慢性冷熱應激對繁殖母牛血清指標的影響

施 安， 王建東 ， 侯鵬霞， 陳志龍， 孫文陽， 梁小軍， 王瑞剛， 姜 武

（1.寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏農林科學院固原分院，寧夏固原 756099；3.寧夏犇旺生態農業有限公司，寧夏永寧 750100）

寧夏屬典型的溫帶大陸性氣候， 冬夏兩季氣候迥異， 冬季嚴寒夏季酷暑， 冬夏溫差最高可達32 ℃左右，秋冬交節之際，晝夜溫差可達17 ℃左右（姜鑫等，2021）。寧夏冬夏交替的氣候特征容易引發反芻動物的慢性冷熱應激癥， 較大的溫差導致機體長時間處于高溫或低溫環境， 機體已經暫時適應環境之后的冷熱應激狀態（Cui 等，2016），尤其是繁殖母牛受到冷熱應激所產生的一系列非特異性反應使母牛產生應激綜合征， 從而導致繁殖功能障礙等 （Hagiya 等，2017；Wheelock 等，2010）。受冷熱應激的自適應代謝損失給肉牛養殖帶來巨大的經濟損失， 是潛在的風險管控重點。通常將溫濕指數（THI）作為評價動物冷熱應激狀態的重要參考指標，THI 不同的閾值范圍代表冷熱應激程度， 其中38≤THI≤72 為舒適區間，72≤THI≤78 為輕度熱應激，78≤THI≤89 為中度熱應激，THI ＞89 為重度熱應激；25≤THI≤38為輕度冷應激，8≤THI≤25 為中度冷應激，THI ＜8 為重度冷應激。 目前關于寧夏地區反芻動物冷熱應激研究多集中在奶牛方面， 鮮有繁殖母牛冷熱應激的相關研究。 因此本試驗以寧夏地區規模化肉牛養殖場的全年THI 監測數據為參考依據，研究慢性冷熱應激對繁殖母牛的生理生化以及繁殖激素的動態調節規律， 篩選出判別冷熱應激的關鍵指示物， 為集約化條件下母牛生產環境的精準控制提供理論和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集 試驗在寧夏銀川市犇旺生態養殖公司進行， 采用單因素水平試驗設計，選擇體重[（680±58）kg]和胎次[（1 ～3）胎]相近的繁殖母牛10 頭為試驗動物， 參考肉牛飼養標準 （NY/T 815-2004） 保證試驗組的全混合日糧（TMR）營養水平一致，自由采食和飲水，試驗設對照組（秋季）、冷應激組（冬季）和熱應激組（夏季）3個階段進行。

1.2 試驗設計 選擇肉牛場生產區的西邊和東邊為測定點， 距地面1.8 m 窗臺處放置溫濕儀GPS-600（浙江精創科技有限公司），選取放置點有效通風，防止陽光直接照射和雨淋，并避免母牛觸及。 每3 h 自動記錄溫度和濕度， 計算THI。THI=0.8×AT（溫度）+[RH（濕度）×（AT-14.4）]+46.4（McDowell 等，1976）。

1.3 指標測定 參照牛場THI 動態監測結果，分別把秋季、冬季和夏季的極端THI 數值依次作為對照組、冷應激組和熱應激組的對應采樣時間，從尾根部采集血樣并分離血清保存。

1.3.1 血清生化指標 用比色法試劑盒（中生北控股份有限公司） 測定總蛋白 （TP）、 白蛋白（ALB、）球蛋白（GLB）、尿素氮（BUN）、葡萄糖（GLU）和甘油三酯（TG）。

1.3.2 血清免疫指標 用比色法試劑盒（中生北控股份有限公司）測定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）；酶免法（北京華英生物技術公司）測定白細胞介素-2（IL-2）白細胞介素-4（IL-4）。

1.3.3 抗氧化能力指標 用酶免法（北京華英生物技術公司）測定總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）。

1.3.4 繁殖相關激素指標 用放免法測定雌二醇（E2）、孕酮（P）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）。

1.4 統計分析 所有數據均采用Excel 軟件進行處理， 使用SPSS 軟件進行ANOVA 方差分析和Duncan 多重比較。

2 結果與分析

2.1 全年THI 指數測定結果 根據THI 指數全年監測結果發現（圖1），牛場在夏季六、七、八月份屬于輕度熱應激（72≤THI≤78）；冬季一、二月份屬于輕度冷應激（25≤THI≤38），其余月份處于舒適區（38≤THI≤72）。 其中，一月份THI 指數最低，七月份THI 指數最高， 十月份最接近全年THI 平均值， 分別對應冷應激組 （THI=31.68）， 熱應激組（THI=75.22）和對照組（THI=53.78）3 個試驗期。

圖1 全年溫濕度指數THI 動態監測曲線圖

2.2 血清生化指標檢測結果 由表1 可知，冷應激組的各項生化指標最高，除TG 外，均呈現冷應激組＞對照組＞熱應激組的規律， 冷應激組的TP、ALB 和TG 相比熱應激組分別提高了79.28%（P ＜0.01）、62.63%（P ＜0.01）和516.67%（P ＜0.01），其中BUN 冷應激組比對照組提高了34.28%（P ＜0.01）； 對照組比熱應激組提高了159.63%（P ＜0.01），GLB 和GLU 差異不顯著（P ＞0.05）。

2.3 血清免疫指標測定結果 由表2 可知，IL-2熱應激組比對照組提高了15.75%（P ＜0.01）、對照組比冷應激組提高了34.20%（P ＜0.01）， 其他指標均呈現冷應激組＞對照組＞熱應激組的規律，其中IgG、IgM、IL-4 和IgA 冷應激組比熱應激組分別提高了50.40% （P ＜ 0.01）、36.52% （P ＜0.01）、21.36%（P ＜0.01）和19.48%（P ＜0.05）。

2.4 血清抗氧化指標測定 由表3 可知，冷應激組的MDA 比對照組和熱應激組分別降低了51.72%（P ＜0.01） 和47.34%（P ＜0.01），SOD、TAOC 和GSH-PX均呈現冷應激組＞對照組＞熱應激組的規律， 且冷應激組相比熱應激組分別提高了116.64% （P ＜ 0.01）、58.38% （P ＜ 0.01） 和38.33%（P ＜0.01）。

表3 血清抗氧化指標測定結果

2.5 血清內分泌激素測定 由表4 可知，冷應激組E2 比熱應激組提高了89.23%（P ＜0.01）；P 組間差異均極顯著，冷應激組比熱應激組提高了118.51%（P ＜0.01），熱應激組比對照組又提高了136.38%（P ＜0.01）；T3 和T4 各組間差異不顯著（P ＞0.05）。

表4 血清內分泌激素測定結果

3 討論

3.1 冷熱應激對生化指標的影響 動物生化水平是反映健康狀況和營養水平的重要指標（張建剛等，2012）， 動物在環境應激脅迫下發生免疫應答，通過糖、能量和蛋白質三大代謝物質再分配以維持機體內環境穩定 （Srikandakumar 等，2004）。在冷熱應激條件下， 由于動物采食量發生變化導致營養攝入不均直接影響生化指標的差異。 熱應激時，繁殖母牛營養攝入水平降低，免疫與代謝功能弱化，而總蛋白（TP）含量是免疫力和代謝水平（高艷霞等，2014） 的準確反映，TP 含量也因此降低， 其中ALB 和GLB 是組成總蛋白的2 個關鍵蛋白，前者調節細胞滲透壓后者參與免疫代謝，所以ALB 和GLB 含量也都呈現下降的趨勢。 而冷應激時這3 個指標隨著繁殖母牛采食量的升高而升高。 這就解釋了試驗中冷應激的TP、ALB 和GLB 極顯著或顯著高于熱應激組的變化趨勢（P ＜0.01）。 其次，繁殖母牛處于嚴重熱應激時，動物無法通過糖、脂肪代謝滿足能量需要，只能加速蛋白質分解代謝來維持機體穩態， 表現為TP 的降低。 尿素氮（BUN）含量可以反映繁殖母牛氨基酸平衡和蛋白質代謝狀態（趙拴平等，2012），當母牛需要分解蛋白質來維持能量需要時， 相應的BUN 含量降低，試驗中熱應激組極顯著低于對照組和冷應激組（P ＜0.01）也印證了這一結論。GLU含量是衡量肝臟功能的一個重要指標 （王蘭等，2007）， 試驗中不同應激條件下差異不顯著 （P ＞0.05），這與馬毅（2020）不同季節GLU 無顯著變化的研究結果一致， 但試驗組表現為冷應激組＞對照組＞熱應激組，說明當母牛營養攝入不足時，能量出現負平衡，糖代謝異常增加葡萄糖分解，表現為葡萄糖濃度降低（O’brien 等，2010）。 甘油三酯（TG）是血脂的主要成分，起到供給與儲存能源的作用 （馬毅等，2020）。 試驗中冷應激組的TG含量顯著高于對照組和熱應激組（P ＜0.05），說明母牛處于熱應激時， 不僅采食量下降攝入的脂肪類物質降低， 還會引起干物質分化受阻導致脂肪吸收率降低， 其次當體內營養偏低時會分解儲存的甘油三酯供能，因此甘油三酯含量便會下降（馮亞杰等，2016）。

3.2 冷熱應激對免疫指標的影響 免疫球蛋白是評估動物免疫狀況的重要指標， 主要包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM），其中IgA 是機體黏膜防御感染的主要物質，可以與周圍細胞組成局部免疫系統（高錦萍等，2006）；IgG 參與機體免疫防御反應，是血清免疫球蛋白的主要成分； IgM 是特異性免疫反應早期抗體（劉慶華，2009）。試驗中IgG 和IgM 在冷應激組的含量極顯著高于熱應激組（P ＜0.01），IgA顯著高于熱應激組（P ＜0.05），有研究表明熱應激可顯著降低奶牛血清中IgA、IgG、IgM 含量（Safa等，2019；Schmautz 等，2018）， 表明繁殖母牛在熱應激時， 高溫導致其機體的免疫組織和功能受到抑制，損害了體液免疫（彭孝坤等，2019；張燦等，2017）。但冷應激時IgG 和IgM 與對照組的差異不顯著（P ＞0.05），說明肉牛對環境溫度具有低溫適應性強但高溫耐受性差的特點 （湖南科技報，2020），所以低溫對繁殖母牛的免疫功能損傷遠低于高溫的影響，因此要重視“三伏天”對肉牛嚴重的應激反應。 白細胞介素-2（IL-2）能促進T 細胞增殖分化和活性，間接反映機體免疫應答水平（李倜宇，2018）；白細胞介素-4（IL-4）可誘導B 細胞成熟并刺激其產生免疫球蛋白， 主要以調節體液免疫為主（蔡明成，2014）。 試驗中IL-2 在熱應激組極顯著高于冷應激組， 而IL-4 極顯著變低。Sahin（2017）和Chance（1979）研究表明，熱應激能抑制牛的免疫調節水平，表現為IL-2 升高和IL-4 降低，本試驗結果與上述結果一致。

3.3 冷熱應激對抗氧化指標的影響 動物正常代謝過程中會產生自由基， 其氧化不飽和脂類形成丙二醛（MDA），對哺乳動物細胞有誘變作用，MDA 含量越多對細胞膜的侵蝕作用也越大。而酶促體系就是機體主要的抗氧化防疫機制， 包括SOD、T-AOC 和GSH-Px（陳雯雯等，2012a；崔恒敏等，2003） 。 當動物遭受應激時，酶促體系的抗氧化水平被打破， 此時機體需要大量的抗氧化酶來消除自由基， 表現為SOD、T-AOC 和GSH-Px的活性數量變多，抑制MDA 升高。 試驗中冷應激組SOD、T-AOC 和GSH-Px 極顯著高于熱應激組（P ＜0.01），而MDA 反之降低（P ＜0.01）。 胡煜等（2016）發現熱應激時肉牛SOD、T-AOC 和GSHPx 有不同程度降低，而MDA 升高；同時肉牛在冷應激時有相反的變化趨勢（么蕊，2021），本試驗結果與其一致。 由于熱應激導致動物體內氧循環代謝紊亂進而誘導自由基激增， 抗氧化酶系統平衡因此被打破， 應激狀態下消耗的抗氧化酶多于新生成的，導致MDA 含量同樣顯著升高，試驗中冷應激組的MDA 極顯著低于熱應激組， 表明繁殖母牛在冷應激中的抗氧化性較好， 熱應激對自身造成了一定的氧化損傷，鄧發清（2008）和陳雯雯（2012）對奶牛的報道中也證明了上述觀點，進一步證實了肉牛耐寒不耐熱的特性。

3.4 冷熱應激對內分泌激素的影響 三碘甲狀腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4）同屬甲狀腺素成員， 對動物的體溫調節起著重要作用。 本試驗中T3 和T4 在不同應激狀態下的差異不顯著 （P ＞0.05），但3 個試驗組均表現為熱應激組＞對照組＞冷應激組，說明熱應激使下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT）受阻，導致促甲狀腺激素（TSH）合成減少，甲狀腺功能減退，T3 和T4 合成量減少，動物自適應調節體溫以減緩熱應激刺激。 冷應激則激活下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸，TSH 合成增加，促進T3 和T4 分泌，提高肝糖原合成，促進動物產熱提高對低溫天氣適應性（白丹丹，2017）。這與朱建營（2016）的研究結果也一致。 雌二醇（E2）主要由卵巢的卵泡細胞所分泌，生物活性最強，也是雌激素的重要參考指標（楊瑩等，2017）。 孕酮（P）是動物自身調節的雌性激素，其主要由卵巢分泌，與雌二醇激素公共維持雌性動物的生殖周期， 促使乳腺發育成熟的作用（龍鳳宜等，2006）。本試驗中冷應激組的E2 和P 均極顯著高于對照組和熱應激組（P ＜0.01）， 說明高溫抑制了下丘腦-垂體-性腺軸的反應，使垂體促性腺激素（FSH、LH）的分泌受到抑制， 同時使雌激素的分泌下降并抑制雌二醇的生成和孕酮的分泌。 而在低溫環境下機體自適應調節促進了性腺軸的分泌代謝，E2 和P 激素也隨之升高。

通過對極端環境條件下繁殖母牛的生化、免疫、抗氧化和激素指標監測，結果分析發現4 種生理生化參數中BUN、IL-2、GSH-Px 和P 指標在正常組、冷應激組和熱應激組之間均差異極顯著（P ＜0.01），且與對照組相比，冷應激組和熱應激組相差最多的是P，分別為416.52%和136.38%，說明孕酮對冷熱環境的變化最敏感， 可作為判別繁殖母牛冷熱應激反應的潛在指示物， 用于早期監測母牛的應激程度， 降低冷熱應激對繁殖性能造成的不利影響。

4 結論

冷熱應激均能影響母牛的營養代謝和繁殖性能，熱應激對母牛生理生化參數的影響更大，而孕酮可作為判別繁殖母牛冷熱應激反應指示物，用于早期監測母牛的應激程度。