑩等，2022；Hanson等，1996）。 莢膜甲基球菌蛋白（MBM）是一種由甲烷與莢膜甲基球菌自然發酵產生的SCP， 粗蛋白質含量高達65%，同時氨基酸組成平衡，相當于高品質魚粉（Biswas 等，2020）。盡管作為魚粉的替代物， 國內外已有研究證明了MBM 在多種動物的安全性和有效性（Hellwing 等，2006；Skrede 等，2003），但其在我國尚未批準作為飼料添加劑?！缎嘛暳虾托嘛暳咸砑觿┕芾磙k法》中（中華人民共和國農業農村部，2012）規定，新飼料添加劑的申請資料應包括毒理學安全評價報告。目前，國內鮮見對MBM 進行系統的毒理學評價研究， 本研究進行MBM 的大、 小鼠經口急性毒性試驗和90 d 毒性試驗即亞慢性毒性試驗， 旨在確定其半數致死量（LD50）及長期飼喂不同劑量MBM 的有害效應劑量、毒作用性質和靶器官（沈建忠，2002），以期為MBM 的毒理學評價和臨床使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 莢膜甲基球菌蛋白（MBM）：粗蛋白質含量≥65%， 褐色粉末。 批號為FNJ012-20210308，由愷迪蘇（重慶）有限公司南京中試基地提供，使用0.5%羧甲基纖維素鈉制備混懸液。羧甲基纖維素鈉、甲醛、蘇木素伊紅、石蠟均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器 病理切片機，購自徠卡顯微系統貿易有限公司；生物顯微鏡，購自德國ZEISS；電子天平，購自上海友聲衡器有限公司；電子分析天平購自德國賽多利斯天平公司； 貝克曼Unicel Dxc800 synchron 型全自動生化分析儀；Sysmex XE-2100 型全自動血液分析儀。

1.3 試驗動物與飼料 急性毒性試驗：Wistar 大鼠（清潔級），6 ～7 周齡，雄性196.9 ～210.3 g，雌性180.8 ～185.2 g；ICR 小鼠 （清潔級），4 ～5 周齡，雄性18.8 ～22.0 g，雌性18.7 ～22.0 g，喂食普通飼料。 亞慢性毒性試驗：Wistar 大鼠（SPF 級），4 ～5 周齡， 雄性70.6 ～103.0 g， 雌性80.3 ～106.9 g。 喂食添加不同濃度MBM 的飼料和空白飼料， 飼料委托江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司加工制作。 動物均由揚州大學比較醫學中心提供， 動物生產許可證號：SCXK （蘇）2017-0007；使用許可證：SYXK（蘇）2017-0044。

1.4 急性毒性試驗設計 采用限量法設計MBM大、小鼠經口急性毒性試驗。采用隨機分組法將大鼠和小鼠各分為對照組和給藥組，每組20 只（雌雄各半）。 大鼠分兩次經口灌胃MBM 混懸液（0.5 g/mL），間隔4 h，每次劑量為10 mL/kg·bw；小鼠一次經口灌胃MBM 混懸液，劑量為20 mL/kg·bw。第1 天上午8 點染毒， 受試物在染毒結束后持續觀察30 min，2 h 后再觀察一次， 之后每天上午8點觀察一次，連續觀察14 d，期間動物自由采食和飲水。 試驗期間觀察記錄動物健康狀況、飲食、體重及死亡情況，觀察結束后將所有存活大、小鼠處死后進行大體剖檢觀察。

1.5 亞慢性毒性試驗設計

1.5.1 試驗分組及給藥 80 只大鼠隨機分為4組，每組20 只（雌雄各半），分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，三個劑量暴露組的飼料MBM 添加濃度分別設為10000 mg/kg （相當于1.0%添加量）、25000 mg/kg（相當于2.5%添加量）和50000 mg/kg（相當于5.0%添加量），對照組給予空白飼料，連續給藥90 d。

1.5.2 毒理學評價指標 試驗期間， 每日進行一般與臨床觀察，記錄異?，F象。 每周稱量體重，統計飲水及飼料消耗。試驗中期（給藥第45 天）和末期（給藥第90 天）各組稱重采血后剖殺10 只動物（雌雄各半）進行大體剖檢，采集心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、睪丸及卵巢稱重并計算臟器系數，主要臟器組織進行組織病理學檢查。 采集的血液用于血液學和血液生化相關指標的檢測。

1.6 數據分析 試驗數據以“平均值±標準差”表示，使用SPSS 26.0 進行統計學分析，單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗不同指標各劑量組數據是否符從正態分布， 符從正態分布的數據組間比較采用獨立樣本T 檢驗；不符從正態分布的數據組間比較采用Mann-Whitney 檢驗； 相關性分析使用Spearman 相關性分析，顯著性水平為0.05。

2 結果

2.1 急性毒性試驗結果 本試驗劑量條件下，大、小鼠經口灌胃給予MBM 10 g/kg·bw 劑量，給藥后未見明顯異常反應。 試驗第3 天給藥組有一只小鼠死亡，剖檢可見胃壁破裂，肝臟覆有藥液，判斷死因為灌胃操作不當， 其余大、 小鼠均未死亡。 試驗觀察期內采食、飲水和排便等均正常，體重正常增長，未出現中毒反應。試驗結束時進行大體剖檢，各臟器組織均未見明顯異常，毒性劑量和毒性靶器官均未明確顯示。

2.2 亞慢性毒性試驗結果

2.2.1 臨床表現 各組動物在給藥期內， 均未出現中毒及異常死亡情況，行為活動、精神狀態、分泌排泄物等臨床觀察內容均未見異常情況。

2.2.2 體重和攝食與飲水量 試驗各周期雌、雄大鼠體重變化見圖1a。 雄性大鼠低劑量組與對照組相比各周期均無顯著性差異（P ≥0.05）；中劑量組第6 周與對照組相比差異極顯著（P ＜0.01）；高劑量組第5、6 周顯著高于對照組（P ＜0.05）。雌性大鼠低、 中劑量組各周期體重與對照組相比均無顯著性差異（P ≥0.05）；高劑量組第3 周與對照組相比差異顯著（P ＜0.05），第4 ～13 周差異極顯著（P ＜0.01）。 相關性分析結果顯示，雄性大鼠第5、6 和10 ～13 周、 雌性大鼠第3 ～13 周體重與MBM 飼料添加量呈正相關（P ＜0.05）。

圖1 體重和攝食及飲水量結果

試驗各周期雌、 雄大鼠平均飲水和攝食量見圖1b。 與對照組相比，低劑量組雌、雄大鼠平均攝食量無顯著差異（P ≥0.05）、中、高劑量組差異極顯著（P ＜0.01）；低、中劑量組雌、雄大鼠及高劑量組雌鼠平均飲水量無顯著差異（P ≥0.05）；高劑量組雄鼠平均飲水量差異極顯著（P ＜0.01）。

根據平均攝食量和飼料MBM 濃度， 標準化MBM 攝入量：雄性大鼠平均每日MBM 攝入量分別為582、1601、3281 mg/kg·bw； 雌性大鼠分別588、1561、3138 mg/kg·bw。

2.2.3 血液學和血液生化 試驗中期和末期，雌、雄大鼠各組血液學和血液生化檢測結果分別見表1 和表2。 血液學檢測結果顯示，僅中期雄性大鼠淋巴細胞絕對值（LYM）與對照組差異顯著（P ＜0.05）；血液生化檢測結果顯示，雌、雄大鼠各劑量組與對照組比較，各項指標在試驗中、末期均無顯著差異（P ≥0.05）。

表1 試驗中期和末期雌、雄大鼠血液學檢測結果

2.2.4 臟器系數和病理檢查 試驗中期和末期，雌、雄大鼠各組臟器系數見表3。 給藥中期，與對照組各臟器系數相比，雄性大鼠低劑量組腎、睪丸差異顯著（P ＜0.05）， 中劑量組肝臟差異極顯著（P ＜0.01）；雌性大鼠中劑量組脾、肺及高劑量組脾、卵巢差異顯著（P ＜0.05）。給藥末期，與對照組各臟器系數相比， 雄性大鼠各劑量組均無顯著差異（P ≥0.05）；雌性大鼠僅低劑量組腎臟及高劑量組肝臟差異顯著（P ＜0.05）。

表3 試驗中期和末期雌、雄大鼠臟器系數 %

試驗中期和末期， 各劑量組與對照組大體剖檢均未見任何肉眼可見的異?；虿∽?。 進一步對試驗末期高劑量組和對照組大鼠進行組織病理學檢查，各組織器官組織病理學檢查結果見圖2，未觀察到與給藥相關的組織病理學變化。

3 討論

《獸藥急性毒性試驗（LD50測定）指導原則》中（中華人民共和國農業農村部，2009）要求，劑量達5000 mg/kg·bw 時無動物死亡， 增加動物數至10重復兩次無死亡，即可確定LD50。鑒于已有研究顯示菌體蛋白在小鼠LD50≥20 g/kg·bw （趙葉，2009），結合前期預試驗的劑量探索，為進一步精確LD50范圍， 大、 小鼠急性經口毒性試驗參考GB15193.3-2014（食品安全國家標準，2014）采用限量法， 即給予動物最大使用濃度和最大灌胃容量的MBM 溶液，由于大、小鼠的最大灌胃容量分別為4 mL/200 g·bw 和0.4 mL/20 g·bw，而其常用的單次灌胃容量分別為2 mL/200 g·bw 和0.4 mL/20 g·bw， 因此大鼠分兩次灌胃給予MBM 混懸液。 盡管MBM 在水中具有較好的溶解性，但其水溶液很快產生沉淀， 為在正式試驗時劑量足夠準確，使用0.5%羧甲基纖維素鈉制備混懸液，濃度為0.5 g/mL。 通過急性毒性試驗確定LD50時，死亡動物數為其主要依據（孫明杰等，2022），試驗中因灌胃操作不當導致給藥組一只小鼠死亡， 未及時補充動物或提前增加備用動物， 這是本研究的設計缺陷之一。 由于前期預試驗采用正式試驗相同的劑量，動物死亡率為0/4，因此該小鼠的死亡并未對結果的判定產生影響。試驗期間，其他動物均未出現中毒反應和死亡， 且大體剖檢各組織器官均未見病變， MBM 在大、小鼠的LD50均≥10 g/kg·bw?！东F藥急性毒性試驗（LD50測定）指導原則》中并未要求設置溶媒對照組， 本研究在急性毒性試驗中大、小鼠各設置相同動物數的對照組，旨在排除由試驗操作等引起的誤差， 并獲得體重數據為后期試驗提供參考， 體重在本研究中不作為判定毒性的指標，因此不在本文中呈現。

亞慢性毒性試驗中， 飼料中MBM 添加量為1%、2.5%和5%，飼喂大鼠90 d，各劑量組動物均未出現中毒表現，表現出良好的耐受。 試驗期間，雄性大鼠中、 高劑量組個別周期體重顯著高于對照組，相關性分析結果顯示除差異顯著的周期外，另有部分周期與MBM 飼料添加濃度呈正相關；與雄性相近，雌性大鼠自第3 周至第13 周，體重均顯著高于對照組， 且與MBM 飼料添加濃度呈正相關。 由此可見，在5%濃度范圍內，大鼠部分生長周期體重隨MBM 飼料添加濃度增加而增加，且這一現象在雌性大鼠更為突出。一項對日糧蛋白質水平的研究表明， 日糧蛋白質水平的提高增加了生長期大鼠對飼料的轉化效率， 從而使大鼠體重增加（劉闖，2014），由此推測本研究中動物體重的統計學差異可能與MBM 較高的蛋白含量有關，伴隨動物體重增加，部分組別平均攝食和飲水量的存在顯著差異，與MBM 毒性無關，為正常生理現象。 本研究未在空白對照組以外設置與高劑量組飼料蛋白質水平相當的對照組， 為本研究的設計缺陷之二。 血液學和血液生化指標僅雄性大鼠給藥中期LYM 存在顯著差異，但未呈劑量相關性且至末期差異即不存在， 同時該值在Wistar大鼠的參考值范圍內（錢江等，2018）。 試驗中期雌、 雄性大鼠三個劑量組個別臟器的臟器系數與對照組相比存在差異，但至末期差異已不存在；雌性大鼠至試驗末期， 高劑量組肝和低劑量組腎與對照組比較存在差異，病理學檢查和反映肝、腎功能血液生化指標均未提示該差異與MBM 毒性有關，推測為動物生理狀況差異所致。以上指標統計學分析結果結合對照組和高劑量組中大體剖檢和組織病理學檢查，表明MBM 1%、2.5%和5%添加于飼料，連續飼喂Wistar 大鼠90 d，各劑量組均未出現明顯的毒性作用。

4 結論

本試驗劑量條件下，急性毒性試驗結果表明，MBM 在大、 小鼠的LD50均≥10 g/kg·bw， 根據WTO 有關外源性化學物急性毒性分級標準進行評價，屬實際無毒；亞慢性毒性試驗結果表明，添加5%MBM 于飼料中連續飼喂大鼠90 d， 未觀察到明顯的有害作用，無作用劑量至少達到3100 mg/kg·bw。 MBM 作為飼料添加劑使用基本安全。