新疆鹽堿土壤中克百威降解菌群結構解析及降解菌株特性

阿孜古力·庫爾班,王 潔,馬無為,謝 滔,張 偉

(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室,新疆特殊環境物種多樣性應用與調控重點實驗室,新疆師范大學校級重點學科生物學學科,新疆師范大學 生命科學學院,烏魯木齊 830054)

氨基甲酸酯類農藥是農業生產中應用最為廣泛的高毒性殺蟲劑[1],屬于膽堿酯酶抑制劑,也是一種內分泌干擾物[2]。目前氨基甲酸酯類農藥種類多達1 000種以上。對該類農藥的不合理使用,不但對生態環境造成破壞,藥物殘留還直接危害到人類的身體健康[3-4]。根據作用機制,氨基甲酸酯類農藥與有機磷農藥相似,會抑制動物或人體內乙酰膽堿酯酶活性使之不斷積蓄,從而產生毒性。若該農藥在體內長期累積還會致畸、致癌、致突變,甚至死亡[5-7]。克百威(Carbofuran)是最常用的氨基甲酸酯類農藥之一,在中性和偏酸性的環境中比較穩定,半衰期可長達10 a以上。目前該農藥已被禁用[8],但以克百威為代表的氨基甲酸酯類農藥長期大量的使用對土壤、地下水等造成的污染仍將長期存在。

新疆地區位于亞洲腹地,氣候干旱少雨,土壤pH達8.01以上,是中國受土壤鹽漬化危害最嚴重的地區,因此被稱為世界鹽漬化土壤的博物館[9]。同時,土地開發加大、土地利用方式的改變,使新疆鹽漬化土壤的類型、數量、分布等發生了新的變化,并引發了許多生態環境問題[10],導致土壤鹽漬化問題日益突出。阿克蘇地區是新疆土壤鹽漬化較為嚴重的地區之一,也是中國重要的優質商品棉生產基地。由于該地區獨特的氣候條件、地形特征、土壤類型等因素極易引起大面積鹽漬化發生[11-14],由此帶來土壤微生物多樣性的快速下降,土傳病蟲害明顯加重、土壤持續供給養分能力不足及產量明顯下降等嚴重后果。與此同時,農作物種類單一、棉花長期連作現象較為嚴重等因素帶來病蟲害持續加重[15]、土壤中農藥污染長期積累等生態問題[16-17]。因此,為控制土壤鹽漬化及連作導致的病蟲害大規模爆發,克百威等農藥被廣泛、大量、常年使用,各類農藥在土壤中積累的同時,勢必使該地區土壤中也富集了具有降解各類農藥的菌株[18]。由于微生物降解農藥具有低成本、效率高、無二次污染、生態恢復較好等特點,利用微生物處理農藥污染已成為解決環境中農藥殘留的重要途徑[19-20]。至今,國內外學者從各種環境中分離到多種能夠降解克百威的微生物,分類學上隸屬于無色桿菌屬、產黃菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、新鞘脂菌屬、金黃桿菌屬、地桿菌屬、屈撓桿菌屬、葡萄球菌屬、副球菌屬等[21]。同時對這些微生物降解克百威的條件及降解效率等也做了研究。例如,Pseudomonassp. AEBL3能夠在120 h內對100 mg·L-1克百威的降解率達到96.2%,最適降解pH為6.0[22];Sphingomonassp.CDS-1能夠在14 h內完全降解100 mg·L-1的克百威農藥,最適降解條件為pH6.0～7.0[23];Novosphingobiumsp.FND-3最佳降解條件為pH6.0[24];Paracoccussp. YM3能夠在6 d內完全降解50 mg·L-1的克百威,最佳降解條件為pH為7.0[25];Pseudomonassp. KBW-1能夠在108 h內完全降解200 mg·L-1的克百威,最適降解pH為7.0[26];Novosphingobiumsp. KN65.2在24 h內對200 mg·L-1克百威的降解率為40%,最適降解pH為7.0[27]等。其中降解pH條件大多數適應于酸性和中性。但是由于新疆地區土壤鹽漬化較嚴重、大陸干旱半干旱等環境特點,類似的研究成果并不適合用來解決當地堿性土壤中克百威的殘留問題,而從這樣環境中分離出的具有克百威降解功能的微生物的分類和代謝途徑都可能與已經報道的有所不同。

本研究從新疆長期連作棉田土壤中富集培養得到在pH8.0條件下可穩定傳代并降解克百威的菌群,進而從菌群中分離出71株降解菌株,并從中篩選出2株能夠具有較高降解克百威能力的菌株KJ71、KJ74,進而對這2株菌的降解特性進行研究,并確定這2株菌最適降解條件。本研究從新疆鹽堿土壤中分離克百威降解菌株,為解決當地土壤氨基甲酸酯類農藥污染提供微生物資源的同時,開展克百威降解菌株的降解特性研究,為后期研究堿性條件下的克百威的生物降解途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品 采集自新疆阿克蘇棉區 (79°45′81″～79°46′55″E,39°31′47″～39°45′50″N)連作10 a以上的土壤。采用五點采樣法,采樣后將土壤樣本帶回實驗室-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 克百威原藥購自廣西廣酞農業化工有限公司,純度≥98%。在甲醇中配置成10 g·L-1的儲備液,使用時將適量儲備液加入到培養基中稀釋成需要的濃度即可。細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR引物由上海生工合成。

1.1.3 培養基 基礎無機鹽培養基:NH4NO31.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41.5 g,NaCl 0.5 g,(NH4)2SO40.5 g,用蒸餾水溶解,pH=8.0,定容至1 000 mL,加入克百威儲備液至100 mg·L-1。

R2A培養基:酵母膏0.5 g,蛋白胨0.5 g,酪氨酸0.5 g,葡萄糖0.5 g,可溶性淀粉0.5 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,丙酮酸鈉0.3 g,用蒸餾水溶解,pH=8.0,定容至1 000 mL,克百威100 mg·L-1。

LB培養基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,用蒸餾水溶解,pH=8.0,定容至1 000 mL,克百威100 mg·L-1。

固體培養基:以上培養基中添加18 g·L-1瓊脂粉調為固體,在1×105Pa滅菌30 min后使用。

1.2 方 法

1.2.1 克百威降解菌群的富集 稱取5.0 g土壤樣品,加入裝有100 mL含100 mg·L-1克百威的基礎無機鹽培養基的250 mL三角瓶中,于37 ℃(編號為KBW 37)、120 r·min-1培養7 d。隨后以3%接種量傳代于新的含有上述培養基的三角瓶中,繼續在相同條件下培養。這樣連續傳代6次以上,部分菌液保存,部分菌液用于提取菌群總DNA,部分菌液用于分離純化克百威降解菌株。按同樣的方法富集28 ℃生長的克百威菌群(編號為KBW 28用作和KBW 37降解菌群做對比)。

1.2.2 菌群的高通量測序及數據分析 富集的KBW 28和KBW 37菌群和土壤樣品(編號為TR)按照QIAGEN○RDNeasyRULtraClean○RMicrobial Kit步驟要求提取總DNA,電泳檢測合格后送至諾禾致源生物科技有限公司對樣品進行高通量測序。

運用FLASHv1.2.7軟件[28]對每個測序樣本的序列(Reads)進行拼接,獲得原始拼接序列Tags數據,對其進行嚴格的過濾處理獲得高質量的Tags數據[29]。通過Uparsev 7.0.1001軟件對所有樣本進行聚類,用Mothur方法與SILVA 132的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析,獲得在各個分類水平分類學信息。通過Qiime v1.9.1軟件計算各樣品的Chao1、Shannon、Simpson指數,使用R v2.15.3軟件進行各樣品的Alpha多樣性指數組間差異分析。此外,對高通量數據獲得的克百威菌群OTU數據進行標準化處理,在MENA網站(http://ieg4.rccc.ou.edu/mena)進行上傳數據后,構建Pearson相關性矩陣。基于RMT(隨機矩陣理論,RandomMatrixTheory)設置合適的閾值,構建克百威降解菌群微生物分子生態網絡,研究不同溫度條件下富集的微生物群落之間的相互作用,獲得網絡拓撲參數文件,根據Deng等[30]的研究對微生物網絡構建進行詳細的分析。

1.2.3 克百威降解菌株的分離與純化 將富集得到的37 ℃降解菌群,分別使用基礎無機鹽培養基、R2A培養基、LB培養基采用稀釋涂布法從中分離微生物。將系列稀釋液分別涂布于含有克百威的上述培養基中,37 ℃、55%恒溫培養箱中培養3～7 d,挑取生長較快、菌落形態有明顯差異的單菌落,連續劃線純化培養獲取不同形態菌落的純培養物。

1.2.4 菌株的16S rRNA鑒定 依照TIANamp Bacteria DNA Kit基因組提取試劑盒操作流程提取各菌株的DNA并作為模板,使用通用引物27F和1492R進行16S rRNA基因PCR擴增。PCR擴增在Applied biosystems 2720擴增儀上進行,擴增體系為25 μL。PCR反應條件為:94 ℃ 5 min(預變性);94 ℃ 30 s(變性),55 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 1 min(延伸),循環30次;72 ℃ 10 min(延伸)。PCR產物送至上海生工公司完成測序。測序數據在NCBI網站上進行同源性比較,并提交至NCBI獲得菌株序列GenBank登錄號(MV866517-MV866520、MW301219-MW301257、MW819911-MW819933、 OL960556-OL960560)。用MEGA 7.0[31]軟件構建Neighbor-Joining系統發育樹。

1.2.5 克百威含量的檢測 克百威標準曲線制作:稱取一定量的克百威原藥,用色譜甲醇作為溶劑配置成質量濃度為10 g·L-1儲備液,逐級稀釋配制質量濃度為0、10、20、40、60、80、100 mg·L-1的標準液,進行液相色譜分析,測定峰面積,根據峰面積與濃度的對應關系制作標準曲線。

待測樣檢測:從待測樣品中取500 μL培養液,加入等體積的色譜甲醇萃取克百威,劇烈震蕩后在12 000 r·min-1條件下離心8 min,移取上層有機相,過孔徑0.45 μm的有機相針頭過濾器過濾后,用液相色譜測定樣液中克百威的含量。液相色譜條件為:C18 DiamosilTM反相柱;色譜柱 (250 mm×4.6 mm,粒徑5 μm);流動相:甲醇/水(體積比70∶30),流速1 mL·min-1;紫外檢測器:波長280 nm;進樣量:10 μL;柱溫: 25 ℃;保留時間:6 min。參考文獻[32]計算克百威降解率,克百威降解率=[1-(實測含量/添加量)]×100%。

1.2.6 降解菌株的篩選 將從克百威降解菌群中分離到的各菌株先于富含高濃度克百威的LB液體培養基中培養,檢測降解菌株能否耐受并高效降解不同濃度的克百威農藥,從而確定其生物修復應用能力,其次以1%的接種量接入裝有100 mL基礎無機鹽培養基(克百威濃度20 mg·L-1)的250 mL三角瓶中(每個樣品3個重復),于37 ℃、120 r·min-1震蕩培養,24 h后采用液相色譜法測定克百威殘留濃度,從中選出對克百威降解能力較強的菌株。

1.2.7 細菌生長曲線的測定 將對克百威降解能力較強的菌株KJ71和KJ74劃線接種到LB液體培養基中培養18 h,作為種子液。將種子液以5%的接種量接入到250 mL LB培養基中, 37 ℃、120 r·min-1培養,每隔2 h測定菌株OD600,以OD600值為縱坐標,時間為橫坐標繪制菌株的生長曲線。

1.2.8 克百威濃度、溫度、pH對降解克百威效率的影響 在1%接種量,120 r·min-1搖床中避光培養72 h為基本條件進行單因素試驗。在 “1.2.6”中得到的KJ71和KJ74菌株種子液,將在LB液體培養基中培養至對數期后,取出10 mL, 4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min收集菌體,(菌體用1 mL無菌水重懸)以1%的接種量分別測定在 37 ℃條件下克百威質量濃度分別為20、50、100 mg·L-1環境中菌株對克百威的降解;將上述方法收集的菌體懸液,以1%的接種量分別測定在 37 ℃條件下pH為6.0、7.0、8.0和 9.0環境中菌株對50 mg·L-1克百威的降解;在pH為7.0和9.0,以1%的接種量條件下分別測定溫度為25、30和35 ℃環境中菌株對50 mg·L-1克百威的降解。以上試驗驗均在250 mL三角瓶中加入100 mL含有克百威的基礎無機鹽培養基中接入菌體懸液避光培養,以不接菌只含有克百威的基礎無機鹽液體培養基為對照,每次試驗設3次重復,用液相色譜法測定菌株對克百威的降解率。

1.2.9 添加營養物質對降解率的影響 對單菌及菌群降解特性的比較,在250 mL三角瓶中加入100 mL基礎無機鹽培養基(含有克百威濃度為50 mg·L-1)分別添加葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨,使它們的終濃度達到1 g·L-1。將菌體懸液及菌群以1%的接種量接入上述培養基中,于37 ℃,120 r·min-1搖床中震蕩培養72 h(菌群培養36 h),同時設置不添加營養物質的作為對照,樣品經處理后,檢測克百威降解效率。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果及微生物群落多樣性分析

克百威降解菌群測序結果顯示:總序列數 9 554.6條,總堿基數為11 338 836.4 bp,其中有效序列為7 778條,占總序列的80.73%,無效序列為1 776.6條。序列平均長度為1 456.4 bp。采用Shannon和Simpson指數等對KBW 28、KBW 37和TR中微生物的多樣性進行評價,采用Observed species和Chao1對該微生物菌群的豐度進行評價。結果表明,原土壤樣品中細菌的多樣性指數及豐度明顯高于不同溫度富集的克百威菌群,表明原土壤中微生物群落種群差異性較大;28 ℃條件下富集的克百威降解菌群中所含物種數較37 ℃富集的菌群高,二者微生物菌群豐度差異明顯;原土壤樣品的覆蓋率都大于28 ℃和37 ℃富集的克百威降解菌群,說明樣品文庫的覆蓋率很大,樣品中序列沒有被測出的概率極低(表1)。

表1 樣品多樣性指數Table 1 Sample diversity index

2.2 克百威降解菌群結構組成分析

在門分類水平上相對豐度前10物種比較結果顯示:KBW 28菌群和KBW 37菌群中最豐富的菌門為變形菌門(Proteobacteria),相對豐度分別為 98.87%、88.24%;擬桿菌門(Bacteroidetes),相對豐度分別為1.13%、11.47%;而TR菌群中占優勢的細菌門有變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria),相對豐度分別為26.17%、23.51%、13.71%、7.49%、 5.16%;在屬水平上,KBW 28菌群中的優勢菌屬依次為Aquamicrobium(27.52%)、Methyloversatilis(19.36%)、Hyphomicrobium(6.93%)、Achromobacter(5.48%),在KBW 37菌群中占優勢的菌屬依次為Pseudoxanthomonas(54.30%),Hyphomicrobium(13.98%)、Hydrogenophaga(3.32%)、Aquamicrobium(3.13%),TR菌群中優勢菌屬為Hyphomicrobium(0.1%),其余99.8%的菌屬沒有檢測出來。

由此可見,通過使用克百威農藥脅迫培養,從該棉區土壤中富集出了新的微生物群落結構組成。同時溫度對克百威菌群結構的影響也較大,當溫度與土壤真實值接近時,在門和屬水平上檢測出的優勢菌門屬雖然相對豐度較低,但較為多樣。當溫度為37 ℃時,細菌生長代謝較快,但菌群結構趨于簡單或者導致部分菌屬的豐度下降(圖1)。

圖1 門分類水平top 10相對豐度(A)和屬分類水平top 10(B)Fig.1 TOP10 at phylum level(A) and TOP10 at genus level(B)

2.3 克百威降解菌群的共發生模式

2.3.1 網絡結構 分別基于28 ℃和37 ℃富集的克百威降解菌群的測序結果構建分子生態網絡(圖2)。結果顯示,KBW 37微生物群落共發生的物種、物種所屬于的屬、物種之間的正相關關系較KBW 28多。其中KBW 28群落網絡由16個節點和30條邊線組成,隸屬于16個菌屬,連通度較大的微生物類群為變形菌門(Proteobacteria);KBW 37微生物分子生態網絡的節點數總計為19,隸屬于19個菌屬,細菌物種間連接數較多,在菌群中變形菌門(Proteobacteria)的連通度較高,也存在部分芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。在KBW 28中度較大的節點主要來有Methyloversatilis、Aquamicrobium、Diaphorobacter、Achromobacter、Hyphomicrobium、Pseudoxanthomonas、Brevundimonas。而在KBW 37中度較大的節點主要有Noviherbaspirillum。此外,KBW 28菌群中正相關比負相關占多數,表明該菌群中物種間更多的是合作或共生關系。但是KBW 37菌群來說,網絡圖中正相關及負相關數占比一樣多,說明該菌群中物種間的相互作用較為復雜,種間也存在競爭關系。

圖2 不同處理克百威菌群共線性網絡圖譜Fig.2 Network co-occurrence analysis of carbofuran flora under different treatments

2.3.2 拓撲特性 對比不同溫度富集的克百威降解菌群網絡拓撲特性中可以看出(表2), KBW 37中的網絡總節點數、總連接數和平均連通度較KBW 28更高,表明37 ℃富集的克百威降解菌群的微生物網絡規模更大,相互作用的關系更為復雜;微生物網絡路徑距離代表物種間傳遞物質、能量及信息的效率[33],相比較于KBW 28,KBW 37的網絡平均路徑距離較短,說明KBW 37中微生物間響應速度更快,當外界溫度發生變化時該菌群中群落結構更易波動。

表2 不同處理微生物作網絡拓撲性質Table 2 Topological properties of microbial interaction network relative to treatment

2.4 克百威降解菌的分離與初步鑒定

從克百威菌群中共分離篩選出71株菌株,它們分別隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)48株、埃希氏桿菌屬(Escherichia)11株、志賀氏菌屬(Shigella)5株、短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)2株、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)2株、腸桿菌屬(Enterobacter)1株、不動桿菌屬(Acinetobacter)1株、紅球菌屬(Rhodococcus)1株等8個屬。分別選擇與71株菌株的16S rRNA序列GenBank相似性最高的Enterobacterhormaecheisubsp.Xiangfangensis10-17、Bacillustequilensis10b、RhodococcuspyridinivoransPDB9、PaenibacilluslautusNBRC15380、AcinetobacterlwoffiiJCM6840等菌株序列進行比對并構建進化樹(圖3)。

圖3 71株菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 71 strains

2.5 菌株降解能力篩選

從71株菌株中分別獲得3株能夠在富含高濃度克百威的培養基中生長的菌株,并利用高效液相色譜法測定該3株菌株對克百威的降解能力。根據回歸方程y=0.069 5x+ 0.045 2 (R2=0.996 3),計算該3株菌對克百威的降解能力并進行比較。結果表明,菌株KJK44、KJ71、KJ74菌降解率分別為37.58%、41.40%、 39.23%,其中KJ71和KJ74具有較好的降解率。鑒于此,本研究選擇KJ71(隸屬于紅球菌屬,登錄號為MW819928)和KJ74菌株(隸屬于類芽孢桿菌屬,登錄號為MV866520)為研究對象,進行下一步的研究(圖4)。

圖4 不同菌株克百威的降解率Fig.4 Degradation rate of different strains in degradating carbofuranin

2.6 菌株KJ71和KJ74的生長特性

圖5為KJ71和KJ74兩株菌在5%接種量,37 ℃、120 r·min-1培養條件下的生長曲線,0～2 h時,菌株生長較為緩慢,處于生長緩慢期,2 h后,OD600數值迅速增加,該兩株菌進入對數生長期,代謝活動較為活躍,其中KJ71菌株生長20 h后,KJ74菌株30 h后生長速度下降,增長較為緩慢,菌株的生長曲線為后期微生物菌劑的制備提供了條件。

圖5 2株菌生長曲線Fig.5 Growth curve of 2 strains of bacteria

2.7 菌株KJ71和KJ74的降解特性

2.7.1 克百威質量濃度對菌株降解能力的影響 隨著克百威濃度的增高,菌株KJ71和KJ74對克百威降解率隨之增高,當克百威質量濃度為50 mg·L-1時,降解率達到最高,分別為67.90%、71.00%。克百威質量濃度超過50 mg·L-1時,降解率隨之降低,這說明克百威質量濃度過高會抑制KJ71和KJ74菌株對克百威的降解(圖6)。

圖6 不同克百威初始質量濃度下2株菌降解克百威的降解率Fig.6 Degradation rate of two strains of bacteria in degradating carbofuran in differnet initial concentations

2.7.2 pH對菌株降解能力的影響 在初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0,克百威質量濃度為50 mg·L-1的富集培養基中,KJ71在pH為6.0～9.0時,克百威的降解率變化不大,其中72 h, pH=9.0時該菌株降解克百威的降解率達到最大,為63.88%;對KJ74菌株來說,pH在6.0～9.0,該菌株對克百威的降解率先升高后降低,培養72 h,pH=7.0時對克百威的降解效率達到最大,為70.22%(圖7)。

圖7 不同初始pH下2株菌降解克百威的降解率Fig.7 Degradation rate of 2 strains of bacteria in degradating carbofuran in differnet initial pH

2.7.3 溫度對菌株降解能力的影響 在25、30、35 ℃條件下,菌株KJ71對克百威的降解率分別為28.65%、27.20%、27.70%,降解效率變化不大;對菌株KJ74來說,在不同的溫度下,對克百威的降解效率先升高后降低,當溫度為30 ℃時降解效率達到最大為36.30%(圖8)。

圖8 不同溫度下2株菌降解克百威的降解率Fig.8 Degradation rate of 2 strains of bacteria in degrading carbofuran in different temperatures

2.7.4 添加營養物質對降解效率的影響 添加少量有機氮源,如蛋白胨、牛肉膏可提高菌株KJ71和KJ74對克百威的降解率,添加少量有機碳源葡萄糖時菌株對克百威的降解率受到抑制,添加酵母膏時降解率不變。原因在于當培養基中添加外加氮源能夠促進菌株的生長,使其生物種群增大,從而促進該2株菌株對克百威的降解,但是外加碳源卻抑制菌株的生長,導致降解率較只加氮源有明顯降低。但是對于克百威菌群來說,添加不同的營養物質均有助于提高菌群對克百威的降解能力,這說明菌群在利用有機碳源及氮源快速增長的同時加大了對克百威的分解利用。特別是在蛋白胨體系中(圖9)。

圖9 添加營養物質單菌和菌群降解克百威的降解率Fig.9 Degradation rate of single bacteria and microflora in degrading carbofuran in nutrient addition

3 討論與結論

土壤是最復雜的微生態系統之一,氣候條件、土壤理化性質、栽培作物的種類,甚至其栽培管理措施等都是影響土壤微生物群落結構組成的重要因素。新疆特殊的氣候和土壤性質使該地區擁有獨特的微生物資源,而棉區作物種類單一等因素又促使土壤演替出新的微生物群落結構組成[34]。通過研究發現,在僅有克百威農藥作為碳源的脅迫下,富集到的菌群結構組成與長期連作棉田土壤微生物群落結構相比發生了巨大改變。首先,在門水平上,占優勢的門及其相對豐度就發生了很大變化。如Proteobacteria所占比例由 26.17%增加到88.24%,而原來相對豐度10%左右的Acidobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi在克百威降解菌群中幾乎未檢測到。在屬分類水平上,克百威降解菌群中占優勢的Pseudoxanthomonas、Hyphomicrobium、Hydrogenophaga等屬在土壤微生物群落結構中的相對豐度依次僅為0.08%、0.10%、0.01%。其次,在不同的溫度條件下農藥克百威脅迫形成的菌群之間相比,盡管菌群來源及使用農藥一樣,但富集后的菌群結構依然在門和屬水平及其相對豐度上仍然存在差異。從兩個不同溫度培養菌群整個網絡的結構來看,KBW 37微生物群落成員共發生的物種數和其所屬的菌屬均較KBW 28多。由此可見,溫度條件對降解菌群結構組成造成很大的影響,同一種農藥脅迫下不同培養溫度能富集到結構不同的降解菌群。說明,新疆地區鹽漬化嚴重、干旱等特殊的氣候條件使該地區形成了特殊的微生物類群,也進一步解釋了在其他地區使用的克百威降解菌株卻在該土壤中不適用的原因。因此,本研究在高通量水平上為后期更好地研究適合新疆當地土壤環境克百威降解菌株的挖掘提供了理論依據。

1986年Karns等[35]首次從受克百威污染的活性污泥中分離到一株克百威降解菌VW1(Achromobacter),從此拉開了克百威降解菌篩選工作的序幕。至今,國內外研究者已經從不同環境中分離到多株能夠降解克百威的微生物,它們在分類學上隸屬于不同的種屬,其中以Pseudomonas居多。本研究從降解菌群中分離篩選出71株菌株,分別隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)、短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)。這與高通量測序結果完全不一致,與目前已報道的能夠降解克百威的菌株進行屬水平的比較也存在一定的差異。原因可能在于:第一,分離培養使用的培養基或者pH、溫度等培養條件仍然無法滿足部分菌株的生長需求,而未能培養出來;第二,很有可能是土壤樣本采集地環境所孕育的物種差異導致的。那么來自不同環境下的不同菌屬在降解克百威的降解效率以及代謝通路上是否也存在差異,值得進一步研究。

研究表明,微生物農藥降解受很多因素的影響,如微生物自身特征、農藥初始濃度、溫度、pH以及營養物質等[10]。目前國內外研究者,從各種污染環境中篩選出多株克百威降解菌株,它們對克百威的降解效率有高有低,降解條件pH大多數偏向于中性和酸性環境。然而,新疆地區由于土壤鹽漬化嚴重、干旱等獨特的環境特點,適合內地環境條件的克百威降解菌株在新疆并不一定適用。因此本研究以當地土壤環境為研究對象,在堿性條件下進行菌群富集培養并從中篩選出能適應堿性條件的克百威降解菌株,利用高效液相色譜法研究克百威分離菌株與克百威菌群在不同培養階段的降解效率,探究不同條件對菌株降解克百威的影響。研究過程中發現,隸屬于紅球菌屬(Rhodococcus)及類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的菌株KJ71和KJ74是從本地土壤中分離獲得的具有降解克百威能力的菌株。而已有的研究表明,目前已發表的參與克百威降解的細菌中,尚未有Rhodococcus、Paenibacillus的菌株被報道,同時隸屬于Rhodococcus、Paenibacillus的菌株KJ71和KJ74是首次獲得的能在堿性條件下參與克百威降解能力的細菌。因此通過高效液相色譜法對該2株菌株進行了降解特性的研究,發現在25 ℃～35 ℃,溫度對KJ71降解克百威沒有顯著影響,對KJ74菌株來說,當溫度為 30 ℃時降解效果最好,這個特性與當地作物種植季節土壤溫度相符;在pH為6.0～9.0,當pH分別為 9.0、7.0時KJ71和KJ74對克百威的降解效率達到最好,分別為63.88%和 70.22%,較寬的pH適應范圍非常有利于開發利用。在培養基中添加營養物質對菌株及菌群降解克百威效率的影響中發現,當添加少量有機氮源時可促進菌株對克百威的降解效率,添加少量有機碳源葡萄糖時菌株對克百威的降解率受到抑制;對菌群來說添加有機碳源及有機氮源均有助于提高菌群對克百威的降解效率。由此可見,KJ71和KJ74菌株在降解克百威的過程中,具有良好的環境適應性,該研究結果可為開發該地區環境條件下的克百威降解基因及降解途徑、新疆地區土壤環境修復打下基礎。

由于克百威本身對于生物安全具有危害性,且已經被大量應用于農業生產過程中,所以研究以克百威為代表的氨基甲酸酯類農藥的生物降解仍具有重要的意義。篩選出能夠高效降解克百威的菌株是生物降解的基礎,探究降解菌的降解特性對日后將降解菌推向新疆鹽堿土壤中氨基甲酸酯類農藥污染的修復等方面具有應用價值。當然,探究這些菌株在堿性條件下的生物降解途徑相關問題還尚待深入。