飼料添加劑對體外瘤胃發酵和甲烷產生量的交互影響

包烏日漢， 杜 莎， 王鵬宇， 姚軍虎， 齊景偉， 徐 明，

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 014010；2.內蒙古優然牧業有限責任公司，內蒙古呼和浩特 015200；3.西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

反芻動物瘤胃產生的甲烷， 既造成了能量損失， 也是溫室氣體的主要來源之一 （王小晶，2009）。 據統計，全球反芻動物的甲烷年排放量達8000 萬t， 占到全球人類活動釋放甲烷量的28%（陳曉維，2009）。 Wu 等（2022）發現，通過調節瘤胃能量供應量、 提供優質粗飼料和降低原蟲數量可降低甲烷排放量。根據抑制甲烷機制不同，甲烷抑制劑可以分為三類：氫受體類、微生物調節類和酶抑制劑。 Wu 等（2022）報道，三類甲烷抑制劑之間對體外甲烷產生量之間沒有交互影響。 本試驗選擇典型的氫受體類和微生物調節類代表延胡索酸、 莫能菌素， 兼氫受體類和微生物調節類亞麻油， 進一步研究氫受體類和微生物調節類之間及內部對體外發酵和甲烷生成的交互影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 莫能菌素由山東勝利股份有限公司（山東生濟南市）提供，商品名為莫能菌素預混合劑，包含20%莫能菌素，添加到發酵底物中，莫能菌素有效添加量分別為0、120 mg/kg DM。 延胡索酸為純酸（F8509-100 G），從SIGMA-ALDRICH （St.Louis，MO，USA） 購買， 發酵時直接添加到發酵液中，添加量分別為0、6.9 mmol。 亞麻油從上海麥克林公司（上海）購買，含量＞99%，發酵時直接添加到發酵液中，添加量為0、3.1 mmol。

本研究包括兩個體外發酵試驗。 試驗1 研究莫能菌素和延胡索酸的交互作用，共4 個處理組，每個處理組6 個重復。試驗2 研究莫能菌素、延胡索酸和亞麻油的交互影響，共8 個處理組，每個處理組8 個重復。

1.2 瘤胃液 瘤胃液從3 只成年山羊瘤胃獲得。供體山羊的飼料總量為2.4 kg DM， 在08：00 和20：00 分為兩次飼喂。 飼料中含有50%精料和50%苜蓿干草。 精料中含有70%玉米粉、25%豆粕和5%預混料，預混料中不包含任何甲烷抑制劑。

在晨飼前采集3 只瘤胃瘺管山羊的瘤胃內容物，移到二氧化碳保溫盒中，然后立即運送到實驗室（在5 min 內）。 將3 只供體山羊的瘤胃內容物混合（1∶1∶1），然后用攪拌機（Fisher14-509-1）在二氧化碳下混合20 s， 將雜質從飼料顆粒中分離出來。 將混合后的樣品通過四層紗布和玻璃棉進行過濾，作為瘤胃液進行后續發酵。

1.3 體外發酵 發酵瓶容積為260 mL， 每個瓶內加入600 mg 飼料。 將這些瘤胃緩沖液（1100 mL）和瘤胃液（200 mL）在二氧化碳環境下混合加熱，然后把50 mL 加入到發酵容器中， 通入二氧化碳，在39 ℃下發酵24 h。

1.4 樣品的采集和分析 發酵24 h 之后， 用冰塊冷卻發酵瓶，待氣體溫度接近室內溫度時，用玻璃針管連接針頭測定氣體產生量，取10 mL 氣體樣品貯存在無抗凝劑的真空采血管中。 將氣體樣品用采樣注射器轉移到真空試管中， 然后用氣相色譜儀分析甲烷含量。 使用pH 儀對發酵底物進行pH 分析，取1.5 mL 的發酵底物，加入0.3 mL 的偏磷酸溶液（250 g/L），離心15 min（39000 ×g，4 ℃）。取1 mL 的上清液，用氣相色譜法分析總揮發性脂肪酸（VFA）組成（乙酸、丁酸、丙酸、戊酸、異丁酸和異戊酸）及含量。

1.5 甲烷產生量的預測 根據Castro 等（2011）推薦公式， 依據發酵液中乙酸、 丙酸和丁酸濃度（mmol/mol VFA），計算甲烷產生量預測值：

甲烷產生量預測值/（mmol/mol VFA） =0.45×乙酸+ 0.4×丁酸-0.275 ×丙酸；

甲烷實際產生量/（mmol/mol VFA）=甲烷產生量（mL）/22.4 /（VFA×50 mL/1000）。

1.6 統計分析 數據采用多因素完全隨機試驗設計進行分析， 選用SPSS 13.0 的GLM 模型，試驗因素包括莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油的主效應和兩者之間及三者之間的交互作用。 極顯著水平為P ≤0.01，顯著水平為P ≤0.05，趨于顯著為0.05 ＜P ≤0.10。

2 結果

2.1 莫能菌素和延胡索酸的交互影響 由表1可知， 莫能菌素不影響產氣量和發酵液pH （P ＞0.05），可顯著降低甲烷產量、甲烷在氣體中含量及乙酸產量（P ＜0.05），甲烷產量降低了11.1%、甲烷含量降低了11.6%及乙酸產量降低了6.1%；延胡索酸增加了產氣量和丙酸比例（P ＜0.05），降低了甲烷產量和含量（P ＜0.05），甲烷產量降低了11.4%，甲烷含量降低了22.0%，不影響發酵pH和VFA 產量（P ＞0.05）。 莫能菌素和延胡索酸對發酵液pH、甲烷產量和含量、產氣量及VFA 組成等方面均沒有交互影響（P ＞0.05）。

表1 莫能菌素和延胡索酸對日糧體外產氣和發酵的影響

2.2 莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油的交互影響由表2 可知， 莫能菌素能顯著降低產氣量和甲烷產量及含量，降低幅度分別為5.7%和15.9%（P ＜0.05），增加發酵液pH（P ＜0.05），降低丁酸和戊酸含量（P ＜0.05）。延胡索酸能降低發酵pH、甲烷產量和含量 （P ＜0.05）， 增加產氣量和丙酸比例（P ＜0.05），甲烷產量降低11.0%，趨于降低乙酸比例（P =0.06），顯著影響VFA 中的丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸組成及乙丙比（P ＜0.05）。亞麻油能顯著降低甲烷產量， 降低幅度為8.1%（P ＜0.05），趨于降低甲烷含量（P = 0.07），顯著提高產氣量 （P ＜0.05）， 不影響VFA 產量及組成 （P ＞0.05）。 莫能菌素、延胡索酸和亞麻油對發酵pH、甲烷產量和含量、 總產氣量及VFA 組成等方面均沒有兩向（P ＞0.05）和三向（P ＞0.05）的交互影響。

表2 莫能菌素、延胡索酸和亞麻油對飼料體發酵外和甲烷產生的影響

3 討論

反芻動物甲烷排放不僅造成飼料能量損失，還會導致全球氣候變暖。 甲烷是瘤胃碳水化合物發酵過程中不可避免的產物， 通過將甲烷轉化為丙酸可降低甲烷的產生（王麗鳳，2004）。不同甲烷抑制劑均能顯著減少甲烷排放量， 對溫室氣體減排和提高經濟、社會效益都將具有深遠意義（陳銳等，2022）。本試驗利用體外發酵方法，檢測莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油對降低體外甲烷產生量的交互作用，為實踐應用提供依據。

莫能菌素是典型的微生物調節類的甲烷抑制劑。研究表明，莫能菌素作為飼料添加劑能降低甲烷能量損失、乙丙比例、瘤胃液pH 變異程度（楊華明等，2016）， 主要是莫能菌素可抑制瘤胃內革蘭氏陽性菌生長，從而抑制甲烷的產生，改善飼料轉化率（朱俊紅等，2022；韓金濤，2014）。 Kim 等（2014）研究表明，莫能菌素抑制了纖維分解菌、甲酸脫氫酶活性，同時增強了分解淀粉的能力，減少了生產甲烷所需的氫。 在本研究中莫能菌素降低了甲烷生成和乙丙比例， 這與之前的研究結果一致（Wischer 等，2013；Ponce 等，2012）。

王榮（2019）等選用玉米和菊苣作為體外發酵底物，研究發現，延胡索酸有抑制甲烷生成的作用， 且延胡索酸和底物對氫含量和甲烷產量不存在交互影響，劉南南（2014）也得到同樣的結論。 延胡索酸作為丙酸生成的中間體，它的添加可增加瘤胃丙酸產量。 經動物試驗驗證，添加延胡索酸可使甲烷釋放量減少約20%（李琳等，2010；Asanuma 等，1999）。本研究顯示，延胡索酸增加了體外發酵產氣量和丙酸比例， 降低了甲烷產量， 這與之前的報道一致 （Hook 等，2010；Newbold 等，2005）。

多不飽和脂肪酸可作為氫受體來降低甲烷的生成， 同時可抑制甲烷生成相關菌（原蟲和甲烷菌）。 本試驗選用的亞麻油，是兼具氫受體和微生物調節功能的甲烷抑制劑。 張春梅（2010）研究顯示， 亞麻油可顯著提高總揮發性脂肪酸和丙酸含量，降低甲烷產生量。 譚健（2021）研究顯示，亞麻油中不飽和脂肪酸會通過生物氫化作用促進氫的利用，進而減少氫濃度，以減少甲烷生成。 本研究結果顯示，亞麻油顯著降低了甲烷產量，與前人研究結果一致（譚健等，2021；張春梅等，2010）。

盡管甲烷抑制劑在反芻動物飼料中被廣泛使用， 但以往的研究較少討論多種甲烷抑制劑之間的交互影響。一篇早期的研究報道，莫能菌素和延胡索酸聯合發酵時， 莫能菌素和延胡索酸對甲烷產量、產氣量、VFA 等均沒有交互影響（Callaway，1996）。 進一步研究發現，氫分壓是瘤胃產生丙酸和甲烷的標志指標， 延胡索酸和莫能菌素在促進瘤胃丙酸生成方面具有較好的協同效應， 具有一定的可加性 （李宗軍，2018；Castro-Montoya 等，2012；McGinn 等，2004）。也有研究顯示，莫能菌素和延胡索酸對體外甲烷產生量之間沒有交互影響（Wu 等，2022）。 本研究中觀察到，跟單獨使用莫能菌素或延胡索酸相比， 同時添加莫能菌素和延胡索酸對甲烷的抑制作用更大， 這兩種添加劑通過兩種機制相互獨立地降低甲烷產生， 這與前人研究報道一致。 Wu 等（2022）報道，三種甲烷抑制劑莫能菌素、 延胡索酸和溴化甲烷對體外甲烷產生量之間沒有交互影響。本研究結果顯示，三種甲烷抑制劑莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油之間對體外甲烷抑制也不存在交互影響， 與Wu 等（2022）報道一致。

根據這兩個試驗結果，基于乙酸、丁酸和丙酸產量對甲烷產量進行預測 （Castillo 等，2011），再將預測產量和實際甲烷產量之間進行回歸分析，見圖1。 結果顯示，實測甲烷產量與預測甲烷產量之間存在顯著相關性。表明延胡索酸、莫能菌素和亞麻油這三種甲烷抑制劑對甲烷生成的抑制作用均是通過改變乙酸、丙酸和丁酸比例來實現的。莫能菌素通過抑制革蘭氏陽性細菌和原生動物降低乙酸并增加丙酸產量 （Kumar 等，2013；Ellis 等，2012；Hook 等，2010）； 延胡索酸與產甲烷菌競爭利用代謝氫， 從而直接降低乙酸產量并增加丙酸產量 （Hook 等，2010；Li 等，2009；Castillo 等，2004）。本文在Wu 等（2022）的試驗基礎上增加了亞麻籽油，其主要含有十八碳不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸可以作為電子受體與甲烷菌競爭氫，通過加氫的順-反異構化反應生成飽和脂肪酸，從而減少甲烷生成（王澤富等，2022；Dewanckele 等，2020）。 但溴化甲烷并不是通過改變VFA 譜的機制來實現的（Wu 等，2022）。 綜合上述結果，氫受體類和微生物調節類甲烷抑制劑均是最終通過改變VFA 譜的機制來降低甲烷的，而酶抑制劑類甲烷抑制劑直接抑制甲烷生成酶，不通過VFA 譜這條途徑。

圖1 甲烷產量預測值和實測值之間的線性回歸

4 結論

綜合兩個試驗，延胡索酸、莫能菌素或亞麻油均可有效降低體外甲烷產生量，且三種添加劑沒有兩向和三向交互作用。這三種甲烷抑制劑對甲烷生成的抑制作用在一定范圍內具有可加性。