重組枯草芽孢桿菌產角蛋白酶的發酵培養基及發酵條件優化

利剛慧， 劉俊杰， 彭帥英 ， 梁穎茵， 鄢陸琪， 李昆太

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.江西農業大學生物科學與工程學院，江西南昌 330045）

角蛋白是動物毛發和甲角的主要成分， 其是自然界中繼纖維素類和甲殼素類之后產量第三大的蛋白質類有機聚合物（Bealer 等，2020）。角蛋白富含各類氨基酸，除高達10% ～14%的半胱氨酸外，還含有精氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等必需氨基酸（Hassan 等，2020）。 國外將來自家禽加工廠和屠宰場的羽毛、毛發和其他角化副產品歸類為第三類動物副產品，這意味著它們屬于對人體和動物健康風險程度較低的原材料（Verma，2017）。 因此，角蛋白被視為潛在的優良蛋白質或氨基酸資源，可資源化應用于飼料、肥料、食品、醫藥等行業。

由于角蛋白分子富含相互交聯的二硫鍵、氫鍵以及疏水氨基酸，致使其結構極為致密，不僅不溶于水、弱酸、有機溶劑，而且不易被胰蛋白酶或胃蛋白酶等常規蛋白水解酶水解， 給其資源化利用帶來極大困難（De Oliveira 等，2020）。目前工業降解角蛋白的方式主要有高溫高壓水解法、 酸堿水解法和物理膨化法，但這些方法存在能耗高、氨基酸營養損失大和環境二次污染等諸多缺點（Lazarus 等，2021）。 角蛋白酶系一種可特異性降解角蛋白的酶類，不僅綠色環保、經濟實用，而且不會破壞氨基酸的天然結構， 在角蛋白降解領域展現出巨大的應用潛力和生態價值（Srivastava等，2020）。 角蛋白酶產生菌的來源與分布十分廣泛，在細菌、放線菌和真菌中均發現有角蛋白酶的產生（Gupta 等，2006）。 目前發現的角蛋白酶大多產于細菌，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）為主，如地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）、解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）和蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）等（Su 等，2020；Li 等，2019）。

然而，產量低、活性差、性質弱一直是制約角蛋白酶工業化生產和應用的問題 （蔣少龍等，2019）。 尤其是野生型產角蛋白酶菌株的酶表達量不高（胡洪，2013），難以滿足工業化所需。近年來， 隨著分子生物學和基因工程技術的迅速發展，研究學者們對角蛋白酶的分子研究主要集中在角蛋白酶的異源表達和角蛋白酶分子改造兩個方面，極大促進了角蛋白酶穩定性和產量的提高（Su 等，2020）。 目前已報道的用于角蛋白酶異源表達的宿主菌主要有大腸桿菌、芽孢桿菌和畢赤酵母等。 其中，枯草芽孢桿菌因其具有完整的蛋白質折疊分泌機制，且在表達來源于芽孢桿菌屬的角蛋白酶基因時不存在密碼子偏好性問題，在異源表達角蛋白酶方面有著得天獨厚的優勢（Liu 等，2014）。 例如，Peng 等（2020）將來源于地衣芽孢桿菌BBE11-1 （B.licheniformis BBE11-1)的角蛋白酶基因KerZ1 在枯草芽孢桿菌WB600中分泌表達， 并通過優化工程菌在15-L 罐上發酵產酶的溫度、pH、溶氧、補料等過程參數，使得重組角蛋白酶KerZ1 的酶活達到426.60 KU/mL，較原始菌株的角蛋白酶酶活（120.1 U/mL）提高了3552 倍。 Yang 等（2015）將來源于解淀粉芽孢桿菌K11（B.amyloliquefaciens K11）的角蛋白酶基因KerK 在不能降解羽毛的枯草芽孢桿菌SCK6 中進行表達， 重組表達角蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌能在24 h 內完全降解羽毛。 Gong 等（2020） 采用aprE 啟動子將角蛋白酶基因kerBv在枯草芽孢桿菌中進行異源表達，其酶活性提高了15 倍左右。 本研究以自主構建的角蛋白酶kerJY-23 分泌表達工程菌枯草芽孢桿菌WB600為研究對象，對其產酶的發酵培養基和發酵條件進行優化，旨在為該重組角蛋白酶工業化降解角蛋白提供基礎。

1 材料與方法

1.1.1 菌株 重組角蛋白酶工程菌枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23，由本實驗室構建并保藏。

1.1.2 主要試劑和儀器 5%可溶性角蛋白購自東京化成工業株式會社；LB 肉湯購自北京陸橋技術有限公司； 酵母浸膏購自廣東環凱生物科技有限公司； 福林酚試劑購自上海源葉生物科技有限公司；卡那霉素購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈉等化學試劑均購自上海麥克林生化科技有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-100A）：上海云泰儀器儀表有限公司；電熱恒溫水槽（SSW-420-2S）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；上海雷磁pH 計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；恒溫振蕩器（HZQ-X500C）：上海一恒科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司；高速冷凍離心機（KDC-160HR）：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.1.3 培養基 種子培養基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 L，pH（7.0±0.2）。

初始發酵培養基：葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，CaCl20.025 g，FeSO4·7H2O 0.015 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.4 ～7.6，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 試驗方法

然而，用哺乳動物瘦素處理銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)[39]、鯰(Ictalurus punctatus)[40]和綠海魴(Lepomis cyanellus)[27]，卻不改變它們的攝食行為或能量代謝。

1.2.1 培養方法 種子制備： 取出于甘油中-80 ℃凍存的枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 菌液，先后于-20 ℃和4 ℃解凍，吸取200 μL 接種于50 mL LB 液體培養基 （含50 μg/mL 卡那霉素）中，37 ℃、200 r/min 培養12 h 獲得種子液。

初始發酵條件： 以2% 接種量接種重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 種子液于裝量為50 mL 初始發酵培養基 （含50 μg/mL 卡那霉素） 的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養48 h。

1.2.2 角蛋白酶活性的測定 參考Yamamura 等（2002）的測定方法并進行適當修改，使用1% 的可溶性角蛋白 （在50 mmol pH 8.0 的Tris-HCl中稀釋）作為底物來測定角蛋白酶活性。向1 mL底物中加入1 mL 適當稀釋的粗酶液， 在60 ℃下孵育20 min。 加入2 mL 0.4 mol/L 的三氯乙酸終止反應，以12000 r/min 離心5 min，收集上清液1 mL 至試管中，加入1 mL 福林酚試劑和5 mL 0.4 mol/L Na2CO3，混勻后置于60 ℃水浴中孵育20 min，測定660 nm 處的吸光度。 對于空白對照的測定，1 mL 菌液先加入2 mL 0.4 mol/L TCA使酶失活，再加入1 mL 1%可溶性角蛋白。 試驗結果為多組試驗的平均值。 酶活定義：在上述反應條件下，660 nm 下吸光度值每增加0.01 定義為一個酶活力單位（U/mL）。

1.2.3 單因素試驗優化產酶條件 培養基組分的單因素優化： 通過改變發酵基礎培養基中的單一組分， 研究不同組分對菌株發酵產角蛋白酶的影響。其中，碳源種類的優化分別采用濃度為50 g/L的葡萄糖、蔗糖、葡萄糖：蔗糖（25：25 g/L）、麥芽糖、可溶性淀粉；有機氮源種類的優化分別采用濃度為20 g/L 的酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿粉、 黃豆餅粉； 硫酸銨添加濃度的優化分別采用0、2.5、5、7.5、10、12.5 g/L；金屬離子的優化分別采用添加濃度為0.05 g/L 的K+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+。

發酵條件的單因素優化： 分別考察不同發酵溫度 （29、33、37、41、45 ℃）、 培養基初始pH（6、6.5、7、7.5、8 和8.5）、裝液量（250 mL 三角瓶中分別裝有40、45、50、55、60、65 mL 發酵培養基）、接種量（2%、4%、6%、8%和10%）、搖床轉速（140、160、180、200、220 r/min）、發酵周期（12、24、36、48 h）對菌株發酵產角蛋白的影響。

1.2.4 二次通用旋轉組合設計試驗 以發酵培養基單因素試驗結果為基礎，對葡萄糖：蔗糖（X1）、酵母浸膏（X2）、硫酸銨（X3）、MnCl2（X4）四個因素進行4 因素5 水平的二次通用旋轉組合設計試驗， 用以優化菌株產角蛋白酶的最佳發酵培養基配方。 試驗因素水平及編碼如表1 所示。

表1 二次通用旋轉組合的試驗設計因素與水平 g/L

1.2.5 數據分析 試驗數據采用Excel 軟件進行處理，Origin 2021 軟件進行作圖分析， 二次通用旋轉組合設計的試驗結果分析均在DPS 數據處理軟件上運行， 試驗中各產酶條件的優化均為3次平行試驗， 結果以3 次試驗的 “平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基組分的單因素優化結果

2.1.1 碳源對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖1 可知，當葡萄糖和蔗糖復配時對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶促進作用最大。 根據不同碳源的酶活力差異性分析， 對其大小進行排序為葡萄糖：蔗糖＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞蔗糖＞麥芽糖。 單一的蔗糖和麥芽糖作碳源時產酶酶活相對較小，不適合作培養基中的碳源，因而選擇葡萄糖和蔗糖復配作為該菌發酵產角蛋白酶的碳源。

圖1 碳源種類對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.1.2 有機氮源對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖2 可見， 酵母浸膏作為氮源時， 重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶酶活最高。根據不同氮源的酶活力差異性分析， 對其大小進行排序為酵母浸膏＞玉米漿粉＞蛋白胨＞牛肉膏＞黃豆餅粉。 其中，黃豆餅粉作為氮源時角蛋白酶的表達量最低， 這可能是由于黃豆餅粉為遲效氮源，導致菌株生長代謝較緩慢，從而使得產酶較低。 因而， 選取酵母浸膏作為重組枯草芽孢桿菌WB600 發酵產角蛋白酶的有機氮源。

圖2 有機氮源種類對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.1.3 硫酸銨添加量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖3 可見，隨著硫酸銨添加量的提高，發酵所產的角蛋白酶酶活逐漸增加，當硫酸銨添加量為10 g/L時，角蛋白酶產酶量最大。 當硫酸銨添加量進一步增大至12.5 g/L，角蛋白酶的酶活出現明顯下降。因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發酵產角蛋白酶的最佳硫酸銨添加量為10 g/L。

圖3 硫酸銨添加量對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.1.4 金屬離子對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖4 可見，當培養基添加氯化錳時，發酵所產的角蛋白酶酶活最高。 根據不同金屬離子的酶活力差異性分析，對其大小進行排序為Mn2+＞K+＞Fe3+＞Zn2+＞Cu2+，而添加硫酸銅則會對菌株產酶有抑制作用。 金屬離子一般作為輔酶成分或充當輔酶功能（丁莉莉，2017），添加氯化錳顯著提高了重組枯草芽孢桿菌WB600 發酵產角蛋白酶的酶活，但是額外添加硫酸鋅會抑制角蛋白酶產酶， 這與Arokiyaraj 等（2019）的報道相似。

圖4 金屬離子對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.2 發酵條件優化結果

2.2.1 接種量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 圖5 表明，接種量為2% ～6%時，菌株所產的角蛋白酶與接種量呈正相關， 繼續增大接種量則導致角蛋白酶產量明顯下降。 當接種量為6%時，重組角蛋白酶的酶活達到最大值。 接種量太少，細胞生長延滯，酶的合成受到影響；而接種量過高時，前期細胞生長迅速，營養物質消耗過快，后期供需不足從而會影響酶的合成（Lu 等，2020）。因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發酵產角蛋白酶的最佳接種量確定為6%。

圖5 接種量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.2.2 裝液量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖6 可知，在發酵培養基裝液量為45 mL/250 mL 時，重組角蛋白酶的酶活達到最高值。裝液量會影響到搖瓶發酵的供氧狀況， 在重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發酵產角蛋白酶的過程中， 隨著裝液量不斷增大，通氣和溶氧隨之減小，從而導致角蛋白酶的合成因氧供應不足而受到抑制。

圖6 裝液量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.2.3 發酵時間對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖7 可見， 隨著發酵時間的延長， 重組枯草芽孢桿菌WB600 所產角蛋白酶的酶活先升高而后降低，在第36 h 時所產酶活最高。 發酵時間過長，由于發酵液中營養物質耗竭，導致菌體產生自溶并且累積有害代謝產物，反而使得角蛋白酶酶活有所下降。

圖7 發酵時間對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.2.4 發酵溫度對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖8 可知，溫度在37 ℃以下時，隨溫度上升酶活逐漸提高，在37 ℃時酶活達到最大。 但是當溫度繼續升高時，由于超過了重組枯草芽孢桿菌WB600 的最適生長溫度，菌株生長代謝受阻，導致角蛋白酶的酶活力迅速下降。 因此， 重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發酵產角蛋白酶的最適溫度為37 ℃。

圖8 發酵溫度對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.2.5 初始pH 對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖9 可知，pH 從6 ～8 的過程中，酶活隨著pH 的升高而逐漸增大，pH 繼續升高， 菌株產酶活力有所下降。 在pH 8 時，菌株產酶量達到最高酶活。 大多數細菌產角蛋白酶的最適pH 在中性或者略偏堿性，這與之前報道的Pseudomonas sp.LM19 在pH 8 時產酶最高相似（Mohamad 等，2017）。

圖9 初始pH 對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.2.6 搖床轉速對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響 由圖10 可知，在搖床轉速為140 ～200 r/min 時，重組枯草芽孢桿菌WB600 產酶酶活隨著搖床轉速的提高而增大。 在200 r/min 的搖床轉速下，角蛋白酶的酶活達到最高，繼續加大轉速至220 r/min，酶活反而有所下降。在發酵過程中，轉速會影響物質和溶解氧的交換， 在轉速為140 ～200 r/min 時，轉速不斷增大使發酵溶氧和物質交換增加， 菌株產酶能力增強；當轉速增大至220 r/min 后，剪切力也隨轉速的增加而增大， 制約了菌株生長和產酶（劉婕，2013）。 因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 搖瓶發酵產角蛋白酶的最佳轉速為200 r/min。

圖10 搖床轉速對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產角蛋白酶的影響

2.3 發酵培養基的二次通用旋轉正交組合優化與驗證 重組枯草芽孢桿菌WB600 發酵培養基中葡萄糖：蔗糖（X1）、酵母浸膏（X2）、硫酸銨（X3）、MnCl2（X4）等組分的二次通用旋轉組合設計試驗及其結果如表2 所示，方差分析結果如表3 所示。

表2 二次通用旋轉組合設計試驗方案及結果

表3 試驗結果方差分析表

根據表2 所示的試驗結果， 以角蛋白酶活為響應值進行多元回歸擬合， 得到回歸方程：Y=1392.51+73.42X1-124.81X2+86.59X3+100.92X4-141X12+12.21X22+115.80X32+12.15X42+203.96X1X2-174.46X1X3-36.63X1X4。

回歸方程中Y 表示角蛋白酶活（U/mL），X1、X2、X3、X4分別表示葡萄糖：蔗糖、酵母浸膏、硫酸銨、MnCl2在培養基中的濃度（g/L）。

根據試驗結果進行方差分析可知， 回歸方程失擬性檢驗F1=3.20＜F0.05（5，3）=5.41，差異不顯著，而顯著性檢驗F2=14.74＞F0.05（11，8）=2.95，回歸方程顯著。 這說明該模型擬合度較好； 在α=0.10 顯著水平剔除不顯著項后， 簡化后的回歸方程為：Y=1392.51+73.42X1-124.81X2+86.59X3+100.92X4-141X12+115.80X32+203.96X1X2-174.46X1X3。

2.4 數學模型的應用分析

2.4.1 單因素分析 根據表4 和圖11 對單因子試驗分析，碳源對酶活的影響最大，其次為硫酸銨添加量、酵母浸膏，氯化錳添加量影響最小。 隨著葡萄糖和蔗糖復配添加量的增加， 酶活呈現先增加后下降的趨勢。

圖11 各單因子與角蛋白酶酶活關系圖

表4 單因子效應分析

2.4.2 產酶優化與驗證 根據上述分析，在95%置信區間的優化方案為： 葡萄糖24.95 ～26.15 g/L，蔗糖24.95 ～26.15 g/L， 酵母浸膏18.3 ～20.35 g/L，硫酸銨9.78 ～10.53 g/L， 氯化錳0.05 ～0.06 g/L（表5）。 考慮到實際操作及試劑成本的情況下，將優化方案定為葡萄糖25 g/L，蔗糖25 g/L，酵母浸膏20 g/L，氯化錳0.05 g/L。 對此方案進行試驗驗證，得到酶活為（2110.33±15.011）U/mL，較優化前提高了5.10 倍。

表5 各變量取值頻率分布

3 結論

本研究對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 搖瓶發酵產角蛋白酶的培養基組分和發酵條件進行了優化。 在優化的發酵培養基配方（葡萄糖25 g/L，蔗糖25 g/L，酵母浸膏20 g/L，硫酸銨10 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，氯化鈣0.025 g/L， 硫酸鎂0.025 g/L， 硫酸亞鐵0.015 g/L，氯化錳0.05 g/L）和發酵條件（培養基初始pH 8， 裝液量45 mL/250 mL 三角瓶， 接種量6%，培養溫度37 ℃，搖床轉速200 r/min，發酵周期36 h）下，重組枯草芽孢桿菌WB600 所產的角蛋白酶活性達到（2110.33±15.011）U/mL，較優化前提高了5.10 倍。 本研究通過培養基組分和發酵條件的優化，提高了重組枯草芽孢桿菌WB600 發酵產角蛋白酶的酶活， 為該酶后續應用于角蛋白資源的高值化利用提供了一定的理論依據和研究基礎。