基于納豆激酶特性的功能遞送載體研究進(jìn)展

解明浩，徐獻(xiàn)兵，王震宇，程述震，杜 明*

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

血栓和栓塞性疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，其發(fā)病率和死亡率居各類疾病之首[1]。目前臨床上已經(jīng)有多種用于溶栓治療的溶栓劑[2]，如鏈激酶、尿激酶、葡激酶、單鏈尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑等。這些溶栓劑具有較高的溶栓特異性，但同時(shí)易引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)及大出血等。納豆激酶是一種由275 個(gè)氨基酸殘基組成的堿性絲氨酸蛋白酶，其等電點(diǎn)為pH 8.6，分子質(zhì)量為27.7 kDa[3]。納豆激酶具有價(jià)格低廉、溶栓活性高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、特異性強(qiáng)、不易引起出血和過(guò)敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的天然溶栓活性物質(zhì)，具有開(kāi)發(fā)為膳食補(bǔ)充劑的廣闊前景。基于納豆激酶天然生物酶學(xué)性質(zhì)，目前其市場(chǎng)產(chǎn)品存在活性和生物利用度低等問(wèn)題。現(xiàn)有納豆激酶產(chǎn)品經(jīng)口腔-胃-腸消化吸收系統(tǒng)后，進(jìn)入血液發(fā)揮溶栓功能，而消化吸收系統(tǒng)環(huán)境（低pH值等）和因子（胃蛋白酶、胰蛋白酶等）能夠破壞納豆激酶空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其溶栓功能活性降低或喪失[4]。

包埋遞送是解決現(xiàn)有納豆激酶產(chǎn)品胃腸穩(wěn)定性問(wèn)題的有效措施。功能遞送載體可在時(shí)間、空間及劑量上全面調(diào)控生物體內(nèi)活性物質(zhì)的分布，將活性物質(zhì)靶向遞送到相應(yīng)器官，提高活性物質(zhì)利用效率，降低成本，減少毒副作用。經(jīng)功能遞送載體包埋的活性物質(zhì)可在機(jī)體內(nèi)緩慢釋放，從而延長(zhǎng)活性物質(zhì)在血液或特定組織中的半衰期。功能遞送載體解決了脂溶性活性物質(zhì)溶解度低的加工應(yīng)用瓶頸問(wèn)題，同時(shí)通過(guò)抑制活性物質(zhì)的降解，提高了其在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性和吸收效率。功能遞送載體可以負(fù)載活性物質(zhì)、改善負(fù)載物質(zhì)的生物分布和釋放動(dòng)力學(xué)、增強(qiáng)其細(xì)胞攝取和生物相容性，其設(shè)計(jì)過(guò)程中需要考慮的因素包括疏水性、生物降解性、尺寸、形狀、表面電荷和毒性等[5]。

綜上，構(gòu)建功能載體包埋遞送納豆激酶，使其免受胃腸環(huán)境的不利影響，提高其穩(wěn)定性和生物利用度，對(duì)納豆激酶溶血栓產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有一定意義。本文總結(jié)了現(xiàn)有多糖、蛋白質(zhì)等材料構(gòu)成的納豆激酶功能遞送載體的研究現(xiàn)狀，以期為開(kāi)發(fā)高效、穩(wěn)定型納豆激酶溶栓產(chǎn)品提供理論參考。

1 納豆激酶的結(jié)構(gòu)與功能特性

1.1 納豆激酶的結(jié)構(gòu)特性

納豆激酶是一種價(jià)格低、效率高、無(wú)毒副作用、具有強(qiáng)力纖溶活性的堿性絲氨酸蛋白酶[6]。該酶活性中心位點(diǎn)在Asp32、His64和Ser221處（圖1A），與底物結(jié)合部位在Ser125、Leu126及Gly127處（圖1B）[7]。對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的因素主要包括pH值、溫度、金屬離子等。納豆激酶在pH 7.0～12.0之間最穩(wěn)定，低于pH 6.0時(shí)活性逐漸喪失[8]，最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)溫度低于45 ℃時(shí)酶活性相對(duì)穩(wěn)定，高于60 ℃時(shí)由于蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致其活性迅速喪失，反復(fù)凍融對(duì)該酶活性影響不大[9]。Mg2＋、Ca2＋和Na＋對(duì)于納豆激酶具有明顯的激活作用，F(xiàn)e2＋、Zn2＋、Cu2＋、Ba2＋、Al3＋、Mn2＋及高濃度K＋對(duì)其活性有抑制作用[10]。

圖1 納豆激酶的空間結(jié)構(gòu)Fig.1 Spatial structure of nattokinase

1.2 納豆激酶的功能特性

1.2.1 納豆激酶的抗血栓活性

血栓由血管內(nèi)的不溶性纖維蛋白包裹血小板及血細(xì)胞形成[11]。1987年Sumi等研究發(fā)現(xiàn)納豆具有體外溶栓功效，并確認(rèn)其中有效成分為納豆激酶[6]。各種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，納豆激酶均表現(xiàn)出極強(qiáng)的溶栓活性，且出血風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低[12-17]。納豆激酶主要通過(guò)4 個(gè)途徑發(fā)揮溶栓作用：1）納豆激酶直接溶栓，它能夠直接將纖維蛋白分解為小分子肽和氨基酸，從而導(dǎo)致血栓溶解[18]；2）納豆激酶刺激尿激酶原轉(zhuǎn)化為尿激酶[19]；3）納豆激酶刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生作為內(nèi)源性纖溶酶原激活劑的組織纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA），t-PA催化纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，從而使積累的纖維蛋白溶解[14]；4）降解纖溶酶原激活物抑制劑，使纖溶酶原被激活為纖溶酶，增強(qiáng)纖溶作用[20]。

1.2.2 納豆激酶的抗血小板聚集作用

體外研究表明納豆激酶具有抗血小板聚集作用。Jang等[21]發(fā)現(xiàn)納豆激酶可以抑制膠原蛋白和血栓素誘導(dǎo)的血小板聚集，并抑制活化的血小板產(chǎn)生血栓素，被認(rèn)為具有類似阿司匹林的作用，從而有效地抑制血小板聚集。納豆激酶可以顯著增加大鼠血小板中的環(huán)磷酸腺苷，抑制血小板聚集[22]。納豆激酶可通過(guò)抑制血小板胞漿游離鈣離子濃度，降低內(nèi)皮素-1含量，提高一氧化氮含量，降低血小板顆粒膜蛋白和血管性血友病因子水平，抑制血小板聚集。

1.2.3 納豆激酶的降血壓作用

灌胃納豆激酶和高血壓臨床藥物卡托普利可有效降低自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓和舒張壓[23]。臨床評(píng)估納豆激酶對(duì)北美高血壓人群血壓影響的研究顯示，口服2 000 FU/d納豆激酶8 周后，受試者舒張壓平均下降0.40 kPa，其中男性受試者舒張壓下降較明顯，為0.67 kPa[24]。無(wú)論完整形式還是片段的納豆激酶都可以從腸道吸收并降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓。然而，根據(jù)口服給藥形式的不同，降壓作用機(jī)制不同。納豆激酶保留其蛋白酶活性時(shí)，可通過(guò)切割血漿纖維蛋白原降低血液黏度來(lái)降低血壓；從納豆激酶獲得的片段可通過(guò)降低血漿血管緊張素II水平來(lái)抑制高血壓[25]。

1.2.4 納豆激酶的降血脂作用

一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中將82 例頸動(dòng)脈粥樣硬化和高脂血癥患者分為兩組，分別給予納豆激酶（6 000 FU/d）或辛伐他汀（20 mg/d），26 周后納豆激酶組患者頸動(dòng)脈斑塊面積和頸總動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度顯著下降，且下降幅度大于辛伐他汀組。納豆激酶可降低患者膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平，但是其降幅僅為辛伐他汀組的50%左右。該研究結(jié)果顯示，每天服用納豆激酶可以有效控制頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，且效果比辛伐他汀更明顯。說(shuō)明納豆激酶在管理動(dòng)脈粥樣硬化上可能是比他汀類藥物更好的選擇[26]。納豆激酶在降低實(shí)驗(yàn)性高血脂大鼠總膽固醇水平的同時(shí)可升高其血清中超氧化物歧化酶和一氧化氮水平，說(shuō)明納豆激酶可以降低實(shí)驗(yàn)性高血脂大鼠血清中的血脂含量，有較好的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和血管內(nèi)皮保護(hù)作用，能夠降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率[27]。

1.2.5 納豆激酶的抗凝作用

一項(xiàng)針對(duì)成人非糖尿病高膽固醇血癥的隨機(jī)雙盲、安慰劑對(duì)照實(shí)驗(yàn)評(píng)估了2 000 FU/d劑量納豆激酶與安慰劑在8 周內(nèi)對(duì)凝血因子的影響，治療8 周后納豆激酶組患者的膠原-腎上腺素閉孔時(shí)間（collagen-epinephrine closure time，C-EPI CT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）和活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，aPTT）顯著延長(zhǎng)，納豆激酶組患者的C-EPI CT和aPTT與安慰劑組相比顯著延長(zhǎng)。在第8周時(shí)，納豆激酶組患者的C-EPI CT顯著長(zhǎng)于安慰劑組，且PT和aPTT之間存在顯著相關(guān)性。該研究結(jié)果提示非糖尿病高膽固醇血癥患者補(bǔ)充納豆激酶與C-EPI CT和aPTT的延長(zhǎng)相關(guān)[28]。納豆激酶可以通過(guò)抑制內(nèi)源性和外源性凝血途徑來(lái)抑制凝血活酶的形成。在凝固過(guò)程的第2階段，納豆激酶顯著延長(zhǎng)了纖維蛋白凝固時(shí)間，而在凝固過(guò)程的第3階段，納豆激酶顯著延長(zhǎng)了凝血時(shí)間[29]。納豆激酶的功能特性匯總?cè)鐖D2所示。

圖2 納豆激酶的功能特性Fig.2 Functional properties of nattokinase

1.2.6 納豆激酶應(yīng)用的局限性

納豆激酶是一種堿性蛋白酶，口服后必須途經(jīng)胃腸道被小腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入血液，并運(yùn)輸?shù)饺硌h(huán)后才能發(fā)揮其溶栓作用[4]。胃中的胃蛋白酶和低pH值環(huán)境會(huì)破壞納豆激酶的空間結(jié)構(gòu)，使其失去纖溶活性，而腸道中的消化環(huán)境比胃中的消化環(huán)境溫和。如果口服納豆激酶，必須確保其在消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，以達(dá)到溶栓的目的。包埋技術(shù)是使納豆激酶在胃內(nèi)穩(wěn)定并在腸內(nèi)緩慢釋放的有效方法。

2 納豆激酶包埋遞送系統(tǒng)

目前在納豆激酶遞送系統(tǒng)中使用較多的壁材包括多糖、蛋白質(zhì)等材料，可以分為如圖3所示的不同類型納豆激酶遞送系統(tǒng)。

2.1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由一個(gè)或多個(gè)同心磷脂雙層構(gòu)成微囊結(jié)構(gòu)的載體制劑，其結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞膜，具有高生物相容性、低毒性和低免疫原性[30]。脂質(zhì)體獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性使其能夠封裝水溶性、油溶性和兩親性物質(zhì)，兩性分子分散于水相時(shí)形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，其親水頭部暴露在水相中，而疏水尾部聚集在一起，在雙分子膜內(nèi)和囊泡內(nèi)水相能夠包裹多種不同極性的活性成分[31]。脂質(zhì)體能夠提高化合物的穩(wěn)定性、克服細(xì)胞和組織攝取障礙、增加藥物在體內(nèi)靶點(diǎn)的生物分布，同時(shí)最大限度地降低全身毒性，從而提高藥物的治療效果[25]。脂質(zhì)體中的膽固醇為磷脂雙分子膜提供剛性的成分并改善雙層膜的性能[32]，但對(duì)于高膽固醇血癥患者，即使是低濃度的膽固醇也應(yīng)嚴(yán)格限制攝入[33]。植物甾醇可以通過(guò)抑制膽固醇從小腸的吸收而有效降低血漿中的膽固醇濃度[34]，其功能和化學(xué)結(jié)構(gòu)與磷脂雙分子膜中膽固醇相似，且在制備脂質(zhì)體時(shí)用植物甾醇代替膽固醇是可行的[35]。脂質(zhì)體包埋納豆激酶有利于破壞血栓，尤其是高脂血癥引起的血栓。Dong Xuyan等[36]采用薄膜分散法制備了植物甾醇脂質(zhì)體，并用其包埋納豆激酶，在優(yōu)化條件下，其最高包埋率為65.25%。經(jīng)適當(dāng)制備后，該脂質(zhì)體呈圓形且形狀規(guī)則、無(wú)黏附性。此外，含有納豆激酶的脂質(zhì)體在4 ℃下是穩(wěn)定的，該脂質(zhì)體有效地降低了胃部環(huán)境對(duì)所包裹納豆激酶的干擾，使其可以更有效地在小腸被吸收。

2.2 多糖

2.2.1 海藻酸鈉

海藻酸鈉是一種從褐藻類中提取的帶有大量活性基團(tuán)的陰離子天然多糖，具有pH值敏感性、生物相容性、可降解性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品加工、生物醫(yī)學(xué)、污水處理等領(lǐng)域。可以運(yùn)用包埋法將活性物質(zhì)與海藻酸鈉混勻，通過(guò)添加二價(jià)陽(yáng)離子或小分子交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，在交聯(lián)過(guò)程中活性物質(zhì)隨之被包裹在微球內(nèi)。海藻酸鈉微球具有明顯的pH值敏感性，當(dāng)微球處于pH＜3.4環(huán)境中時(shí)，羧酸基團(tuán)呈非離子形式（—COOH）狀態(tài)，微球分子鏈?zhǔn)湛s，從而減少藥物對(duì)胃部的刺激。當(dāng)pH＞4.4時(shí)羧基離子化為—COO-，負(fù)電荷靜電斥力和親水基團(tuán)的增加導(dǎo)致聚合物鏈溶脹，有利于藥物釋放[37]。然而在極低的pH值條件下，交聯(lián)的海藻酸鹽基質(zhì)體系中海藻酸鹽的分子質(zhì)量降低，會(huì)導(dǎo)致活性成分的快速降解和釋放[38]。因此，其還需要與其他材料復(fù)合才能更好地發(fā)揮保護(hù)作用，可以將明膠、殼聚糖等高分子材料與海藻酸鈉復(fù)合以增強(qiáng)其機(jī)械性能，延長(zhǎng)活性物質(zhì)在體內(nèi)的半衰期并提高其穩(wěn)定性，控制活性物質(zhì)的釋放時(shí)間。

陳景鑫[39]采用固定化載體制備空白微球，再將其分散在酶溶液中，使其充分吸附酶液，然后用戊二醛交聯(lián)劑固化制得納豆激酶微膠囊。載體給酶提供了微環(huán)境，更近似于酶的天然條件；同時(shí)戊二醛的交聯(lián)作用穩(wěn)定了酶的分子構(gòu)象，使固定化酶的臨界變性溫度升高，對(duì)酶起到保護(hù)作用。此方法制得的納豆激酶微膠囊包埋率為86.83%，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，但是溶液有低毒性。通過(guò)模擬胃液的體外實(shí)驗(yàn)證明固定化納豆激酶在正常胃腸道的酸性環(huán)境中仍具有酶活力穩(wěn)定性。

程云[40]、孫建華[41]、李倩文[42]等都探究了使用海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉和氯化鈣包埋納豆激酶的最優(yōu)條件，其中最高包埋率為97%。研究表明，納豆激酶裸酶在模擬胃腸道條件下酶活力明顯降低，采用微膠囊技術(shù)包埋納豆激酶，可以將其與胃酸等不良環(huán)境隔開(kāi)，提高其在不良條件下的穩(wěn)定性，降低其在胃液中的釋放率，實(shí)現(xiàn)其在腸液中的定向釋放。納豆激酶微膠囊在模擬胃液中釋放率為4.88%，在模擬膽汁中釋放率為18.06%，在模擬腸液中釋放率為73.43%，結(jié)果證實(shí)納豆激酶微膠囊能夠顯著地改善納豆激酶在胃酸等不良條件下的穩(wěn)定性[42]。

陳守文等[43]以海藻酸鈉和聚谷氨酸鈉為壁材制備出一種具有較高包埋率、抗酸能力強(qiáng)的納豆激酶膠囊。其包埋率為64.48%，在模擬胃酸的低pH值條件下，此膠囊可以有效保證40%以上的納豆激酶活性，并使其在模擬人體腸道環(huán)境中緩慢釋放，并在80 min內(nèi)完全釋放。

于江淼[44]以海藻酸鈉、氯化鈣、甘油和尤特奇L100為主要壁材制備了腸溶納豆激酶微膠囊。其包埋率和模擬腸液的酶活力回收率分別為94.06%和95.62%。尤特奇L100是一種安全、無(wú)毒、包衣過(guò)程不粘連的腸溶包衣材料，能與海藻酸鈣和甘油等配合形成壁材，在人體胃液中為納豆激酶提供更好的保護(hù)，在人體腸液中，其分子中帶有的羧基與堿結(jié)合成鹽而溶解，使納豆激酶釋放并到達(dá)血栓部位，發(fā)揮直接和間接溶栓的能力。

2.2.2 環(huán)糊精

環(huán)糊精是通過(guò)淀粉酶促降解作用得到的一系列天然多糖，通常是由α-1,4糖苷鍵連接6～8 個(gè)D-吡喃葡萄糖單元形成，分為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精具有親水性外緣和疏水性內(nèi)腔，呈現(xiàn)出錐型中空?qǐng)A筒狀立體結(jié)構(gòu)，這使其可以通過(guò)疏水相互作用、范德華力、氫鍵或主客體相互作用包埋各種客體分子。環(huán)糊精具有制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、易于包埋等優(yōu)點(diǎn)，其中極性較低的疏水腔可以嵌入各種小分子和蛋白質(zhì)。

陳景鑫[39]采用超分子微膠囊技術(shù)制備納豆激酶微膠囊，以β-環(huán)糊精為壁材，微孔淀粉吸附納豆激酶為芯材，使用噴霧干燥技術(shù)對(duì)納豆激酶進(jìn)行包埋。通過(guò)超分子微膠囊技術(shù)生產(chǎn)的納豆激酶微膠囊生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期較短、試劑安全無(wú)毒，但包埋率僅為69.25%，且生產(chǎn)成本較高。經(jīng)過(guò)β-環(huán)糊精超分子微膠囊技術(shù)處理后的納豆激酶與裸酶相比具有更強(qiáng)的耐酸性和穩(wěn)定性。謝建飛等[45]將納豆均質(zhì)后添加益生菌、明膠和β-環(huán)糊精，經(jīng)過(guò)真空干燥及粉碎制備含有納豆激酶和益生菌的微膠囊。β-環(huán)糊精和明膠與納豆中含有的γ-聚谷氨酸形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的微膠囊，將納豆激酶和益生菌包埋于其中，能夠有效防止胃液等不良因素對(duì)其造成破壞，提高納豆激酶的穩(wěn)定性和益生菌的存活率。

2.2.3 其他多糖

張杰等[46]將阿拉伯樹(shù)膠和明膠混合制備納豆激酶微膠囊，其包埋率達(dá)到93.91%。陳景鑫[39]采用復(fù)凝聚法利用羧甲基纖維素和明膠制備納豆激酶微膠囊，其耐酸性較原始納豆激酶液明顯提高。Kapoor等[16]用交聯(lián)技術(shù)將純化的納豆激酶通過(guò)殼聚糖與三聚磷酸鈉離子凝膠化，然后與戊二醛交聯(lián)來(lái)制備穩(wěn)定的負(fù)載納豆激酶的殼聚糖納米粒子。與游離納豆激酶相比，負(fù)載納豆激酶的穩(wěn)定殼聚糖納米顆粒在口服后顯示出更好的穩(wěn)定性，且其抗血栓生物活性增強(qiáng)。

2.3 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)具有較好的溶解性、乳化性、凝膠性、起泡性、持水性、生物相容性和降解性[47]。因其所形成的凝膠具有良好的pH值敏感性、可控的通透性和較高的凝膠強(qiáng)度，已被廣泛用于各種生物活性成分的包埋。蛋白質(zhì)能夠通過(guò)酶、酸以及鈣離子的交聯(lián)作用在室溫下形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠，且該反應(yīng)條件溫和，有利于對(duì)熱敏感的生物活性成分進(jìn)行包埋[48]。基于以上特性，蛋白質(zhì)成為極具應(yīng)用前景的納豆激酶包埋壁材。目前常用的單一蛋白質(zhì)壁材包括大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、乳清蛋白、酪蛋白和明膠。

董緒燕等[49]分別使用乳清蛋白、明膠和玉米醇溶蛋白作為包埋壁材制備納豆激酶微囊，納豆激酶的活性保留率分別為56.8%、45.8%和48.4%。復(fù)合蛋白質(zhì)壁材相較于單一蛋白質(zhì)壁材更具優(yōu)勢(shì)。由于蛋白質(zhì)膠粒易聚集且能被消化系統(tǒng)中的蛋白酶水解，單一蛋白質(zhì)壁材制備的微膠囊在貯藏和遞送時(shí)會(huì)受到限制。碳水化合物壁材具有較好的溶解性，在胃中不被降解，蛋白質(zhì)通過(guò)與碳水化合物或其他種類的蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)配形成的復(fù)合壁材能夠彌補(bǔ)單一壁材的缺點(diǎn)，提高包埋效率和保護(hù)效果，并提高壁材膜的致密性和微膠囊遞送效率，還可以減少某些高價(jià)壁材的添加量，從而節(jié)省成本[43]。

Zhang Xuan等[50]以殼聚糖為核心，京尼平為殼聚糖核與納豆激酶的交聯(lián)劑，牛乳酪蛋白為顆粒外層保護(hù)材料，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶為保護(hù)層，采用分步交聯(lián)制備納豆激酶緩釋顆粒，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其體內(nèi)抗血栓功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，納豆激酶微膠囊的包封率為73.8%。通過(guò)體外消化模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所制備的具有雙層殼核結(jié)構(gòu)的納豆激酶緩釋顆粒能大幅提高納豆激酶在胃酸中的穩(wěn)定性。使用京尼平將納豆激酶固定在殼聚糖微球上，有效地增強(qiáng)了納豆激酶結(jié)構(gòu)的空間穩(wěn)定性，從而提高了其對(duì)酸和消化酶的抗性。酪蛋白保護(hù)殼可以進(jìn)一步將納豆激酶與外部的酸和消化酶相隔絕，從而保護(hù)納豆激酶免受外部不利環(huán)境的影響。給黑尾模型小鼠灌胃該顆粒，結(jié)果顯示其能夠明顯抑制小鼠尾部血管內(nèi)的血栓形成并促進(jìn)血栓溶解，與灌胃游離納豆激酶組相比效果顯著增強(qiáng)。通過(guò)纖維蛋白平板印跡法驗(yàn)證納豆激酶在小鼠消化道內(nèi)的緩慢釋放以及腸黏膜吸收效果，結(jié)果表明，緩釋顆粒所裝載納豆激酶長(zhǎng)達(dá)12 h持續(xù)不斷地釋放，而酪蛋白保護(hù)層可以更有效地延緩納豆激酶在腸道中的釋放。為了進(jìn)一步探討納豆激酶緩釋顆粒在腸道內(nèi)的緩釋動(dòng)力學(xué)特性，該研究對(duì)口服緩釋顆粒小鼠腸道內(nèi)容物的纖溶活性進(jìn)行了動(dòng)態(tài)測(cè)定。結(jié)果表明，緩釋顆粒中的納豆激酶在腸道中的釋放以及隨后的吸收或失活是一個(gè)持續(xù)過(guò)程，該過(guò)程可被酪蛋白保護(hù)殼顯著延長(zhǎng)。由此說(shuō)明，具有雙層殼-核結(jié)構(gòu)的藥物緩釋顆粒是一種理想的納豆激酶口服劑型，其口服給藥間隔可控制在8～12 h。

Zhong Yejun等[51]研究了卵清蛋白-黃酮類化合物（柚皮素、染料木素、柚皮苷、葛根素和大豆苷元）水凝膠對(duì)納豆激酶溶栓活性和穩(wěn)定性的保護(hù)作用。所研究的5 種納豆激酶/卵清蛋白黃酮類化合物水凝膠在微觀結(jié)構(gòu)、質(zhì)地特性和流變特性方面存在差異。該方法能夠有效地包封納豆激酶，并提高其在不同pH值和溫度下的穩(wěn)定性。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，卵清蛋白黃酮水凝膠增強(qiáng)了納豆激酶的溶栓活性和穩(wěn)定性。納豆激酶/卵清蛋白-柚皮素水凝膠顯示出最佳的溶栓效率。熒光光譜測(cè)定和計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明，納豆激酶與大豆苷元和染料木素之間的主要相互作用是氫鍵，而納豆激酶與柚皮苷、葛根素和柚皮素之間的主要相互作用是疏水相互作用。

2.4 其他材料

2.4.1γ-聚谷氨酸

γ-聚谷氨酸是一種陰離子天然聚合物，其易溶于水、生物相容性好、可生物降解、可食用且對(duì)人體無(wú)毒。γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸、L-谷氨酸通過(guò)γ-酰胺鍵結(jié)合形成的一種多肽分子，它包含500～5 000 個(gè)谷氨酸單體，是納豆中黏性物質(zhì)的主要成分[52]。Hsieh等[53]將納豆激酶包埋在高分子質(zhì)量的鈉-γ-聚谷氨酸微膠囊中。雖然制備的微囊在模擬胃環(huán)境中的穩(wěn)定性不高，并且超過(guò)95%的酶活性喪失，但納豆激酶的貯存穩(wěn)定性得到了改善。

2.4.2 蟲(chóng)膠

蟲(chóng)膠是一種天然、可生物降解和可再生的昆蟲(chóng)源樹(shù)脂，它具有低透水性的優(yōu)點(diǎn)。Law等[54]將納豆激酶與蟲(chóng)膠溶液混合并加入氯化鈣交聯(lián)溶液中，形成嵌入酶的固體蟲(chóng)膠顆粒。結(jié)果表明，使用蟲(chóng)膠包埋納豆激酶的包埋率為87.2%，雖然包埋率與氯化鈣濃度無(wú)關(guān)，但酶的活性隨著氯化鈣濃度的增加而降低。

2.4.3 聚羥基丁酸

聚羥基丁酸（polyhydroxybutyrate，PHB）是由細(xì)菌合成的短鏈聚合物，具有生物相容性高、生物可降解、無(wú)刺激性、無(wú)免疫原性和組織相容性高等特殊性能。其可用于包埋蛋白質(zhì)類活性物質(zhì)以達(dá)到緩釋的效果，保護(hù)未釋放的蛋白質(zhì)不被降解。Deepak等[55]將納豆激酶固定在PHB納米顆粒上，提高了納豆激酶的穩(wěn)定性，并使其酶活力增加了20%。

2.4.4 多重自乳化給藥系統(tǒng)

多重自乳化給藥系統(tǒng)是油包水型乳液和親水性乳化劑的混合物在胃腸條件或常溫輕度攪拌條件下用水稀釋后自乳化而成的水/油/水（W/O/W）復(fù)合乳液，可以避免胃腸道中肽和蛋白質(zhì)藥物的失活和酶降解。與其他制劑相比，該系統(tǒng)藥物的吸收和藥理活性顯著提高。Wang Xiaona等[56]通過(guò)對(duì)油相、內(nèi)水相和乳化劑的種類和濃度進(jìn)行篩選，制備出負(fù)載納豆激酶的多重自乳化給藥系統(tǒng)。體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果表明，在多重自乳化給藥系統(tǒng)制劑中封裝納豆激酶可以防止其在胃中失活，從而使口服給藥獲得更好的釋放效率。該研究中納豆激酶的包封率為（86.8±8.2）%，但是藥物的釋放效果并不好，8 h只能釋放30%的納豆激酶。

2.4.5 多巴胺涂層的聚苯乙烯微球

Ye Wei等[57]通過(guò)多巴胺在聚苯乙烯微球上的氧化聚合制備微膠囊，然后將纖維蛋白原固定在聚多巴胺層的表面上，隨后利用四氫呋喃去除核心獲得微膠囊，納豆激酶通過(guò)擴(kuò)散加載到微膠囊中。該研究中納豆激酶的包埋率接近75%，其鹽水溶解活性和凝血指數(shù)證明所制備的微膠囊具有很高的抗血栓活性。

2.4.6 異丁烯酸-丙烯酸乙酯共聚物Eudragit?L 100-55

Law[58]、馬曉文[59]和鐘蕓[60]等都使用pH值敏感的腸溶材料Eudragit?L 100-55以及環(huán)境友好型的超臨界CO2流體替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑制備納豆激酶的腸溶微球。該材料不溶于酸性介質(zhì)，但可溶于pH 5.5以上的介質(zhì)，因此其能幫助藥物抵抗胃酸的作用，而在中性或微堿性環(huán)境中迅速溶解，使藥物得以快速釋放。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載藥微球在模擬胃酸（pH 1.2）環(huán)境中2 h僅釋放9.7%，并能保持近90%的活性狀態(tài)，在模擬腸液（pH 8.6）中4 h內(nèi)快速釋放90%。

2.4.7 磁性納米顆粒

Zhang Shaofei等[61]將磁性Fe3O4納米顆粒嵌入聚乳酸層中，之后將由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸（arginineglycine-aspartic-acid，RGD）組成的序列接枝到樹(shù)狀大分子上以合成Fe3O4-（4-PLA(G3)4）-RGD納米顆粒，最后將納豆激酶包埋進(jìn)納米顆粒中。在外部磁場(chǎng)的影響下，納米顆粒可以用于靶向溶栓，這可以減少納豆激酶注射的有效劑量，增加其生物靶點(diǎn)的局部濃度，并能促進(jìn)納豆激酶在人體內(nèi)的局部遞送。Liu Shuai等[62]通過(guò)共沉淀的方法制備磁性納米粒子，并用羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉修飾Fe3O4納米顆粒。

2.4.8 聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物

鄧柳艷等[63]通過(guò)雙乳液蒸發(fā)法，以聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polyethylene glycol-poly lactic-coglycolic acid，PEG-PLGA）和葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物（folic acid-polyethylene glycol-p-poly lacticco-glycolic acid，F(xiàn)A-PEG-PLGA）作為壁材制備納豆激酶微膠囊。體外模擬緩釋結(jié)果表明，經(jīng)胃環(huán)境（pH 2.0）作用2 h后，兩種微膠囊中超過(guò)60%的納豆激酶被保留，經(jīng)腸環(huán)境（pH 7.0）作用22 h緩釋效果良好。FA-PEGPLGA納豆激酶微膠囊表現(xiàn)出更好的吸收效果。鄧柳艷等[63]建立了Caco-2單層細(xì)胞模型，研究納豆激酶微膠囊體在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收效果。通過(guò)結(jié)果推測(cè)所制備的微膠囊易形成納米膠束，其顆粒小且兼有PEG與PLGA的親水和疏水性以及良好的生物相容性，從而促進(jìn)了納豆激酶微膠囊在小腸細(xì)胞中的吸收。PEG-PLGA及FA-PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊無(wú)明顯細(xì)胞毒性，在Caco-2單層細(xì)胞中均有很好的吸收效果；PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的主要吸收方式為被動(dòng)擴(kuò)散；FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的主要吸收方式為被動(dòng)擴(kuò)散，此外還可能存在葉酸載體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)其在Caco-2細(xì)胞中的吸收。該研究為通過(guò)葉酸靶向作用促進(jìn)納豆激酶的細(xì)胞吸收、提高納豆激酶口服利用度提供了依據(jù)。

2.4.9 聚谷氨酸肽樹(shù)狀聚合物

Huang Mengjie等[64]通過(guò)結(jié)合肽樹(shù)狀大分子來(lái)修飾納豆激酶，以提高其酶活性。其首先合成第2代聚谷氨酸樹(shù)狀大分子，然后將靶向分子RGD通過(guò)羧基和氨基反應(yīng)連接到樹(shù)枝狀大分子聚合物上。隨后，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將聚谷氨酸樹(shù)狀大分子顆粒結(jié)合到納豆激酶的周邊，并用作納豆激酶的載體。

Wu Can等[65]采用發(fā)散收斂法合成了聚賴氨酸樹(shù)枝狀聚合物，納豆激酶通過(guò)氫鍵和范德華力自發(fā)地與聚賴氨酸樹(shù)枝狀聚合物形成納米復(fù)合材料。體外溶栓實(shí)驗(yàn)證明，納豆激酶/聚賴氨酸樹(shù)枝狀聚合物納米復(fù)合材料可以緩慢地將納豆激酶釋放到血液中，從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，并減少過(guò)度溶栓引起的副作用。與游離納豆激酶相比，納豆激酶/聚賴氨酸樹(shù)枝狀聚合物納米復(fù)合材料具有更好的體外穩(wěn)定性。此外，聚賴氨酸樹(shù)枝狀聚合物表現(xiàn)出良好的血液相容性和細(xì)胞相容性。不同種類的納豆激酶功能遞送載體如表1所示。

表1 納豆激酶的功能遞送載體Table 1 Functional vectors for nattokinase delivery

3 結(jié) 語(yǔ)

目前，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明納豆激酶能夠口服通過(guò)小腸吸收進(jìn)入到血液循環(huán)中，但是對(duì)于其具體的吸收利用機(jī)制尚未完全闡明，納豆激酶與小腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)之間的關(guān)系有待深入研究。納豆激酶在腸液中的釋放及其體內(nèi)吸收可能部分依賴于胰酶對(duì)納豆激酶的部分降解，且降解產(chǎn)生了大量相對(duì)分子質(zhì)量不等的片段，這些片段仍然具有纖溶活性，而且可能是納豆激酶體內(nèi)吸收的一個(gè)重要形式[50]。篩選出具有纖溶活性的片段遞送進(jìn)入人體發(fā)揮溶栓作用是值得深入研究的課題。

目前市面上已有的納豆激酶相關(guān)產(chǎn)品多為醫(yī)藥用途的藥品和營(yíng)養(yǎng)品，有效的功能食品相關(guān)產(chǎn)品較少，而現(xiàn)有的一部分納豆激酶功能遞送載體可能含有有機(jī)試劑等對(duì)人體有危害的物質(zhì)，并不符合食品添加劑相關(guān)法規(guī)要求[66]，因此，開(kāi)發(fā)無(wú)毒副作用的食品級(jí)納豆激酶功能遞送載體對(duì)于納豆激酶的深度開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，許多研究人員已經(jīng)研究了納豆激酶的功能遞送系統(tǒng)，但大多數(shù)研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段。未來(lái)需要進(jìn)行臨床研究以確定納豆激酶與其功能遞送載體共同使用的毒理學(xué)安全性。同時(shí)還需要優(yōu)化制備過(guò)程和成本，確定適合不同功能遞送系統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)的設(shè)計(jì)方案和方法。

納豆激酶功能遞送載體可以保護(hù)納豆激酶在胃內(nèi)不被降解并在腸內(nèi)穩(wěn)定釋放，發(fā)揮其溶栓作用，但現(xiàn)有的納豆激酶功能遞送載體存在缺點(diǎn)。脂質(zhì)體獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性使其能夠包裹水溶性、油溶性和兩親性物質(zhì)。然而，只有少數(shù)研究聚焦納豆激酶脂質(zhì)體的制備。已有研究表明脂質(zhì)體共包埋薏苡籽油和β-胡蘿卜素比負(fù)載單一生物活性物質(zhì)的脂體具有更高的抗癌和抗氧化活性[67]。未來(lái)可以制備與其他活性物質(zhì)共包埋的納豆激酶脂質(zhì)體，并探索其是否是一種提高納豆激酶穩(wěn)定性和溶栓活性的新方法。用于乳液遞送系統(tǒng)的表面活性乳化劑通常有毒，且穩(wěn)定性較差，容易分層和絮凝。未來(lái)可以開(kāi)發(fā)新的食品級(jí)乳化劑，或?qū)θ橐哼M(jìn)行改性。單一多糖類或蛋白質(zhì)類壁材制備的功能遞送載體在貯存和遞送方面會(huì)有一定的限制，而與其他物質(zhì)復(fù)配后形成復(fù)合壁材能夠彌補(bǔ)單一壁材的缺點(diǎn)，提高包埋效率和保護(hù)效果，未來(lái)可以尋找更合適的復(fù)配材料，以制備穩(wěn)定、包埋率高且保護(hù)效果好的納豆激酶功能遞送載體。