山楂多酚緩解苯并芘誘導的呼吸道上皮細胞炎性損傷活性

燕霞鳳，侯召勤，張翠芬，馬燕飛，王建軍,*

（1.東營市人民醫院科教科，山東 東營 257000；2.深圳大學 呼吸疾病國家重點實驗室深圳大學變態反應分室，廣東 深圳 518060）

苯并芘（benzo(a)pyrene，BaP）是化石燃料、煙草等不完全燃燒產生的揮發性化合物，是主要的大氣污染物之一[1]，其也是肺癌、皮膚癌和肌肉減少癥等多種疾病的誘因之一[2-4]。由于BaP主要存在于空氣中，因此其最主要的危害是誘發呼吸道疾病。研究表明，BaP暴露會誘發呼吸道細胞氧化應激及炎癥反應，進而造成呼吸道損傷[5]，而呼吸道內皮細胞在誘發、調控哮喘疾病過程中有重要的作用[6]。

山楂不僅是中藥，還是不可多得的保健食品，具有消食化滯、活血化瘀、降血脂、降血壓等功效[7]。山楂中富含黃酮、三萜、有機酸類等化合物[8]。其中，山楂總黃酮為山楂中重要的活性成分，具有多種藥理活性[9-10]，能夠降血脂、改善冠脈血流量及機體微循環狀態等[10]。研究發現，山楂富含活性酚類化合物，具有良好的抗氧化、抑菌、抗炎能力[11-12]，對內皮細胞損傷也有一定的保護作用[13]。Deng Jie等[14]發現，富含酚類化合物的山楂提取物具有抑制BaP遺傳毒性的作用；同樣地，Shin等[15]的研究表明，山楂的提取物具有預防過敏性氣道炎癥的功能，是過敏性哮喘的潛在治療藥物。但目前關于山楂對呼吸道的保護功能研究較少，同時這種保護作用是否與山楂多酚有關尚不明確。

本實驗在研究BaP暴露損傷呼吸道上皮細胞潛在機制的同時，研究山楂活性酚類化合物對呼吸道上皮細胞的保護活性及潛在分子機制，以期為環境污染物暴露導致的哮喘的預防、治療提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BaP 阿拉丁試劑（上海）有限公司；人支氣管上皮（16HBE）細胞 中國科學院上海細胞生物學研究所；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、胎牛血清和青霉素-鏈霉素混合液、DMEM培養基、BCA蛋白質濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術研究所；芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、細胞色素p450家族1亞家族A成員1（cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1，CYP1A1）、p-p65、p-IκBα、p-IKKα/β和β-actin的一抗抗體、山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗 美國CST公司。

1.2 儀器與設備

R2487高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；3-30K高速臺式冷凍離心機、2K15型低溫高速離心機 美國Sigma公司；INCO2108型CO2培養箱 德國Memmert公司；液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC/MS）儀 美國Agilent Technologies公司；SW-CJ-IC型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；Ultra-Turrax?高性能分散機 德國IKA集團；Epics Altra型流式細胞儀 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 山楂活性多酚分離、鑒定

新鮮山楂5 kg，粉碎并與10 kg水混合，超聲提取3 次（功率1 000 W、溫度10 ℃），每次1 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮（溫度100 ℃、平均速率60 r/min）得浸膏798.4 g，向浸膏中加入3 kg水，依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑后得氯仿萃取物（100.4 g）、乙酸乙酯萃取物（112.5 g）及水層物。基于構建的BaP暴露16HBE細胞模型，評價氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物及水層萃取物的細胞保護活性，將活性最佳部分收集并繼續分離活性化合物。

將乙酸乙酯萃取物（100 g）經硅膠柱色譜（1 kg，200～300 目）分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫（體積比100∶10→10∶100），經薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）檢測后合并得到10 個組分（組分A～J）。基于構建的BaP暴露16HBE細胞模型，評價這10 個組分的細胞保護活性，將活性最佳部分收集并繼續分離活性化合物。組分D經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，得到化合物1（HBP-1，221 mg）、化合物2（HBP-2，324 mg）和化合物3（HBP-3，228 mg）；組分E經硅膠（300 g，300～400 目）柱色譜分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫（體積比60∶40→10∶90），得到化合物4（HBP-4，114 mg）、化合物5（HBP-5，134 mg）和化合物6（HBP-6，158 mg）；組分F經反相十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（octadecylsilyl，ODS）柱色譜分離，以甲醇-水（體積比60∶40）洗脫，得到化合物7（HBP-7，192 mg）、化合物8（HBP-8，143 mg）、化合物9（HBP-9，133 mg）和化合物10（HBP-10，215 mg）。

1.3.2 細胞培養及細胞活力檢測

100 μL/孔的16HBE細胞（1×105個/mL）接種于96 孔板中，于培養箱中培養過夜。空白組細胞不做任何處理，BaP組細胞培養基中分別加入終濃度為1、10、50、250、500、1 250 μmol/L的BaP培養24 h，或培養基中加入BaP（終濃度為10 μmol/L）分別培養12、24、48、72 h。使用CCK-8試劑盒檢測16HBE細胞活力[16]。

100 μL/孔的16HBE細胞（1×105個/mL）接種于96 孔板中，培養過夜。空白對照組細胞不做任何處理，第2～12組細胞培養基中加入終濃度為10 μmol/L的BaP培養24 h后收集細胞，冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，第2組（BaP組）加入新的培養基繼續培養24 h；第3～12組細胞清洗后，分別加入含有25 μmol/L的HBP-1～10或白藜蘆醇的新鮮培養基并繼續培養24 h。采用CCK-8試劑盒檢測16HBE細胞活力。

參考文獻[17]方法，采用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測化合物HBP-1～10的細胞毒性。

1.3.3 16HBE細胞炎癥因子及細胞內活性氧水平測定

100 μL/孔的16HBE細胞（1×105個/mL）接種于96 孔板中，培養過夜。空白對照組細胞不做任何處理，第2～4組細胞培養基中加入終濃度為10 μmol/L的BaP培養24 h后收集細胞，冷PBS清洗2 次，第2組（BaP組）加入新的培養基繼續培養24 h；第3、4組細胞清洗后，分別加入含有5、50 μmol/L的HBP-1新鮮培養基并繼續培養24 h。之后1 400 r/min離心5 min，收集上清液及細胞。參照腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18、IL-10、IL-6及ROS酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書進行細胞上清液中炎癥因子及細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

100 μL/孔的16HBE細胞（1×105個/mL）接種于96 孔板中，培養過夜。空白對照組細胞不做任何處理，第2～4組細胞培養基中加入終濃度為10 μmol/L的BaP培養24 h后收集細胞，冷PBS清洗2 次，第2組（BaP組）加入新的培養基繼續培養24 h；第3、4組細胞清洗后，分別加入含有10、50 μmol/L HBP-1的新鮮培養基并繼續培養24 h。收集細胞，PBS清洗2 遍，根據Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用流式細胞儀檢測16HBE細胞凋亡情況。

1.3.5 Western blotting檢測相關蛋白的表達

將16HBE細胞密度調整為3×105個/mL，3 mL/孔接種于6 孔板中，參照1.3.4節方法分組處理，收集細胞，加入適量RIPA裂解液提取細胞總蛋白，參考文獻[18]的方法采用Western blotting檢測核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路、細胞AhR信號通路相關蛋白的表達。

1.4 數據統計與分析

HBPs的化學結構圖采用ChemDraw軟件繪制。采用SPSS 18軟件進行數據分析，陰性對照、陽性對照使用獨立樣本t檢驗方法檢驗。P＜0.05表示具有顯著差異，P＜0.01表示具有極顯著差異，實驗結果均以平均值±標準差表示，n＝3。

2 結果與分析

2.1 HBPs的分離鑒定

基于活性追蹤方法，本研究分離獲得山楂活性酚類化合物HBP-1～10，并鑒定其結構（圖1）。

圖1 化合物HBP-1～10的結構Fig.1 Structures of HBP-1 through 10

H B P-1：黃色油狀物，高分辨電噴霧電離質譜（high resolution electrospray ionization mass s p e c t r o s c o p y，H R-E S I-M S）顯示準分子離子峰m/z341.172 9 [M＋Na]＋（C19H26O4Na，理論計算值：341.172 3），確定分子式為C19H26O4。其1H NMR、13C NMR數據見表1。

表1 HBP-1、3、4、5、6的1H NMR、13C NMR數據Table 1 1H NMR and 13C NMR data of HBP-1, 3, 4, 5 and 6

HBP-2：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z319.190 4 [M＋H]＋（C19H27O4，理論計算值：319.190 4），確定分子式為C19H26O4，不飽和度為6。其1H NMR、13C NMR數據見表2。

表2 HBP-2、7、8、9、10的1H NMR、13C NMR數據Table 2 1H NMR and 13C NMR data of HBP-2, 7, 8, 9 and 10

HBP-3：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z319.190 4 [M＋H]＋（C19H27O4，理論計算值：319.190 4），確定分子式為C19H26O4，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數據見表1。

HBP-4：淡黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z357.167 6 [M＋Na]＋（C19H26O5Na，理論計算值：357.167 2），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數據見表1。

HBP-5：淡黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z357.167 8 [M＋Na]＋（C19H26O5Na，理論計算值：357.167 2），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數據見表1。

HBP-6：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z335.185 5 [M＋H]＋（C19H27O5，理論計算值：335.185 3），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數據見表1。

HBP-7：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z373.198 5 [M＋Na]＋（C20H30O5Na，理論計算值：373.198 5），確定分子式為C20H30O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數據見表2。

HBP-8：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z335.186 2 [M＋H]＋（C19H27O5，理論計算值：335.185 3），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數據見表2。

HBP-9：白色粉末，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z251.128 1 [M＋H]＋（C14H19O4，理論計算值：251.127 8），確定其分子式為C14H18O4，分子量為250，不飽和度為6。其1H NMR、13C NMR數據見表2。

HBP-10：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準分子離子峰m/z357.167 3 [M＋Na]＋（C19H26O5Na，理論計算值：357.167 2），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數據見表2。

2.2 HBP-1～10的細胞保護活性

采用基于BaP暴露的16HBE細胞模型及CCK8法檢測BaP對16HBE細胞的損傷情況，結果如圖2A、B所示。BaP暴露使16HBE細胞活力降低，其中，10 μmol/L的BaP暴露24 h后16HBE細胞活力降低11.6%（P＜0.01），說明BaP暴露使16HBE細胞受到嚴重損傷。實驗結果顯示，BaP對16HBE細胞活力的影響還具有一定的濃度及時間依賴性。

圖2 HBP-1～10的細胞保護活性Fig.2 Cytoprotective activity of HBP-1 through 10

此外，本實驗進一步檢測了HBP-1～10抗BaP損傷16HBE細胞的保護活性（圖2C）。與Control組相比，BaP組16HBE細胞活力降低12.2%（P＜0.01），說明BaP暴露損傷16HBE細胞進而使細胞活力下降。而HBP-1～10對16HBE細胞具有保護作用；相比于BaP組，白藜蘆醇組的細胞活力略高，但不具備顯著性差異，而HBP-1、HBP-5及HBP-10組細胞活力分別提高11.5 個百分點（P＜0.01）、10.3 個百分點（P＜0.05）及10.1 個百分點（P＜0.05），且其細胞保護活性均超過白藜蘆醇。其中，HBP-1的細胞保護活性最佳，因此，接下來的實驗以HBP-1為代表深入研究山楂活性酚類化合物發揮細胞保護活性的潛在機制。

采用MTT法檢測化合物HBP-1～10對于16HBE細胞的毒性，結果顯示化合物HBP-1～10在濃度低于1.2 mmol/L（48 h）時未損傷16HBE細胞。

2.3 HBP-1對BaP誘導16HBE細胞炎癥因子及ROS水平的影響

如圖3A～E所示，BaP暴露能夠極顯著誘導16HBE細胞炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10、IL-6）分泌。相比于Control組，BaP組TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10、IL-6分泌分別增加809%（P＜0.01）、444%（P＜0.01）、1 145%（P＜0.01）、783%（P＜0.01）及849%（P＜0.01）。結合CCK8細胞活力的檢測結果（圖2C），推測BaP暴露誘發16HBE細胞炎癥因子過量分泌，使細胞受到嚴重炎性損傷。而相比于BaP組，HBP-1處理后16HBE細胞炎癥因子分泌減少；相比于BaP組，50 μmol/L HBP-1處理后，TNF-α、IL-1β、IL-18質量濃度分別減少59.9%（P＜0.01）、65.9%（P＜0.01）及67.4%（P＜0.01）。說明HBP-1能夠有效抑制BaP誘導的16HBE細胞炎癥因子過量分泌，緩解BaP誘導的16HBE細胞炎性損傷。

圖3 HBP-1對16HBE細胞炎癥因子及ROS水平的影響Fig.3 Effect of HBP-1 on inflammatory factors and ROS levels in 16HBE cells

本研究進一步分析了BaP暴露對16HBE細胞內ROS水平的影響，結果如圖3F所示，BaP暴露使16HBE細胞內ROS水平極顯著升高。相比于Control組，BaP組細胞內ROS水平升高212%（P＜0.01），推測BaP暴露誘導16HBE細胞產生氧化應激，進而導致細胞受到嚴重氧化損傷。而相比于BaP組，HBP-1處理后16HBE細胞內ROS水平顯著降低；相比于BaP組，經過50 μmol/L HBP-1處理后，16HBE細胞內ROS水平降低51.7%（P＜0.01）。說明，HBP-1能夠有效抑制BaP誘導的16HBE細胞內ROS水平升高及細胞氧化損傷。

2.4 HBP-1對BaP誘導16HBE細胞凋亡的影響

本實驗通過流式細胞術檢測BaP暴露對16HBE細胞凋亡的影響。相比于Control組，BaP暴露使16HBE細胞凋亡率增加20.7 個百分點（P＜0.01）；而經HBP-1處理后，16HBE細胞凋亡率顯著減少，相比于BaP組，10、50 μmol/L HBP-1處理后16HBE細胞凋亡率分別減少12.8 個百分點（P＜0.05）及16.4 個百分點（P＜0.01）（圖4）。

圖4 HBP-1對BaP誘導16HBE細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of HBP-1 on BaP-induced apoptosis in 16HBE cells

2.5 HBP-1對BaP誘導16HBE細胞NF-κB信號通路的影響

NF-κB信號通路在細胞炎癥反應調節中具有重要的作用[19]，因此，靶向NF-κB信號通路相關蛋白的表達是開發抗炎藥物的重要方法[20-21]。為了研究NF-κB信號通路在HBP-1對BaP誘導炎癥反應中的作用，本研究檢測了BaP誘導的16HBE細胞中NF-κB信號通路相關蛋白的表達情況。如圖5所示，HBP-1能夠顯著抑制BaP誘導的16HBE細胞p65、IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化，進而抑制BaP誘導的NF-κB信號通路激活。

圖5 HBP-1對BaP誘導16HBE細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of HBP-1 on NF-κB signaling pathway-related protein expression in BaP-induced 16HBE cells

2.6 HBP-1對BaP誘導16HBE細胞AhR信號通路的影響

BaP是細胞AhR的配體，細胞BaP暴露后能活化AhR，進而促進CYP1A1基因表達，代謝BaP產生有毒中間產物，動物實驗證實BaP可以導致炎癥和氧化應激，且經由AhR信息路徑傳遞[22-23]。因此，本研究檢測了HBP-1對AhR信號通路中AhR和CYP1A1蛋白表達的影響。如圖6所示，BaP暴露誘導16HBE細胞中AhR和CYP1A1蛋白表達極顯著升高。而經HBP-1處理后，BaP暴露誘導的16HBE細胞AhR和CYP1A1蛋白表達升高被抑制。Western blot結果表明AhR和CYP1A1信號分子對HBP-1抑制BaP誘導的16HBE細胞損傷發揮重要作用。

圖6 HBP-1對BaP誘導16HBE細胞AhR信號通路相關蛋白表達的影響Fig.6 Effect of HBP-1 on AhR signaling pathway-related protein expression in BaP-induced 16HBE cells

3 討 論

隨著化石燃料的不斷使用，BaP在大氣中的含量逐年升高，給人們的身體健康帶來了極大的危害。BaP的長時間暴露會誘發呼吸道炎癥并進一步誘發呼吸系統疾病，如哮喘、肺部位炎癥等[24-25]。研究表明，山楂多酚對哮喘引起的呼吸道上皮細胞損傷有一定的抗炎、抗氧化活性[12-13]。本研究通過活性追蹤分離方法從山楂中分離出10 種具有細胞保護活性的酚類化合物（HBP-1～10）。本研究結果證實多環芳烴（BaP）暴露會誘導支氣管上皮細胞氧化應激和炎癥；同時，山楂酚類化合物能夠抑制BaP誘導的支氣管上皮細胞炎癥和氧化應激。此外，本研究還檢測了AhR和NF-κB信號通路在介導山楂酚類化合物細胞保護活性中的作用。

炎癥是一種針對外源物入侵的先天免疫反應，在炎癥過程中，巨噬細胞被激活，并產生炎癥介質來抵御入侵的外源物（如病原體）[26-27]。本研究中，BaP暴露顯著誘導16HBE細胞炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α）過度釋放，說明BaP暴露誘導了16HBE細胞炎癥反應。而HBP-1對炎癥因子（IL-1β、IL-18和TNF-α）的過度分泌有顯著的抑制作用，表明HBP-1可通過調節炎癥因子的分泌來發揮抗炎活性。

自由基的過度產生會擾亂細胞能量代謝平衡，誘發氧化應激，從而導致細胞內DNA、蛋白質損傷[28-29]，進而誘導細胞凋亡，而ROS是導致細胞氧化損傷和炎癥的重要介質[30]。本研究中，BaP暴露顯著誘導16HBE細胞ROS的過量生成，而其在HBP-1干預后被顯著抑制。推測BaP暴露誘導細胞產生大量ROS，進而導致細胞DNA和蛋白質等遺傳、功能性分子氧化損傷，從而導致炎癥因子的過度產生，HBP-1干預后BaP暴露誘導的氧化應激和炎癥損傷得以逆轉。

細胞凋亡對細胞的功能和生存至關重要[31]，在本研究中，通過流式細胞術檢測HBP-1對BaP誘導的16HBE細胞凋亡的抑制作用。本實驗結果顯示，HBP-1可抑制BaP誘導的16HBE細胞凋亡。呼吸道內皮細胞在維持呼吸道環境穩態中具有重要的作用，而炎癥的暴發往往會導致呼吸道內皮細胞功能障礙[32]。高濃度炎癥因子（如IL-1β、IL-18等）會誘發細胞凋亡，導致炎癥性疾病[33]。結合HBP-1可抑制BaP誘導的16HBE細胞炎癥因子過度分泌，說明HBP-1可通過抑制BaP暴露誘導的炎癥及16HBE細胞凋亡發揮細胞保護活性。

體外實驗表明，多環芳烴污染物可通過激活NF-κB信號通路誘導呼吸道上皮細胞炎癥因子表達增加，進而誘導生成ROS中間體，并進一步激活NF-κB信號通路。同時，有研究報道，NF-κB信號通路的激活與炎癥的發展及炎癥因子（IL-10、IL-18等）分泌有密切關系[12]。本研究中，BaP暴露使NF-κB信號通路蛋白磷酸化極顯著增加，說明BaP暴露激活了NF-κB信號通路。而經HBP-1處理后，BaP暴露誘導的16HBE細胞NF-κB信號通路蛋白磷酸化被顯著抑制。推測HBP-1可抑制BaP暴露誘導的NF-κB信號通路激活，進而抑制炎癥因子過量分泌，發揮細胞保護活性。

AhR是一種核轉錄因子，可被外源性及內源性配體激活。其中，AhR外源性配體中最為常見的是一些環境毒物，如2,3,7,8-四氯二苯并二噁英、BaP等[34]。AhR通過與配體結合被激活而發生核易位，并通過經典信號傳導途徑誘導表達可代謝多種化學異物或藥物的代謝酶，如CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1等[13]。目前多以CYP1A1基因表達上調與否來判斷AhR是否被配體激活。BaP激活AhR后引起CYP1A1基因表達上調高達幾百倍，進而引起后續的代謝激活。本研究中，BaP暴露激活16HBE細胞中AhR信號通路，而HBP-1處理抑制了BaP暴露誘導的16HBE細胞AhR信號通路激活，說明AhR信號通路在HBP-1抑制BaP誘導的16HBE細胞損傷時同樣具有重要作用。

4 結 論

抑制呼吸道上皮細胞炎癥對哮喘的治療具有重要的意義，本研究發現山楂酚類化合物可抑制BaP誘導的16HBE細胞氧化應激、AhR及NF-κB信號通路激活、細胞凋亡及炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-18）等炎癥因子過表達，從而抑制呼吸道上皮細胞炎癥。本研究為山楂活性酚類化合物應用于緩解、治療BaP暴露導致的呼吸道上皮細胞損傷等相關疾病提供了一定的實驗依據。