青稞酸性磷酸酶基因 HvnACP2克隆和亞細胞定位研究

安立昆,任晴雯,姚曉華,姚有華,吳昆侖

(1.青海大學 農林科學院,西寧 810016;2.青海省青稞遺傳育種重點實驗室,西寧 810016;3.國家麥類改良中心青海青稞分中心,西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)是大麥的變種,由于其穎殼與籽粒分離,也稱為裸大麥。青稞籽粒富含纖維素、蛋白質、維生素、β-葡聚糖,是重要的糧食、飼料和食品加工原料,青稞是最具有青藏高原地區特色的作物之一[1-4]。青藏高原地區氣候極為惡劣,尤其是土壤極為貧瘠,長期的進化和篩選使得青稞對貧瘠的土壤具有較強的適應性[5-6]。隨著青稞新品種的不斷推廣,種植面積逐年增大,已成為青海省農業獨具地方特色的作物,在青海省農業經濟中占有重要地位[7-9]。

磷是植物三大營養素之一,其重要性僅次于氮元素,磷元素的缺乏對作物的產量和品質有著嚴重的影響。農業生產中的磷肥主要源于磷礦開采,作為不可再生資源全球磷礦儲量都在不斷下降,尤其在中國由于農業生產中磷肥的利用效率不高,施入土壤中的磷不能得到有效利用,流失后反而對生態環境造成影響[10]。在土壤中大部分有效磷會被土壤吸附和固定,極難溶解和轉移,即使磷含量較高的土壤中也只有少量磷元素可被植物吸收和利用,在土壤中植物對磷的利用效率遠低于其他元素[11-13]。青藏高原地區是青稞的主產區,土壤極為貧瘠,生態極為脆弱,過量施用磷肥會導致更嚴重的生態災難,不利于青藏高原地區農業的可持續發展。所以研究青稞磷吸收和利用相關基因,提高其對土壤中的磷利用率對于減少青稞生產中的磷肥施用,促進青稞生產的可持續發展具有重要意義。

酸性磷酸酶(Acid Phospoatase,ACP)是植物體中廣泛存在的一種水解酶,可以水解磷酸酯并釋放出磷酸,在低磷條件下植物體內尤其是根系會分泌大量酸性磷酸酶促進有機磷的水解,在植物磷吸收和利用方面有著重要作用[13-14]。酸性磷酸酶基因屬于一類高度保守的基因家族,不同家族成員通過不同的表達模式調控在植物體中發揮作用,維持植物體中磷元素的吸收和利用[15]。Zhang等[16]采用全基因組關聯GWAS鑒定到了一個大豆磷高效利用基因GmACP1,在大豆中過表達GmACP1基因可以明顯提高大豆對磷的利用效率,并認為GmACP1P基因為通過分子育種手段準確培育磷高效利用大豆品種提供了基礎。李靖怡[17]對水稻OsACP1進行研究發現OsACP1在水稻中只受低磷的誘導表達,在水稻中過表達OsACP1會使正常生長條件下的水稻出現磷中毒癥狀,在缺磷培養條件下恢復正常,OsACP1定位在內質網和高爾基體膜上,認為OsACP1的功能可能是在內質網和高爾基體膜中代謝磷酸乙醇胺和磷酸膽堿等有機磷,維持缺磷條件下細胞中的磷穩態。

目前關于酸性磷酸酶的研究主要集中在水稻、玉米、小麥、大豆等主要作物中,關于青稞中酸性磷酸酶基因尚未見研究報道。本試驗從青稞‘肚里黃’中克隆得到酸性磷酸酶基因HvnACP1對其基因和蛋白進行生物信息學分析,并對其亞細胞定位進行研究。為青稞磷高效利用相關基因研究和利用分子育種手段進行磷高效利用品種培育提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青稞品種‘肚里黃’和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)由青海省青稞遺傳育種重點實驗室保存,青稞和煙草于2021年4月種植于青海大學農林科學院實驗溫室中。摘取生長10 d后青稞的第3葉片進行DNA和RNA提取。采用生長1月后的煙草第3或第4葉片進行試驗。

PCR及其產物連接、cDNA合成、大腸桿菌感受態細胞分別采用北京全式金有限公司的TransTaq○RDNA Polymerase High Fidelity(AP131-01)試劑盒,pEASY○R-Blunt Cloning Kit(CB101-01)試劑盒,TransScript○RFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AT301-02)試劑盒以及Trans1-T1大腸桿菌感受態細胞。BP和LR反應試劑盒購自Invitrogen公司。引物合成和測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞DNA、RNA提取和cDNA合成 采用尿素法[18-19]提取青稞葉片DNA,TRIzol法提取RNA。cDNA合成參照TransScript○RFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AT301-02)試劑盒說明完成,所有樣品置于-20 ℃保存。

1.2.2HvnACP2基因和啟動子區域序列克隆 將已報道的谷子酸性磷酸酶基因SiACP序列輸入NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行搜索獲得大麥的HvACP基因序列和結構信息[14]。根據大麥HvACP2基因序列及起始密碼子ATG前2 000 bp左右序列設計引物。基因克隆正向引物:F:5′-ATGGAGGTGCTCGCGG-3′,反向引物:R:5′-CTAGTTGGTGTGGGTT-3′。啟動子區域序列克隆正向引物:F:5′-ATGTAATGTTGTAGTTTATTGC-3′反向引物:R:5′-GGCGTGCGCCGCTAGGAG-3′。采用PCR以cDNA為模板克隆HvnACP2cDNA序列,以基因組DNA為模板克隆HvnACP2啟動子區域序列。按以下程序進行擴增:94 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s, 58 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min(擴增啟動子區域序列為2 min),35個循環。反應完畢后對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,確定PCR產物片段大小無誤后,參照pEASY-Blunt Cloning試劑盒說明書,將PCR產物進行連接并轉化大腸桿菌,篩選陽性克隆并送測序。獲得cDNA序列后采用DNAMAN7對cDNA序列中的ORF區域進行翻譯獲得HvnACP蛋白 序列。

1.2.3 青稞HvnACP2生物信息學分析 采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子區域元件進行預測;采用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)對蛋白理化性質進行預測分析;采用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白跨膜結構進行預測分析;采用kinasephos2(http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw/)對蛋白磷酸化位點進行預測分析;采用SignalP(http://www. Cbs. Dtu. Dk /services /SignalP/)對蛋白信號肽進行預測分析;采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對蛋白二級結構進行分析;采用蛋白同源建模軟件Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白三級結構同源建模。

在植物基因組數據庫Gramene(http://www.gramene.org/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進一步搜索得到其他植物的同源蛋白序列:象草(Cenchruspurpureus)CpACP2、狗尾草(Setariaviridis)SvACP2、黍(Setariaviridisvar.hallii)PhACP2、糜子(Panicummiliaceum)PmACP2、福尼奧小米(Digitariaexilis)DeACP2、南荻(Miscanthus lutarioriparius)MlACP2、玉米(ZeamaysL.)ZmACP2、康藏嵩草(Carexlittledalei)ClACP2、番茄(Solanumlycopersicum)SlACP2、藍星睡蓮(Nymphaeacolorata)NcACP2、油菜(Brassicanapus)BnACP2、煙草(Nicotianaattenuata)MaACP2、粳稻(OryzasativaL.subsp. Japonica)OsACP2、秈稻(OryzasativaL.subsp. Indica)OsACP2、二型花(Dichantheliumoligosanthes)DoACP2、小米(Setariaitalica)SiACP2、彎葉畫眉草(Eragrostiscurvula)EcACP2、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdACP2、小麥(Triticumaestivum)TaACP2、野甘藍(Brassicaoleraceavar.oleracea)BoACP2、蘿卜(Raphanussativus)RsACP2、鹽芥(Eutremasalsugineum)、EsACP2、小菥蓂(Microthlaspierraticum)MeACP2、筷子芥(Arabisnemorensis)AnACP2、薺藍(Camelinasativa)CsACP2、薺菜(Capsellarubella)CrACP2。采用DNAMAN 7.0將青稞HvnACP2蛋白序列與大麥、水稻、二穗短柄草、煙草、番茄的同源蛋白進行序列比對,并根據NCBI中提供的相應蛋白信息分析結構域和關鍵位點。采用MEGA7對所有植物的同源蛋白序列以最大似然法構建系統進化樹。

1.2.4 亞細胞定位表達載體構建 采用載體pSATN1-mkate利用gatway技術構建亞細胞定位載體。設計帶有attB位點的引物對HvnACP2CDS序列進行PCR克隆,回收PCR產物后,按照BP和LR反應試劑盒說明書完成載體構建,并對載體進行測序驗證。將構建好的載體通過凍融法轉化入農桿菌EHA105中。制備好農桿菌重懸液后將菌液注射入煙草葉片下表皮,放入完全黑暗環境,溫度22 ℃,培養3 d后將葉片切成1 cm2大小,放置于Nikon C2-ER激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 青稞 HvnACP2基因生物信息分析

2.1.1 基因結構和啟動子功能元件預測分析 測序結果表明青稞HvnACP2和大麥HvnACP2基因和啟動子區域DNA序列完全一致。根據植物基因組數據庫Gramene中獲得的大麥HvACP2基因結構信息分析,青稞HvnACP2含有2個外顯子和1個內含子(圖1)。

圖1 青稞 HvnACP2基因結構Fig.1 Gene structure of HvnACP2

將克隆得到的HvACP2基因啟動子區域序列輸入啟動子元件分析網站PlantCARE中進行分析(表1)。發現HvnACP2啟動子區域具有大量的TATA-box和CAAT-box啟動子核心元件,3個脫落酸響應元件2個茉莉酸響應元件,此外還有1個分生組織表達順式作用元件,8個光響應元件,1個厭氧響應元件,2個MYB轉錄因子結合位點。

2.1.2 青稞HvnACP2蛋白理化性質和結構分析 通過生物信息學軟件預測分析發現 HvnACP2由454個氨基酸組成,為親水性穩定蛋白(表2)。HvnACP不具有跨膜結構(圖2),有絲氨酸(Ser)5個,蘇氨酸(Thr)2個,酪氨酸(Tyr)5個共12個磷酸化位點(圖3)。具有信號肽序列:MEVLAVLFLLAAHAASA,切割位點在第17至18位氨基酸之間(圖4)。HvnACP2二級結構蛋白結構α螺旋共85個、無規則卷曲共245個、延長鏈共107個,β轉角共17個分別占氨基酸總數的18.72%、53.96%、23.57%、3.74%,其三級結構和二級結構預測分析結果基本一致(圖5和圖6)。

表2 青稞HvnACP蛋白質理化性質分析Table 2 Physical and chemical properties of HvACP2 protein

圖2 青稞HvnACP2蛋白跨膜結構預測分析Fig.2 Transmembrane structure prediction of HvnACP2 protein

圖3 青稞HvnACP2蛋白磷酸化位點預測Fig.3 Prediction of HvnACP2 phosphorylation sites

圖4 青稞HvnACP2蛋白信號肽預測Fig.4 Prediction of HvnACP2 signal peptide

藍色.α螺旋;紅色.延伸鏈;橙色.無規則卷曲;綠色.β轉角

圖6 青稞 HvnACP2三級結構預測分析Fig.6 Tertiary structure prediction of HvnACP2

2.1.3 HvnACP2蛋白氨基酸序列對比和同源進化分析 蛋白序列分析發現大麥 HvACP2和HvnACP2蛋白序列完全一致,進一步與水稻、二穗短柄草、煙草、番茄的同源蛋白序列分析發現其都具有信號肽結構、紫色酸性磷酸酶結構域、金屬磷酸酶結構域和相同的金屬離子結合位點(圖7)。將青稞HvnACP2與28種植物的ACP2蛋白序列構建系統進化樹,發現大麥HvACP2和青稞HvnACP2與小麥TaACP2親緣關系最近(圖8)。

圖7 HvnACP2蛋白氨基酸序列對比分析Fig.7 Amino acid sequence alignment of HvnACP2 with homologous genes of other species

圖8 青稞HvnACP2與其他植物同源蛋白系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of HvnACP2 with other species

2.2 HvnACP2亞細胞定位研究

將帶有載體pSATN1- HvnACP2::mkate的農桿菌EHA105注射入煙草葉片中,對HvnACP2進行亞細胞定位研究發現紅色熒光信號分布于細胞膜上,說明HvnACP2定位于細胞膜上(圖9)。

a～d.分別為35::mkate空載體熒光場、葉綠體自發熒光場、明場和疊加場;e～h.分別為35:HvnACP2-mkate熒光場、葉綠體自發熒光場、明場和疊加場

3 結論與討論

酸性磷酸酶家族是植物利用磷元素重要的基因家族之一。酸性磷酸酶按功能可分為細胞內和分泌型的兩類。細胞內的酸性磷酸酶可以將衰老組織中的磷素進行再利用,分泌型的酸性磷酸酶可分泌到細胞外活化被土壤吸附的磷,將土壤中的有機磷轉化為無機磷,然后供植物體的利用,酸性磷酸酶對植物在應對低磷脅迫應答中具有重要的作用[20]。有一些研究報道酸性磷酸酶在調控植物碳代謝、細胞壁合成和抗病等方面有重要的作用[21]。

本研究克隆了酸性磷酸酶HvnACP2基因和啟動子區域序列,對其基因和蛋白進行生物信息學分析,并對其亞細胞定位進行研究。很多研究表明大部分植物酸性磷酸酶都具有信號肽結構,但不同的植物酸性磷酸酶亞細胞定位位置不同,有定位于細胞質、質膜、細胞壁甚至細胞外[22-26]。侯立江等[27]對西爾斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1進行分析也發現其具有信號肽結構,PAP1蛋白包含金屬離子結合中心,預測它屬于金屬蛋白,亞細胞定位預測分析其定位于質膜的概率最高。本研究發現青稞HvnACP2同樣具有信號肽、金屬磷酸酶結構域和金屬離子結合位點,并且定位于細胞質膜上。通過與其他物種的同源蛋白序列進行對比并構建系統進化樹發現其系統進化樹并沒有分為典型的單雙子葉兩支,與大麥和青稞親緣關系最近的是小麥TaACP2。趙雄偉等[14]對谷子酸性磷酸酶ACP家族基因進行鑒定并對其中的SiACP1耐低磷單倍型進行分析共發現了谷子中的13個ACP家族基因,生物信息學研究表明其蛋白都具有高度保守的磷酸酶結構域,谷子ACP家族基因與其他植物構建進化樹分析發現,單雙子葉植物ACP基因呈現明顯的分化,通過轉錄組數據分析發ACP基因家族中不同成員的表達模式各有差異,通過基因關聯和單倍型分析發現SiACP1啟動子上的一個SNP與耐低磷相關性狀顯著相關。李睿等[15]對蘋果紫色酸性磷酸酶相關基因MdPAP10進行克隆和研究發現MdPAP10基因包含5個外顯子和4個內含子,其蛋白具有信號肽并包含一個磷酸酶結構域,MdPAP10在蘋果根中表達量最高,葉片次之,果實中表達量最低,低磷培養條件下根中的MdPAP10受誘導表達明顯,葉片中的表達量沒有明顯變化,在蘋果愈傷組織中過表達MdPAP10可以提高其對低磷脅迫的耐受性,并且可以促進其他磷吸收利用基因MdPHT1.1、MdPT2和MdPHO1等相關基因表達。

青稞作為青藏高原地區的特有作物,減少青稞生產中的化肥施用是保障青藏高原地區農業生態和青稞產業可持續發展的關鍵之一。目前關于青稞中磷高效利用的基因研究報道極少。本研究克隆了青稞酸性磷酸酶HvnACP2基因,并進行了生物信息學分析和亞細胞定位研究,為青稞磷高效利用基因研究和分子育種提供了一定基礎。