高功率脈沖微波協同花色苷對大豆分離蛋白理化特性的影響及其在蛋糕中的應用

吳 寒，劉浩男,2，邸清茹,3，夏依旦·買買提，劉小莉,2,3,*，周劍忠,2,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；3.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

大豆分離蛋白（soybean protein isolates，SPI）是優質蛋白質的主要來源，成本低廉，具有很高的營養價值，利于消化，且不含膽固醇，常作為食品配料廣泛應用于食品工業[1]。SPI按離心沉降速率可分為2S（20%）、7S（40%）、11S（30%）、15S（10%），其中7S和11S是主要成分。隨著人們對多功能活性蛋白質需求的增長，越來越多的研究開始關注如何賦予SPI更高的生理活性。通過化學結構修飾從而使SPI的理化特性改變是目前常用的研究手段，主要包括物理場改性、非共價互作改性、糖基化改性和多種方式結合的改性[2]。

近年來，利用多酚與蛋白相互作用改善蛋白質的功能特性已成為研究熱點。藍莓花色苷（blackberry anthocyanins，BANs）是一種多酚類物質，具有豐富的生物學活性，例如抗氧化、提高免疫系統、抑菌活性等[3]。BANs與SPI相互作用能夠增強SPI的功能活性，具有廣闊的應用前景。研究表明，除了溫度、pH值、離子濃度等外部因素會影響花色苷與蛋白相互作用，一些物理加工技術，如超聲、高壓、脈沖電場等，也可以通過改變蛋白質結構與功能影響花色苷與蛋白的相互結合。Wang Yilun等[4]利用超聲處理SPI-山楂黃酮復合物，結果表明超聲可以有效減少復合物的α-螺旋和無規卷曲結構含量，增加β-轉角和β-折疊結構含量，使蛋白質熒光猝滅增強。張鐵華[5]研究發現，高壓脈沖電場處理時，合適的脈沖強度能夠有效改善蛋白質的起泡性和乳化性，但是隨著脈沖強度的升高，蛋白逐漸發生聚集，導致其溶解性降低。

高功率脈沖微波（high power pulse microwave，HPPM）作為一種新型的食品加工技術，可通過將高壓脈沖加在磁控管上產生周期性高頻脈沖微波從而作用于樣品[6]，具有平均功率低、耗能小、效率高、瞬時高能和間歇作用的特點[7]。由于HPPM兼具電磁脈沖和微波的相關特點，并且瞬時功率較高，還可對生物系統產生一定效應[8]。呂士杰等[9]的研究表明，HPPM輻射可造成動物體海馬組織結構改變。Patel等[10]采用新型脈沖微波-真空組合技術開發了一種山藥加速滲透脫水的工藝。張亞新等[6]利用氣調包裝協同HPPM處理蟹肉，可以有效延長蟹肉貯藏期。然而，HPPM協同花色苷對蛋白質進行修飾從而影響大豆蛋白功能特性的研究尚鮮見報道。

本研究主要利用HPPM物理場作為強化傳質的手段，研究其對BANs改性SPI方面所發揮的作用，一方面探究HPPM對SPI-BANs復合物加工特性和功能活性的影響；另一方面，進一步明確新型大豆蛋白配料——高功率脈沖微波-大豆分離蛋白-花色苷（HPPM-SPI-BANs）復合物在戚風蛋糕中的應用效果，為深入探討物理場協同改性大分子蛋白的作用機制提供一定的理論參考，同時為擴大HPPM在食品領域的應用范圍提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（食品級，純度90.56%） 河南林邦生物科技公司；花色苷（純度54%）由實驗室從黑莓果實中提取純化所得；雞蛋、低筋面粉、白砂糖、玉米油、純牛奶南京蘇果社區超市；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，D P P H）、三吡啶基三嗪 美國S i g m a 公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸亞鐵、氯化鐵 國藥控股化學試劑有限公司；所有有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HPPM殺菌機由江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程創新團隊與南京翀電科技有限公司聯合研制；Epoch 2酶標儀 美國Bio-Tek公司；PB-10酸度計德國Sartorius科學儀器有限公司；K35FK602烤箱 浙江蘇泊爾有限公司；TMS-Touch質構儀 美國FTC公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs復合物制備

根據前期實驗的優化結果，將SPI溶于0.1 mol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液中，終質量濃度為0.5 mg/mL，將BANs溶于0.1 mol/L pH 3.0檸檬酸緩沖液中，以質量比1∶1混合SPI與BANs，室溫下避光攪拌12 h，得到SPIBANs復合物。之后在脈沖功率750 kW、脈沖寬度1.5 μs條件下，選擇脈沖頻率60 Hz處理15 min，得到HPPMSPI-BANs復合物。

1.3.2 溶解性測定

依據江連洲[11]和Meng Yueyue[12]等的方法修改后進行溶解性的測定，將SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs溶液在10 000×g條件下離心20 min，適當稀釋離心前SPIBANs溶液和稀釋后收集的上清液，采用考馬斯亮藍法[13]測定蛋白質量濃度。按公式（1）計算溶解性。

式中：ρsp為離心后上清液蛋白質量濃度/（mg/mL）；ρtp為離心前樣液總蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.3 起泡性和泡沫穩定性測定

起泡性和泡沫穩定性參照Sui Xiaonan等[14]的方法進行測定。將凍干后的SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs分別配成10 mg/mL溶液，依次記錄體積。之后，將SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs溶液均質1 min，記錄樣品泡沫的最初體積，靜置15 min后，再次記錄泡沫體積。按公式（2）、（3）分別計算起泡性和泡沫穩定性。

式中：V0為樣品體積/mL；V0為最初泡沫體積/mL；V15為靜置15 min后泡沫體積/mL。

1.3.4 乳化性和乳化穩定性測定

乳化性和乳化穩定性依據Malik等[15]的方法進行測定。分別將凍干的SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs配成10 mg/mL溶液，與菜籽油以3∶1（V/V）比例混合，各均質1 min，吸取其底部乳液50 μL，加入質量分數0.1%十二烷基硫酸鈉溶液稀釋250 倍，混合均勻，測定500 nm波長處吸光度，靜置30 min后再次測定吸光度，空白對照為十二烷基硫酸鈉溶液。按公式（4）和公式（5）分別計算乳化性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）。

式中：N為稀釋倍數；ρ為樣液蛋白質量濃度/（g/mL）；V為乳化液中油相體積分數/%；A0為最初乳液吸光度；A30為靜置30 min后乳液吸光度。

1.3.5 戚風蛋糕制作工藝

根據預實驗，以綜合感官評分為指標，優化得到制作工藝。混合蛋黃60 g、牛奶30 g、玉米油40 g和白砂糖10 g，加入低筋面粉65 g和泡打粉5 g，攪拌制成蛋糊。在蛋清液中替換10%（以蛋清液體系體積計）HPPM-SPIBANs溶液，將獲得的蛋清蛋白溶液225 g與白砂糖50 g混勻，快速打發蛋白膏使其呈峰狀。將蛋白膏倒入蛋糊，攪拌成蛋糕糊。烤箱溫度先調至130 ℃，烘烤80 min，再調至150 ℃，烘烤20 min，蛋糕倒扣冷卻，脫模。添加HPPM-SPI-BANs的蛋糕標記為C-HSB，僅添加蛋清和SPI的蛋糕分別標記為C-E和C-S。

1.3.6 焙烤損失率和含水率測定

通過測定蛋糕糊的質量和焙烤后蛋糕的質量，按公式（6）計算蛋糕的焙烤損失率。

式中：ms為蛋糕糊質量/g；mc為焙烤后蛋糕質量/g。

待蛋糕出爐，冷卻至室溫。參照GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[16]的方法測定含水率。

1.3.7 質構特性分析

新鮮蛋糕切成2 cm×4 cm×4 cm均勻方塊，確保表面和底面平整，使用配備P/36R探頭的質構分析儀進行測試。測試速率120 mm/min、形變量50%，保持時間3s。

1.3.8 抗氧化能力測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除活性測定

DPPH自由基清除率根據Dai Yiqiang等[17]的方法測定，并稍作修改。將凍干后的SPI、SPI-BANs和HPPMSPI-BANs分別配成10 mg/mL溶液，作為樣液待用；C-HSB、C-S和C-E經過干燥粉碎，以體積比1∶10加入體積分數75%醇溶液提取2 h，8 000 r/min離心10 min，收集上清液待用。吸取100 μL樣液，與100 μL 0.4 mmol/L DPPH溶液混勻，室溫下暗反應30 min，測定517 nm波長處吸光度，空白對照用pH 6.0的檸檬酸緩沖液替代樣液。按公式（7）計算DPPH自由基清除率。

式中：As為樣液反應后吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.8.2 鐵離子還原力測定

鐵離子還原力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）根據Chen Gang等[18]報道的方法進行測定。混合100 mL 0.3 mol/L pH 3.6醋酸緩沖液、10 mL 10 mmol/L TPTZ溶液和10 mL 20 mmol/L氯化鐵溶液，制備FRAP試劑。取1.3.8.1節100 μL樣液與500 μL FRAP試劑混合均勻，37 ℃水浴反應10 min，測定593 nm波長處吸光度，用pH 6.0檸檬酸緩沖液代替樣品作空白對照，以不同濃度FeSO4溶液代替樣品繪制得到標準曲線。FRAP用FeSO4當量表示。

1.3.9 老化速率測定

根據唐夢琪[19]報道的方法稍作修改，測定老化速率。將制備得到的蛋糕放于室溫，貯藏第0、1、2、3天時分別測定硬度，采用Avrami方程（公式（8））對老化速率進行計算與分析。

式中：指數n代表有關晶核特性及晶體生長過程的信息；k表示成核與晶體成長速度的復合作用；R表示淀粉的老化度，其可用硬度F代替。改寫后的Avrami方程如公式（9）所示，等式兩邊取對數可得公式（10）。

式中：F0為烘烤后蛋糕硬度；Ft為儲藏t天時蛋糕硬度；F∞為蛋糕的極限老化硬度；n為Avrami指數；k為蛋糕老化速率。

將在室溫條件分別儲藏0、1、2、3 d的蛋糕硬度分別代入Avrami方程，根據公式（9）計算得到第t天的老化度，對lnt進行線性回歸分析，得到老化速率k和Avrami指數n。

1.4 數據處理與分析

所有數據均為3 次重復實驗所得，結果以平均值±標準差表示，應用SPSS Statistics 26軟件對結果進行顯著性分析（單因素方差分析法和Duncan法）和相關性分析（Pearson法），以P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 HPPM協同花色苷對SPI溶解性的影響

溶解性是蛋白質在食品體系中發揮功能的先決條件，通常受到氨基酸組成和序列、pH值及多糖和其他化合物（如多酚）的影響。如圖1所示，SPI溶解性為42.44%，這與Deak等[20]所報道的SPI溶解性為42.62%的結果接近。與對照SPI相比，添加花色苷后，SPI-BANs復合物的溶解性顯著增加了0.39 倍（P＜0.05），這可能是花色苷與大豆蛋白相互作用，使蛋白質結構改變，多肽鏈展開，疏水基團暴露所造成的。Ozdal[21]和Cao Yanyun[22]等也發現，隨著蛋白質與酚類化合物的結合，蛋白質疏水基團雖有所暴露，但隨著多酚濃度增加，表面疏水性降低，蛋白電荷發生改變，從而影響了蛋白質的溶解性。此外，在HPPM處理條件下，HPPM-SPI-BANs復合物的溶解性提高了1.11 倍，這與Chen Gang等[18]的研究結果相一致，超高壓等非熱加工技術也可以提高蛋白質-多酚復合物的溶解性，表明物理場處理可能破壞蛋白質的二級結構，使β-折疊和α-螺旋發生改變，此時水分子更易進入蛋白質內部與其分子發生水和作用，提高了蛋白質的溶解性。

圖1 不同處理方式下SPI的溶解性Fig.1 Effects of different treatments on solubility of SPI

2.2 HPPM波協同花色苷對SPI功能特性的影響

2.2.1 HPPM波協同花色苷對SPI起泡性及泡沫穩定性的影響

基于在空氣-水界面的快速擴散和結構展開，蛋白質表面張力下降，產生發泡行為[22]，然而，空間構象和表面電荷密度能夠改變SPI的二級和三級結構，影響蛋白質的起泡功能[23]。如圖2所示，SPI-BANs復合物的泡沫穩定性顯著高于SPI（P＜0.05），這可能與蛋白質和花色苷互作后蛋白結構改變有關。Ye Jiangping等[24]的研究也發現了類似現象，蘆丁-SPI復合物比單獨SPI具有更高的發泡能力和泡沫穩定性。此外，HPPM-SPIBANs的起泡性和泡沫穩定性均顯著高于SPI和SPI-BANs（P＜0.05），高功率脈沖微波處理可能使得蛋白質結構柔韌性增強，具有更低的表面張力，復合物可在空氣-液體界面形成更多彈性氣泡，吸附在氣-水界面上，說明HPPM處理協同花色苷能夠更有效地改善SPI的起泡功能。

圖2 不同處理方式下SPI的起泡能力Fig.2 Effects of different treatments on foaming capacity of SPI

2.2.2 HPPM波協同花色苷對SPI乳化性及乳化穩定性的影響

通常，蛋白質的乳化能力可以歸因于以下兩個方面：一是蛋白在油滴周圍迅速擴散到油-水界面形成界面膜的能力；二是蛋白通過部分展開和重新排列界面，使界面張力降低、乳液穩定和防止絮凝或聚結的能力[25]。圖3所示為SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs的乳化性和乳化穩定性分析結果。相同質量濃度下，SPI-BANs的EAI和ESI均顯著高于SPI（P＜0.05），這可能是蛋白質與花色苷結合使蛋白質結構改變，液滴間空間斥力增加和表面電荷變化所致。類似地，Zhang Shu等[26]通過熒光光譜學分析明確了添加適當多酚可以使綠豆球蛋白α-螺旋、β-折疊和β-轉角比例增加，無規卷曲比例減少，提高蛋白質的EAI。對于HPPM-SPI-BANs，其EAI和ESI則顯著高于SPI-BANs，表明HPPM處理能使蛋白質的結構舒展，鏈節變得更為柔順，有利于在界面上進行分子有序重排，同時增強蛋白質與花色苷的分子間作用力，提高蛋白質的親水親油性和乳化能力。

圖3 不同處理方式下SPI的乳化能力Fig.3 Effects of different treatments on emulsifying capacity of SPI

2.3 HPPM波協同花色苷對SPI抗氧化活性的影響

對SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs三者的抗氧化能力進行熱圖分析，結果如圖4所示。熱圖中顏色的深淺表示樣品抗氧化能力的強弱，其中，SPI幾乎不具備抗氧化能力，在DPPH清除自由基能力方面，HPPM-SPIBANs的清除能力明顯高于SPI和SPI-BANs，且SPI-BANs也明顯高于SPI（P＜0.05）。鐵離子還原能力在3 種樣品中的變化趨勢與DPPH自由基清除能力基本一致。由此可見，復合物抗氧化能力的增強主要來源于花色苷的作用，其抗氧化活性較強，通過與蛋白質相互結合可以賦予SPI更高的功能活性[3]。此外，HPPM-SPI-BANs的抗氧化活性均明顯高于SPI-BANs，這是因為HPPM等物理場可有效促進SPI與BANs結合，提高復合物中花色苷結合率，同時使蛋白質中掩埋的還原性基團更多地暴露，從而更大程度上增強復合物的抗氧化活性[4]。綜上，通過HPPM協同BANs處理SPI，能夠更有效地賦予SPI生理活性方面的功能，制備得到的復合物HPPM-SPI-BANs也可作為新型蛋白配料應用于食品工業中，以強化產品的抗氧化活性。

圖4 不同處理方式下SPI的體外抗氧化能力Fig.4 Effects of different treatments on antioxidant capacities of SPI

2.4 HPPM-SPI-BANs對蛋糕烘焙特性的影響

由于烘烤后蛋糕的大部分損失來源于水分，常用烘焙損失率評判蛋糕烘烤前后的質量變化，直觀地反映蛋糕制備過程中水分的散發情況，并且焙烤損失率直接影響著產品的經濟效益[19]。由表1可知，添加HPPM-SPIBANs對蛋糕的水分散失有顯著抑制作用（P＜0.05）。與此同時，戚風蛋糕的正常含水率應在35%～44%之間，最佳含水率應在39%～40%之間[27]，利用具有更高起泡和乳化能力的HPPM-SPI-BANs替代部分蛋清蛋白加入蛋糕中，可使蛋糕的含水率增加至39.25%，處于含水率最佳范圍，蛋糕的口感和風味更佳，焙烤損失率由30.14%顯著降至26.88%（P＜0.05）。

表1 不同蛋糕的焙烤損失率、含水率和質構特性Table 1 Baking loss rate, moisture content and textural properties of different cakes

質構特性也是衡量蛋糕品質的重要指標，HPPMSPI-BANs對蛋糕質構特性的影響情況如表1所示，包括硬度、內聚性、彈性和咀嚼性。通常，硬度是指使食品發生形變所需要的力，與蛋糕品質呈負相關性，蛋糕越硬口感越差。HPPM-SPI-BANs的添加可使蛋糕內部網孔變大，對力的支撐變弱，顯著降低蛋糕硬度（由4.28 N減小至4.12 N（P＜0.05））。對于咀嚼性而言，其也與蛋糕品質呈負相關性，當添加HPPM-SPI-BANs時，蛋糕的咀嚼性顯著下降（P＜0.05），口感更加綿軟。相比于SPI，HPPM-SPI-BANs的添加還可以顯著提高蛋糕的內聚性和彈性，分別由0.56和8.69提高至0.62和10.47（P＜0.05），說明蛋糕內在結合力有所提升，內部質地更加豐富和具有彈性。研究表明，蛋糕的硬度變化與淀粉分子的老化有直接關系[28]；戚風蛋糕的感官品質在一定程度上取決于其硬度與咀嚼性，芯部組織的松軟程度與硬度和咀嚼性成反比，與彈性成正比[29]。以上結果表明，添加HPPM-SPI-BANs可以使戚風蛋糕的焙烤損失率、含水率及硬度相比于蛋糕C-E和C-S得到明顯改善，且內聚性、彈性和咀嚼性明顯優于蛋糕C-S，蛋糕品質得到提升。

2.5 HPPM-SPI-BANs對蛋糕抗氧化活性的影響

由圖5可見，添加HPPM-SPI-BANs替代部分蛋清后，蛋糕提取物的抗氧化能力明顯高于未添加HPPMSPI-BANs的蛋糕C-E和C-S，其中DPPH自由基清除率分別升高了3.56 倍和1.29 倍。在鐵離子還原能力方面，添加HPPM-SPI-BANs的蛋糕分別是蛋糕C-E和C-S的3.79 倍和4.36 倍。新型蛋白配料HPPM-SPI-BANs中因含有活性成分花色苷而具有良好的抗氧化能力，除了能夠改善上述對蛋糕烘焙品質外，還賦予了蛋糕較強的功能活性。此前的研究表明，SPI替代部分蛋清加入蛋糕，可以平衡產品的氨基酸水平，提高蛋糕的營養價值[30]，HPPM-SPI-BANs的添加不僅改善了蛋糕口感，還能提升蛋糕附加值，使產品能夠滿足當下消費市場提出的更高要求。

圖5 不同蛋糕體外抗氧化能力Fig.5 Antioxidant capacities of different cakes

2.6 HPPM-SPI-BANs對蛋糕貯藏期品質的影響

2.6.1 HPPM-SPI-BANs對蛋糕水分質量分數和硬度的影響

在貯藏期間，蛋糕水分質量分數和硬度是影響蛋糕品質最直接的指標，也是間接反映蛋糕老化情況的重要指標，隨著時間延長，老化后的蛋糕可能口感變差、硬度增加。由于戚風蛋糕屬于短保質期烘焙食品，伴隨時間的加倍延長會出現菌落生長等對保藏進程不利的影響，因此本實驗中設定短時間儲藏期，并對不同蛋糕品質進行比較。通過測定蛋糕存放不同時間的水分質量分數和硬度，可以確定HPPM-SPI-BANs對蛋糕貯藏品質的基本影響。從圖6A可以看出，添加HPPM-SPI-BANs可以提高蛋糕的水分質量分數，使蛋糕的含水量保持較高的狀態，在1～3 d內均高于蛋糕C-E和C-S，這對于防止蛋糕硬度增加有積極作用。如圖6B所示，不同蛋糕的硬度在貯藏期內均明顯增加，最終達到4.75～5.25 N，并且添加HPPM-SPI-BANs后，蛋糕的硬度變化趨勢比蛋糕C-E和C-S有所減緩，始終維持在最低水平，這說明HPPMSPI-BANs可以有效抵抗蛋糕在貯藏過程中存在的淀粉回生等問題，從而改善戚風蛋糕的貯藏品質。夏爽[1]利用超聲和糖基化改性大豆蛋白，并將其應用于重油蛋糕中，也改善了蛋糕的貨架期品質。計曉曼[27]在蛋清蛋糕中加入酶改性的大豆蛋白，也使產品在儲藏期間的質構特性和感官評分均得到提升。

圖6 不同蛋糕的貯藏期水分質量分數和硬度變化Fig.6 Changes in water content and hardness of different cakes during storage

2.6.2 HPPM-SPI-BANs對蛋糕老化速率的影響

蛋糕的淀粉老化又稱淀粉重結晶，可分為晶體的生成、生長與穩定3 個不同階段，多用Avrami方程研究淀粉老化的動力學模型[31-32]，明確食物在儲藏期淀粉老化規律。由于淀粉老化過程中的結晶具有高分子聚合物結晶的特點，可對蛋糕芯部在儲藏期的老化晶核生長模式進行分析，結果如表2所示。在一定溫度范圍內（-4～35 ℃），Avrami指數n可被分為2 個區間段，晶體生長時的維數和其成核時間決定了該值的大小[33]。當n＜1時，結晶以瞬間成核為主；當1＜n≤2時，結晶以自發成核方式為主[34]。表2中不同蛋糕的n均處于（1,2）區間，說明儲藏期蛋糕芯內部發生的支鏈淀粉重結晶現象主要是自發成核形成的。另外，老化速率常數k則與晶體生長的快慢及晶核密度密切相關，能夠提供一系列晶核形成和生長進程的相關信息[33]。添加HPPMSPI-BANs使蛋糕的k值明顯減小，僅為0.12，分別小于蛋糕C-E和C-S，表明HPPM-SPI-BANs可以有效減緩蛋糕芯部的老化速度，使其相對不易發生老化。

表2 不同蛋糕儲藏期的芯部老化晶核生長模式Table 2 Growth pattern of aging crystal nuclei in core of different cakes during storage

3 結 論

本實驗基于SPI與花色苷相互作用，結合了HPPM物理場進行處理，明確了HPPM協同花色苷能夠更有效地提高SPI的物理特性（如溶解性、起泡性、泡沫穩定性、乳化性和乳化穩定性），得到的HPPM-SPI-BANs復合物具有更高的抗氧化能力，賦予了SPI可被開發成為新型功能性食品配料的潛力。通過將HPPM-SPI-BANs應用于蛋糕的制作過程，證實了上述復合物能夠明顯改善戚風蛋糕的質構特性等烘焙特性，提高其功能活性，以及抑制貯藏期內水分散失，延緩蛋糕的老化速率。本研究有利于進一步實現植物蛋白質資源的綜合利用，并為后續逐步擴大HPPM等新型非熱加工技術的應用范圍提供理論和科學依據。