蛋白質-香氣化合物結合作用的研究方法及影響因素研究進展

陳 臣，周琪琪，于海燕，婁新曼，李 永，田懷香*

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

香氣是食品風味的重要組成部分，是食品特征風味的來源之一。香氣化合物的分子質量相對較小（＜400 Da），主要包括醛類、酮類、醇類、酯類、羧酸、含硫化合物、呋喃和吡嗪等[1]。蛋白質被公認為食品中的營養和功能成分，它不僅為人體提供必需的氨基酸，而且具有發泡、乳化、膠凝和風味結合等功能特性。除了作為食品的風味前體物質外，蛋白質可以通過物理截留方式抑制香氣化合物的動態變化，或通過各種相互作用力影響食品中香氣化合物的保留與釋放[2]。

蛋白質與香氣化合物之間的結合作用主要包括非共價鍵合、共價鍵合和傳質效應，但由于食品組織結構的復雜性以及蛋白質和香氣化合物的自身特性和結構差異，兩者結合作用的本質與規律性研究仍是一個系統且復雜的過程。蛋白質對揮發性香氣成分的結合作用主要取決于香氣化合物和蛋白質自身的性質，但食品基質中調味用糖、油脂和鹽等配料也會通過改變蛋白質的聚集狀態和構象等特性，從而影響蛋白質-香氣化合物的結合作用程度[3]。此外，香氣化合物在食品熱加工過程中容易與蛋白質發生解離，損失較快，從而導致風味強度減弱；食品中某些成分氧化產生異味物質與蛋白質發生結合，這些反應均會縮短產品的保質期[4]。由此可見，如何使蛋白質以最佳的形式結合和釋放揮發性成分并保持產品理想的風味顯得尤為重要。因此，了解蛋白基質與香氣化合物的結合作用，開發新的方法或模型來穩定香氣化合物的結合并控制釋放，對保持食品的感官品質具有重要意義，同時也能為食品工業快速適應市場對營養、美味食品的需求提供技術基礎。

基于此，本文綜述了蛋白質與香氣化合物的結合機制、測定方法和常用理論模型的研究進展，并探討了影響蛋白質-香氣化合物結合作用的主要因素。在此基礎上，提出了改善風味與蛋白質結合能力的對策，以期為利用新工藝生產風味優良的健康食品提供思路。

1 蛋白質與香氣化合物的結合作用機制

根據結合方式的不同，蛋白質主要通過非共價鍵合、共價鍵合和傳質效應3 種方式實現對揮發性成分的吸附[5]（圖1），進而改變頂空中香氣化合物的濃度。其中，蛋白質與香氣化合物的非共價鍵合作用主要由疏水相互作用、范德華力、氫鍵和靜電相互作用力來提供，這些作用方式均是可逆結合，常應用于減少加工過程的風味損失，并使風味成分在食用過程中重新釋放[6]。Bi Shuang等[7]對3 種特定香氣化合物與豌豆蛋白的結合類型進行研究，發現豌豆蛋白與正己醛的非共價鍵合作用主要是由氫鍵提供的結合作用力，而其與(E)-2-辛烯醛和(Z)-2-戊烯-1-醇的作用方式主要是疏水相互作用。對食品蛋白基質和關鍵香氣貢獻組分結合作用特性進行解析，可為富含蛋白食品風味的調控以及感官品質的提高奠定研究基礎。

圖1 蛋白質與香氣化合物結合作用機制Fig.1 Binding mechanism between proteins and aroma compounds

蛋白質-香氣化合物結合過程中存在可逆的非共價鍵合作用和不可逆的共價鍵合作用。共價鍵合作用主要包括醛基（—CHO）、羰基（C＝O）與氨基酸殘基（—NH2和—SH）的共價交聯[8]。研究表明，隨著胰蛋白酶含量的增加，肌球蛋白對醛、酮類化合物的吸附能力增強，主要是由于氨基活性、巰基含量的增加等導致蛋白質的二級結構展開，從而增強了蛋白與揮發性成分的結合行為[9]。含硫氨基酸中的巰基既可以參與維持蛋白質結構穩定的二硫鍵的形成，也可以與香氣化合物發生共價結合[8]。另外，賴氨酸殘基側鏈的ε-氨基也會與醛類化合物通過形成席夫堿發生結合。Anantharamkrishnan等[10]研究發現，乳蛋白與醛類物質、硫醇和呋喃之間可通過席夫堿、二硫鍵的生成和邁克爾加成反應發生共價鍵合。此外，一些胺類揮發物與天冬氨酸、谷氨酸的末端羧基之間形成酰胺鍵，也屬于共價鍵合[11]。這些結合作用的形成速度或慢或快，均能夠導致食品風味特征的變化。

香氣化合物在不同相之間的傳質阻力會受到基質質地與微觀結構的影響，進而導致分配系數和分子遷移率有所不同。蛋白基質黏度的增加或形成的凝膠結構均會產生傳質效應，從而減緩香氣物質在食用過程中的釋放[12]。其中，增加黏度不僅會阻礙食品組分的混合，而且會阻礙香氣化合物在口腔中的流動，從而降低揮發性物質釋放到口腔的表面濃度[13]。此外，蛋白質發生凝膠化也會減少風味物質的釋放，從而導致香氣強度降低。不同種類的食品球狀蛋白（如乳清蛋白和大豆球蛋白等）加熱后發生變性，結構展開，通過暴露的活性位點相互作用，形成具有三維網絡結構的凝膠，進而對香氣化合物產生物理截留[14]。因此，通過改變揮發性成分的傳質阻力可在一定程度上改變風味的整體平衡，最終對風味的釋放產生有利影響。

2 蛋白質與香氣化合物結合作用的研究方法與常用理論模型

依據分析原理，可將蛋白質-香氣化合物結合作用的研究方法大致分為基于香氣化合物頂空濃度、基于蛋白質構象變化以及基于蛋白分子與香氣配體間結合位置的測定方法。其中，通過監測體系中香氣化合物頂空濃度和蛋白質構象變化的測定方法往往需要理論模型加以輔助分析，進而反映蛋白質-香氣化合物的結合作用程度。此外，新興的分子對接模擬技術能夠實現蛋白質-香氣化合物結合作用位點和作用方式的可視化，從而直觀地展現蛋白質與香氣配體間的結合作用。因此，上述4 種研究方法與理論模型是定性和定量分析某種蛋白質和特定香氣物質結合作用的方法基礎。

2.1 基于香氣化合物濃度的測定方法

香氣化合物在頂空中的濃度可以預估人在進食過程中的風味感知程度，頂空分析法基于氣-液分配系數，結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析被廣泛應用于去香食品基質對香氣化合物結合能力的研究。常用方法主要包括靜態頂空（static headspace，SH）分析法和頂空-固相微萃取（headspace solid-phase micro-extraction，SPME）法[15]。

采用SH法對蛋白質-香氣物質結合進行分析，基于香氣化合物與蛋白質的結合親和力（K1）以及氣相與水相之間的風味分配系數（K2）。Xu Jiao等[16]通過SH法研究發現葉醇、檸檬烯以及丁二酮的保留率隨大豆分離蛋白體系中所添加黃原膠濃度的增加而顯著改變。Guo Jun等[17]利用SH法聯合氣相色譜測定香氣化合物濃度，發現香茅醛、丙酸香茅酯、乙酸香茅酯和香茅醇濃度較高時（0.4～1.6 mmol/L）與大豆分離蛋白作用結合能較高，并產生新的結合位點，且兩者為非線性結合。

SPME-GC/MS法能夠測定食品中揮發性風味成分的濃度，并通過分析模型擬合，以計算出蛋白質內部結合位點個數（n）和結合常數（K）值，被廣泛應用于研究蛋白質與香氣化合物的結合作用。當香氣物質與水溶液中的蛋白質結合時（圖2），頂空中揮發物質的濃度發生變化，這可以通過色譜圖中峰面積的變化來監測。Wang Haitang等[18]基于SPME-GC/MS方法研究了乙酯類物質（乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯）與肌原纖維蛋白的結合作用。結果顯示，隨著肌原纖維蛋白濃度的增加，二者的結合能力顯著增強，并且這4 種酯類物質與肌原纖維蛋白的結合能力依次為辛酸乙酯＞己酸乙酯＞丁酸乙酯＞乙酸乙酯。Han Zhong等[19]借助該方法發現，肌原纖維蛋白與2-辛酮的結合能力顯著高于2-庚酮和2-戊酮，這可能是由于香氣化合物的碳鏈越長、結合位點越多，其與蛋白質的結合能力就越高。

圖2 基于頂空中香氣化合物濃度測定蛋白質-香氣化合物結合作用示意圖[20]Fig.2 Schematic diagram of protein-aroma binding effect in the determination of aroma compound concentrations in headspace[20]

2.2 基于蛋白質構象變化的測定方法

當香氣化合物分子帶有極性基團時，在與蛋白結合時會引起蛋白質構象的改變。蛋白質與香氣物質的結合作用通常采用結合位點n、結合常數K以及分配系數Ka、熵變ΔS、焓變ΔH和吉布斯自由能ΔG等熱力學參數來表征。因此，可以使用多光譜技術來闡明活性結合位點和結合作用類型，常用技術主要包括紫外-可見吸收光譜、熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、圓二色光譜、傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜等技術（表1）。

表1 基于蛋白質構象變化的蛋白質-香氣化合物結合作用的測定方法比較Table 1 Comparison of methods for determination of protein-aroma compound binding based on protein conformational changes

蛋白分子結合香氣化合物前后的紫外-可見吸收光譜變化能夠反映蛋白質的色氨酸和酪氨酸殘基周圍微環境的變化情況，從而可判斷蛋白分子與香氣化合物是否發生了結合作用。Yu Xia等[21]發現牛血清白蛋白使得茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯（theaflavin-3,3’-digallate，TFDG）的紫外吸收光譜增寬，可能是由于其與氨基酸殘基存在特異性的非共價結合。Xiao Zuobing等[22]利用此法研究發現隨著體系中百香果汁關鍵芳香化合物（二氫-β-紫羅蘭酮和香葉醇）濃度的增加，索馬甜蛋白在280 nm波長附近的吸收峰增強。這表明蛋白質的結構發生了變化，暴露了蛋白分子內封閉的色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環疏水基團，并且疏水相互作用得到增強，π-π*躍遷能量增加，證明它們都與索馬甜蛋白發生了結合作用。

熒光猝滅光譜法常用于進一步研究蛋白質與香氣化合物的結合模式，其中熒光強度能夠反映蛋白質內部微環境親水-疏水平衡的變化，進而結合Stern-Volmer方程對熒光數據進行分析，以計算得到結合位點和結合常數。其次，同步熒光光譜法可以反映特定氨基酸所處的微環境極性，也常用以分析蛋白質構象的變化[23]。根據前人的研究，熒光猝滅光譜法和同步熒光光譜法往往需要熱力學方法輔助從而判斷兩者作用過程的主要驅動力，進一步探究蛋白質和香氣化合物的結合機理。Li Hao等[28]通過熒光猝滅光譜法計算熒光猝滅速率常數（Ksv），以進一步了解肌原纖維蛋白與香氣化合物（丁醛、辛醛、2-戊酮和2-辛酮）的結合作用，發現除丁醛外，其余Ksv均大于生物大分子與猝滅劑的最大散射碰撞猝滅常數。這表明丁醛對肌原纖維蛋白的熒光猝滅為靜態猝滅，而其他化合物則同時發生動態猝滅和靜態猝滅。Yu Xia等[21]通過聯合熒光猝滅和同步熒光光譜法發現牛血清白蛋白與TFDG的結合使蛋白質的色氨酸和酪氨酸殘基周圍的微環境更具疏水性，且TFDG能夠靜態猝滅牛血清白蛋白的熒光，并誘導蛋白質的二級結構發生變化，該結論與傅里葉變換紅外光譜分析結果一致。

不同于熒光光譜法，圓二色光譜法可以得到蛋白質中各二級結構的相對含量，進而推測出蛋白質構象的伸展與折疊，以及蛋白質內部氫鍵網絡結構的變化情況[23]。Huang Pimiao等[29]通過圓二色光譜法探討了3 種酚類化合物與鰱魚肌原纖維蛋白的相互作用促進魚腥味釋放的機理，發現α-螺旋和β-折疊含量顯著降低，而β-轉角和無規卷曲含量顯著增加，其變化程度與酚類化合物的濃度呈正相關。Ers?z等[30]借助該技術對不同pH值下β-乳球蛋白與異硫氰酸烯丙酯的結合機制進行研究，當pH值為3.0和6.5時，游離β-乳球蛋白的遠紫外光譜顯示典型的α-螺旋、β-折疊和無規卷曲結構占主導地位，并且隨著pH值的升高，游離β-乳球蛋白的結構疏松，無序結構所占比例增加。

區別于上述光譜方法，傅里葉變換紅外光譜法通常根據酰胺I（1 600～1 700 cm-1）、酰胺II（1 550 cm-1附近）和酰胺III（1 200～1 350 cm-1）譜帶來表征蛋白質結構的變化，并且可用于分析不同的狀態、濃度等環境下蛋白質二級結構及其內部氫鍵變化的情況[27]。He Yujia等[24]通過傅里葉變換紅外光譜法觀測到醛類化合物和溫度對肌球蛋白的酰胺III帶均有顯著影響，通過特定波長下吸收峰的移動能夠判斷出肌球蛋白與己醛、辛醛和3-甲基丁醛相互作用均改變了蛋白質的構象。Zhu Lin等[25]利用傅里葉變換紅外光譜發現高粱醇溶蛋白與阿魏酸（ferulic acid，FA）和四甲基吡嗪（tetramethyl pyrazine，TMP）結合能夠促使高粱醇溶蛋白的二級結構發生變化，α-螺旋含量略有下降。

此外，拉曼光譜法能夠獲取蛋白質的主鏈構象，特別是酰胺I帶、酰胺III帶和C-N等的伸縮振動信息；也可以得到側鏈基團微環境的變化情況以及計算蛋白質的二級結構含量[26]。Xu Yongxia等[31]利用拉曼光譜法研究熱處理時間對魚肌球蛋白與(E)-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇等香氣化合物結合作用的影響，發現酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）是主要的拉曼光譜帶，主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲4 種二級結構。肌球蛋白的α-螺旋含量在熱處理前5 min顯著下降，繼續加熱5～30 min后顯著升高，這可能是肌球蛋白的熱變性和展開，導致疏水基團和巰基的暴露；進一步延長熱處理時間將導致疏水基團的嵌入并形成二硫鍵，從而能夠穩定α-螺旋結構。Zhao Xiaocao等[32]通過拉曼光譜法檢測出結合呋喃類香氣化合物的肌原纖維蛋白中α-螺旋含量隨著超聲功率水平的增加先減小后增大，β-折疊和β-轉角含量先增大后減小，且在500 W時變化最顯著。此外，Cao Jinxuan等[34]根據擬合條帶的積分來計算相應譜帶的面積，由酰胺I帶譜圖確定蛋白質不同二級結構的相對含量，發現低濃度氧化劑（0～5 mmol/L H2O2）增加了羰基含量和表面疏水性，使巰基數量有所減少，并誘導G-肌動蛋白結構發生從β-折疊到α-螺旋、β-轉角和無規卷曲的部分轉變。

2.3 描述蛋白質與香氣化合物結合作用的理論模型

香氣化合物的頂空濃度、熒光強度以及猝滅速率常數并不能充分反映蛋白質-香氣化合物的結合作用程度，因此，在研究二者結合能力時需要熱力學理論模型加以輔助計算出結合常數K值和結合位點n值。描述蛋白質-香氣化合物結合作用的理論模型對于定性和定量分析蛋白質與香氣化合物的結合作用類型、作用位點個數和結合力大小是必不可少的。目前，分析蛋白質與香氣化合物結合作用的模型通常分為3 種：1）Klotz方程，常用于分析結合位點固定、較低濃度的香氣化合物與蛋白質的線性結合[35]；2）Hill方程，適用于分析結合位點發生變化、濃度較高香氣化合物與蛋白質的非線性結合[36]；3）Stern-Volmer、Van’t Hoff或Kirchhoff方程，用來分析蛋白質構象變化，通過結合參數來表征蛋白-香氣的結合作用[37]。

Klotz雙倒數方程和Hill方程分別如公式（1）、（2）所示。

式中：m為每摩爾蛋白質結合的香氣化合物的量；[L]為水溶液中自由香氣化合物的濃度/（mol/L）；K為結合常數/（L/mol）；n為結合位點的個數；h為希爾系數，反映蛋白質結構改變的程度。

一般，m和[L]根據GC峰面積分別通過公式（3）、（4）計算可得。

式中：O為香氣化合物總濃度/（mol/L）；Cp為蛋白質濃度/（mol/L）；[HS]p為含蛋白質樣品的頂空香氣化合物GC峰面積；[HS]c為不含蛋白質樣品頂空香氣化合物GC峰面積。

另外，基于蛋白質構象發生變化時，常使用的Stern-Volmer方程及其修正后可用于計算結合位點n值和靜態猝滅平衡常數Ka的方程分別公式（5）、（6）所示。

式中：F0和F分別為不存在和存在猝滅劑時的熒光強度；Ksv為熒光猝滅常數/（L/mol）；[Q]為猝滅劑的濃度/（mol/L）；Ksv可以通過對F0/F與[Q]的線性回歸關系曲線來確定。

采用的分析模型、香氣化合物濃度、研究體系等不同，所獲得的研究結果也不盡相同。劉璘等[38]基于熱力學模型（Scatchard方程）的研究表明，肌球蛋白與白鰱魚特征腥味物質的結合反應均是自發的（ΔG＜0）。與直鏈醛（庚醛、辛醛、壬醛）相比，1-辛烯-3-醇和肌球蛋白的結合位點數（n）更多及結合常數（K）較大，且肌球蛋白對直鏈醛的結合能力隨著鏈長的增加而有所降低。有研究表明，基于Klotz模型，香茅醛、丙酸香茅酯、乙酸香茅酯和香茅醇在低濃度時（0.04～0.16 mmol/L）與大豆分離蛋白的結合較小，兩者為線性結合，而Hill模型分析結果則與之相反[33]。另外，基于構象變化，采用Kirchhoff方程能夠計算熵變ΔS、焓變ΔH和吉布斯自由能ΔG，進而推導出結合常數K和結合位點n[39]。此外，利用Stern-Volmer方程，并根據猝滅速率常數也可以計算得到結合常數K值和結合位點n值[40]。由于大多數蛋白質-香氣物質的作用都是可逆的非共價結合，研究者傾向于使用Klotz（或Scatchard）方程和Hill方程兩種經典理論模型，在平衡條件下來描述香氣化合物與蛋白質的結合能力。

2.4 基于蛋白分子與香氣配體間結合位置的測定方法

分子對接是研究分子間（配體和受體）相互作用并預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法。分子動力學模擬能夠克服對接分析中嚴格的采樣限制，利用計算機以原子水平的分子模型來模擬分子結構和行為，進而模擬分子體系的各種物理、化學性質。近年來，分子對接和分子模擬越來越多地被用于食品領域，為蛋白分子與香氣化合物間的結合作用研究提供了一種新思路和新工具。Zhang Bin等[41]通過分子對接研究不同含氧官能團（羰基、醇羥基和醛基）與大豆分離蛋白的結合作用，發現辛醛與大豆分離蛋白的結合親和力最高，其次是1-辛烯-3-醇和2-辛酮，這是因為醛類化合物與大豆分離蛋白之間形成了更強的氫鍵作用。根據Bi Shuang等[7]的研究，豌豆蛋白中的Leu-12和Lys-39殘基有助于疏水相互作用的形成，其與己醛分子的距離分別為3.59 ?和3.29 ?，(E)-2-辛烯醛中的氧原子與Asn-336、Lys-482、Phe-483和Leu-484殘基中的氫原子則通過長度分別為3.52、3.56、3.45 ?和3.20 ?的氫鍵相互作用。Wang Haitang等[18,40,42]基于分子對接和動力學模擬技術，進一步驗證了多光譜方法的實驗結果，結果表明氫鍵和范德華力是肌原纖維蛋白與辛酸乙酯、1-庚醇可逆結合的主要驅動力，而疏水相互作用是維持肌球蛋白-庚醛體系的穩定性的主要作用力。Liu Chengzhi等[43]利用分子動力學模擬探索玉米醇溶蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）的結合作用機理（圖3）。圖中殘基的能量貢獻小于-8.37 kJ/mol顯示為橙色，能量貢獻大于-8.37 kJ/mol顯示為黃色，而左側紫色虛線則代表氫鍵。分子動力學模擬結果表明，EGCG與Y171、Q174、L176和L205殘基生成的玉米醇溶蛋白活性口袋結合。其中，靜電相互作用和范德華力在EGCG與玉米醇溶蛋白的結合中起主導作用，這與傅里葉變換紅外光譜和熱力學分析的結果一致。此外，Han Ping等[44]綜合利用分子動力學模擬和分子對接法測得肌球蛋白-芝麻酚復合物的均方根偏差值低于單個肌球蛋白，這說明肌球蛋白與芝麻酚結合后的結構變得更加穩定，且分子構象變化程度較小。

圖3 玉米醇溶蛋白與EGCG的結合機制[43]Fig.3 Binding mechanism between zein and epigallocatechin-3-gallate(EGCG)[43]

3 蛋白質與香氣化合物結合作用的影響因素

蛋白質-香氣化合物的結合作用受到多種因素的影響，除了溫度、pH值、離子強度和氧化條件等環境因素能夠通過改變蛋白質結構來影響蛋白質與香氣物質的結合作用，食品中的蛋白質、香氣化合物及其他配料組分差異也會使蛋白質的結構和聚集狀態發生變化，從而影響蛋白質的結合能力。目前，關于溫度、pH值和蛋白質氧化等加工條件如何影響蛋白質-香氣化合物結合能力的總結已較為系統全面，因此，本文主要圍繞食品基質中蛋白質的種類與結構、香氣化合物的濃度、種類與官能團以及食品中的配料成分差異對蛋白質-香氣化合物結合作用的影響進行闡述，以深入解析二者結合作用機制。

3.1 蛋白質種類

目前對蛋白質與香氣化合物結合作用的研究主要集中在動物蛋白，包括乳蛋白（β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和酪蛋白）、牛血清白蛋白和肌原纖維蛋白。表2總結了近幾年來發表的文獻中所選擇的香氣化合物與不同蛋白質的結合作用。蛋白質種類的不同，特別是氨基酸殘基、二級結構等均有所差異，能夠影響其與香氣化合物作用時所表現的結合能力強弱。

表2 食品中蛋白質與香氣化合物的結合作用Table 2 Binding effect between proteins and flavor compounds in foods

乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中乳清蛋白主要由β-乳球蛋白（約80%）和α-乳白蛋白組成。由于β-乳球蛋白體積小、水溶性好、結構和性質明確，因此廣泛作為模型用于研究香氣化合物-蛋白質的結合作用。Tavel等[53]利用傅里葉變換紅外光譜和2D核磁共振法進行分析，發現酮類、醛類、酯類和酚類香氣物質與β-乳球蛋白既可以結合在同一位點，也可以結合在不同位點。酪蛋白由于自身結構的特殊性，有關其與香氣化合物結合作用的研究較少，且一般都是在模擬體系中完成。Viry等[48]通過構建新的預測模型研究酪蛋白酸鈉在5 ℃平衡24 h后與香氣化合物的結合能力，發現酪蛋白酸鈉與乙酸乙酯、苯甲醛和丙酮的結合是弱相互作用力。Yin Zhucheng等[54]認為酪蛋白比其水解物與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）的結合能力更強，且酪蛋白與C3G的結合方式經酶作用后由范德華力或氫鍵轉變為疏水相互作用。

肌肉蛋白是一種復合體系的蛋白質，研究較多的主要是肌球蛋白和G-肌動蛋白等肌原纖維蛋白。根據Cao Jinxuan等[34]的研究，0～1 mmol/L H2O2能夠導致G-肌動蛋白在與醛類化合物結合時巰基位點數量減少，有利于香氣化合物的釋放；而1～20 mmol/L H2O2能夠促進醛類物質的保留，這是由于G-肌動蛋白重建和聚集增加了疏水位點數量，進而易于形成蛋白質-芳香化合物復合物。Liu Huan等[55]認為肌球蛋白流變行為與肌球蛋白-醛分子結合作用之間的協同作用能夠促進醛類化合物的保留，并采用分子對接模擬結合多光譜技術預測出Thr-125、Pro-128、Trp-131和Val-187是肌球蛋白和戊醛之間結合的關鍵位點。除此之外，當添加酮類化合物后，肌原纖維蛋白的構象發生了改變，α-螺旋含量相應減少，Tyr和Trp殘基周圍微環境的極性增強[56]，這與Yang Qiuli等[57]的研究結果一致。

與動物蛋白不同的是，大豆蛋白因不良“草味”或“豆腥味”限制了其應用和消費。因此，許多研究都集中在了解大豆蛋白異味的釋放和結合上。研究表明，醇類（如1-己醇）和醛類（如己醛）與干大豆蛋白的結合能力高于烴類（如己烷），這可能是由于大豆蛋白與醇、醛類化合物形成了氫鍵相互作用[58]。然而，除大豆蛋白外，對其他植物蛋白及其風味結合能力的系統研究還比較缺乏。Zhu Lin等[25]基于多重光譜和分子模擬研究了高粱醇溶蛋白（Kafirin）與FA和TMP的結合能力，發現疏水作用和氫鍵分別在Kafirin-FA和Kafirin-TMP復合物的形成中發揮了主要作用，且復合物的形成使Kafirin的結構更加緊湊。

3.2 蛋白質的結構

研究表明，蛋白質的結構，特別是其氨基酸序列、二級、三級和四級結構是影響其與香氣化合物結合的重要因素。黃國等[59]研究中性條件下β-伴大豆球蛋白（7S）、大豆球蛋白（11S）與EGCG的結合作用。相比于7S蛋白，11S蛋白中疏水性和不帶電荷的氨基酸含量較高，說明11S蛋白對EGCG的結合能力更強。α-乳白蛋白的致密結構含有26%的α-螺旋、14%的β-折疊和60%的無序結構，能夠抑制疏水性區域的暴露，從而降低蛋白質與香氣物質的結合能力[60]。甲基化、乙基化、二硫鍵斷裂、糖基化和脫酰胺基等均會導致蛋白質肽鏈展開和聚集，從而引發其與香氣化合物結合作用的改變。O’Neill[61]認為將蛋白質羧基側鏈的乙基酯化和用亞硫酸鈉還原二硫鍵對β-乳球蛋白進行化學修飾，能夠形成大量的結合位點。Temthawee等[52]以香草醛-椰子蛋白為模型，研究了谷氨酰胺酶對椰子蛋白風味結合電位的影響，發現脫酰胺后椰子蛋白的整體結合親和力降低，從而可以減少香草醛與蛋白質的結合行為。Wang Juan等[62]通過丙二醛模擬體系對大豆分離蛋白進行氧化改性，發現低氧濃度時，蛋白質結構展開，暴露疏水基團，從而增強了蛋白質與芳香化合物的結合作用；而在高氧濃度時，蛋白質與飽和醛類化合物結合能力將減弱。Zhao Xiaocao等[32]對肌原纖維蛋白進行超聲處理，發現超聲處理促進了蛋白結構解聚和去折疊，使其暴露出更多的疏水和氫鍵結合位點，同時肌原纖維蛋白與呋喃類化合物間的靜電相互作用力也得到增強。綜上，對蛋白質的可暴露疏水區域進行物理和化學修飾，可以提高其結合風味的能力。

3.3 香氣化合物的濃度、種類和官能團

香氣化合物濃度對自身與蛋白質作用的結合位點和結合常數有很大的影響。通過Hill模型分析可得，隨著香氣化合物濃度增大，其與蛋白質的結合能力增強，引起蛋白質去折疊或肽鏈展開，從而產生新的結合位點。例如，當己醛濃度為0.1～1.0 mol/L范圍內時，隨著己醛濃度增大，11S球蛋白和7S伴球蛋白與香氣化合物結合位點數量增多，是熵驅反應[36]。當香氣化合物為低濃度時，其與蛋白質結合能較低，一般難以真實地反映蛋白質內部對香氣化合物的結合情況，特別是內部疏水區較封閉的大豆分離蛋白，蛋白質的構象并不會發生變化[36,63]。蛋白質內部結合香氣化合物濃度通常較低，結合強度高，釋放量較少，因此研究者常使用SPME-GC/MS方法測定頂空中香氣化合物濃度，再通過數學模型擬合，進而得到蛋白質內部結合位點。

許多研究都更加關注香氣化合物對蛋白質結合位點數量和分布的影響，其中香氣化合物的種類和官能團對二者之間的結合作用具有顯著影響。總體來看，研究者傾向于認為香氣化合物與蛋白質的結合強度大小依次為醛類＞酯類＞酮類＞醇類[20]。當香氣化合物為同系物時，其與蛋白質的結合能力隨著脂肪鏈長度的增加而增強[64]。Ma Yunjiao等[65]在水溶液中研究了吡嗪與牛血清白蛋白的結合作用，發現吡嗪中—CH3的位置和分布受體系中風味釋放的顯著影響，牛血清白蛋白的酪氨酸和色氨酸殘基是烷基-吡嗪通過靜電和疏水相互作用的主要結合位點。

3.4 食品中的配料成分

食品是包含多種成分的復雜體系，存在其他配料成分，如油脂、乳化劑、鹽和調味用糖等，這些配料或多或少地會影響蛋白質的聚集狀態和構象等特性，從而對蛋白-香氣化合物的結合作用產生一定的影響。一般來說，蛋白質對揮發性風味物質的保留率遠低于脂肪。Guichard[66]報道，油脂含量的增加會降低疏水性芳香化合物的揮發性，而對親水性化合物（如雙乙酰或短鏈醇）卻只產生很小的影響。然而，在乳狀液中，蛋白質在油-水界面的存在會對疏水性香氣化合物的釋放和感知產生顯著性影響[67]。Rogacheva等[68]研究香氣化合物在油-水體系與β-乳球蛋白的結合行為，認為油-水界面上蛋白質的存在可以提高芳香化合物的傳質阻力，從而減緩香氣物質釋放到氣相中的速率，以保證在食用過程中風味的持續性。此外，Wang Kun等[69]研究鹽的種類和濃度對鹽提取豌豆蛋白提取物（salt-extracted pea protein isolates，PPIs）與酮類化合物（2-己酮、2-庚酮和2-辛酮）結合的影響。相比于二價鹽（CaCl2），較高濃度的NaCl（0.25～1.00 mol/L）能顯著促進蛋白質與風味的結合，而較低濃度（0.05～0.10 mol/L）則會降低風味的保留。在不同條件下，PPIs和2-辛酮的結合能力均大于2-庚酮和2-己酮。Xu Jiao等[16]對多糖體系中大豆分離蛋白與香氣化合物的結合作用進行研究，發現乙酸葉醇酯、丁二酮分別在大豆分離蛋白與羧甲基纖維素鈉、黃原膠混合溶液中的保留率更高，檸檬烯在大豆分離蛋白與刺槐豆膠體系中的保留率則顯著低于上述兩種多糖體系。

4 結 語

蛋白質與香氣化合物的結合作用會直接或間接影響食品的風味感知，進而影響消費者對食品的喜好程度。此外，食品工業中蛋白質-香氣化合物反應會造成風味損失或者異味存留，從而縮短產品保質期，因此，了解蛋白質與香氣化合物的結合作用機制及影響因素，為保持食品理想的風味和延長產品保質期提供了可能。

隨著精密儀器與技術的不斷發展，研究手段與方法的不斷成熟，對蛋白質與香氣化合物結合作用的認識也逐漸深入。然而目前還存在一些問題，需要在目前的認知基礎上進一步強化。首先，目前蛋白基質與香氣成分的結合作用研究一般都是在單一的模擬體系中完成，它們之間的結合類型與作用位點等作用方式尚不明確，且不存在統一的作用機制。因此，在研究單一基質的基礎上，進一步研究復合體系和多組分食品基質與香氣化合物的相互作用是未來研究的發展趨勢之一。其次，關于蛋白質在加工時構象變化、不同結構的香氣化合物共存條件下以及添加食品配料等對蛋白質與香氣化合物結合作用影響等方面的研究仍有所欠缺，進而導致蛋白食品體系中風味平衡調控技術的缺乏。此外，隨著消費者追求飲食中少鹽、少糖，同時對低脂食品的需求增加，應加速探索開發植物性和“三減”食品的方法。但是“三減”食品的風味成分持續釋放能力也會減弱，如何在這種情況下保持食品的風味也顯得至關重要。如開發植物膠或以蛋白質為基礎的脂肪替代品，并通過添加調味料或改變香氣化合物的釋放/保留模式來保持食品的風味特征，均是滿足健康飲食需求的可選策略。與此同時，也需要深入研究感官評價和蛋白質-香氣化合物結合作用程度之間的關系，以期在蛋白質與香氣化合物結合作用機理的研究基礎上揭示食品風味在體內和體外的釋放機制。食品中蛋白基質與香氣化合物的結合能力決定了食品的風味品質，隨著蛋白質與不同香氣化合物結合作用機理研究的不斷深入，蛋白質-香氣化合物的結合方式和特有的保留/釋放模式將逐漸明晰，這對于揮發性香氣成分的可控釋放及感知并實現風味品質穩態化調控具有重要的意義。