薏苡仁生物肽對高糖損傷人臍靜脈內皮細胞保護作用

尹艷燕，趙 藝，褚輝程，梁勁杰，韓曉佳，陳祖君*，王靈芝,*

（1.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102400；2.中國航天科工集團七三一醫院，北京 100074；3.中國醫學科學院阜外醫院，北京 100030）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，嚴重危害人類健康。2021年糖尿病導致670萬人死亡，截至2021年，全球成年人糖尿病患病率高達10.5%，造成至少9 660億 美元的衛生支出。中國糖尿病患者數量位居全球第一，該病的預防和治療形勢嚴峻[1]。血管內皮細胞是位于血管最內層的扁平鱗狀細胞，不僅是血液與組織之間的屏障，同時在控制血管張力、保持血液正常流動和凝血、免疫等方面發揮著重要作用[2]。糖尿病患者常伴有心臟、腦、腎、視網膜等血管并發癥，引發血管內皮功能障礙[3]。

糖尿病引發的內皮細胞功能障礙表現為細胞增殖失調、屏障功能改變、內皮-間充質轉變、細胞黏附、炎癥、氧化應激和對凋亡的敏感性改變等。高糖促使內皮細胞中線粒體產生過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而激活下游多元醇/山梨醇/醛糖還原酶途徑、二酰甘油/磷脂肌醇途徑等進而引發各種血管并發癥[4]。高糖環境下，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達下調與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）表達上調導致內皮細胞凋亡加劇[5]。長期高血糖可導致機體器官內皮細胞黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表達量升高，同時增加內皮細胞對缺血和缺氧的易感性，進而促進ICAM-1的表達[6]，形成惡性循環。此外，高血糖影響內質網代謝，使未折疊蛋白在內質網腔內積累，引發內質網應激，影響線粒體的功能并最終導致內皮損傷[7]。

薏苡仁（Coix lacryma-jobiL.var.ma-yuen(Roman.)Stapf）為臨床常用利水滲濕類藥物，具有抗腫瘤、降血壓、免疫調節、降血糖、抗炎、抗菌、降血脂等活性[8]，可藥食兩用[9]。Zhou Qilyu等[10]發現長期飼喂薏苡仁可減少結腸炎小鼠炎癥因子的分泌，減輕氧化應激水平。Wang Qingyu等[11]研究發現薏苡仁多酚提取物可降低大鼠膽固醇水平，改善腸道菌群結構。以薏苡仁油為主要成分的康萊特注射液是臨床抗癌藥物，常用來治療中晚期非小細胞肺癌[12]及原發性肝癌[13]，或聯合化療治療胃癌，對放療、化療有增效減毒的作用[14]。薏苡仁多糖能顯著抑制免疫功能低下小鼠脾臟指數和胸腺指數降低，增強巨噬細胞吞噬指數及淋巴細胞增殖反應，提高血清半數溶血值，具有較好的免疫功能恢復作用[15]。薏苡仁糖蛋白能有效抑制Fe2＋誘導的脂質過氧化，具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力[16]。

本課題組前期研究表明，薏苡仁生物肽具有顯著降壓效果[17]，同時對血管緊張素II（angiotensin II，AngII）損傷血管內皮細胞具有保護作用[18]。薏苡仁生物肽對高糖損傷血管內皮細胞是否具有保護作用鮮見報道，因此本實驗針對高糖逆境下薏苡仁生物肽對血管內皮細胞保護作用及作用機制進行研究，以期為利用薏苡仁生物肽開發具有高糖損傷HUVEC保護作用類藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏苡仁生物肽[19]由本課題組制備與保存。

D-葡萄糖、I型膠原酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、β-內皮細胞生長因子（betaendothelial cell growth factor，β-ECGF） 美國Sigma Aldrich公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Hyclone公司；雙抗、M199培養基 美國Gibco公司；VIII因子抗體 美國Santacruz公司；3,3’-二氨基聯苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）試劑盒、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、ROS檢測試劑盒、Annexin V-熒光素異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒 北京蘭博利德商貿有限公司；鈣黃綠素AM（calcium green-1 acetoxymethyl ester，CG-1 AM） 上海碧云天生物技術有限公司；NO測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒 上海近岸科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FLC-3超凈工作臺 北京東聯哈儀器制造有限公司；MCO-18AIC CO2培養箱 日本SANYO公司；TDL-50B低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；TE2000-S倒置顯微鏡 日本Nikon公司；CytoFLEX流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司；Epoch酶標儀 美國Bio-Tek公司；QuantStudio6 Flex實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀美國Life Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 人臍靜脈內皮細胞分離與培養

參考Medina-Leyte等[20]的方法分離人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）。新生兒臍帶由中國航天科工集團七三一醫院提供，無菌條件下取健康新生兒臍帶20～30 cm，將1 g/L I型膠原酶注入臍靜脈使血管充盈，轉移至細胞培養箱37 ℃消化15 min，然后將消化液轉移至相同體積的M199完全培養基（含10%（體積分數）FBS、1%（體積分數）雙抗和1 μg/Lβ-ECGF，下同）的無菌離心管內。利用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4）沖洗殘余的臍靜脈，一并收集沖洗液和消化液，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，M199完全培養基重懸細胞，接種到包被鼠尾膠原細胞培養皿中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中靜置培養，24 h后換液同時除去未貼壁細胞，觀察并拍照培養24 h及48 h的細胞形態。

1.3.2 HUVEC免疫組化鑒定

利用免疫組化方法進行HUVEC細胞Ⅷ因子表面抗原的鑒定[20]。將第2代HUVEC以5×104個/孔密度接種于24 孔板，貼壁后用質量分數4%多聚甲醛溶液固定，體積分數3% H2O2溶液室溫孵育以消除內源性過氧化物酶活性，0.3% Triton X-100通透細胞膜，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液37 ℃封閉30 min；正常組加入VIII因子一抗工作液（1∶100），陰性對照組加入5% BSA于濕盒內4 ℃孵育過夜；次日，吸棄一抗工作液或5% BSA，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液（1∶100），室溫下孵育2 h，PBS沖洗；加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.3 細胞處理及分組

取第3～6代細胞進行實驗。實驗分為5 組：1）正常對照組（NG組）：5 mmol/L葡萄糖；2）高糖損傷模型組（HG組）：30 mmol/L葡萄糖；3）薏苡仁生物肽（coix peptide，CP）高、中、低劑量給藥組：30 mmol/L葡萄糖＋1×10-5mol/L CP（CP-H組）、30 mmol/L葡萄糖＋1×10-6mol/L CP（CP-M組）、30 mmol/L葡萄糖＋1×10-7mol/L CP（CP-L組）。

1.3.4 HUVECNO分泌量的測定

取對數生長期HUVEC細胞，經0.5 g/L胰酶消化后，調整細胞密度為1×104個/mL，接種于6 孔板，每孔1 mL，待細胞貼壁后分組及加藥干預。分別培養7 、14 d后吸取細胞培養液，4 ℃、1 000×g離心15 min，采用硝酸還原酶法，利用NO測定試劑盒檢測NO分泌量。

1.3.5 HUVEC ROS含量的測定

采用流式細胞術測定HUVEC中ROS含量[21]。取對數生長期HUVEC，以1×104個/mL密度接種于6 孔板，每孔1 mL，待細胞貼壁后分組及加藥干預，培養7 d后棄舊培養基，PBS清洗細胞2 次，每孔加入1 mL H2DCFHDA（2 μmol/L）探針，37 ℃孵育30 min，PBS洗去未結合的探針。0.5 g/L胰酶消化HUVEC為單細胞狀態，轉移細胞于流式管中，利用流式細胞儀檢測488 nm激發波長下的樣品熒光強度，以此表征ROS含量。

1.3.6 HUVEC細胞凋亡的檢測

采用Annexin V-FITC/PI雙染法（細胞凋亡檢測試劑盒）測定薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC細胞凋亡的影響[3]。調整細胞密度為1×104個/mL，接種于6 孔板，每孔1 mL，分組加藥處理7 d和14 d后，收集舊培養基，用預冷PBS洗滌細胞，加入600 μL不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的0.5 g/L胰酶消化細胞，待多數細胞變圓時加入舊培養基終止消化，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用預冷的PBS洗滌2 次，加入1 mL Binding buffer重懸細胞。取500 μL細胞液轉移至流式管，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min。加入10 μL PI溶液混勻，室溫避光孵育5 min，上機（流式細胞儀）檢測。

1.3.7 qPCR檢測炎癥基因相對表達量

藥物處理細胞7 d后使用Trizol試劑分離總RNA，紫外光譜法進行核酸定量。使用promega GoScript RT System試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。qPCR反應體系為10 μL：2×NovoScript?Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 5 μL、上下游引物各0.2 μmol/L、cDNA 5 ng，加ddH2O補足10 μL。擴增條件為：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃延伸1 min，共43 個循環。各基因引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法進行基因相對表達量的計算[3]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數據統計分析

采用SPSS 26.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異具有顯著性。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 HUVEC形態學觀察及鑒定

H U V E C 貼壁生長，細胞密度低時呈長梭形（圖1A），隨著細胞密度的增加，細胞呈鋪路石狀鑲嵌排列，邊界清晰，胞漿豐富（圖1B）。采用免疫組織化學法進行細胞表面VIII因子相關抗原鑒定，顯微鏡下可見胞質內棕黃色顆粒，呈陽性反應（圖1D）。

圖1 HUVEC細胞形態學觀察及鑒定（×100）Fig.1 Morphological observation and identification of HUVECs (× 100)

2.2 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC NO分泌的影響

由表2 可知，與N G 組相比，高糖處理7 d 后，HUVEC NO分泌量顯著降低28.72%；與HG處理組相比，薏苡仁生物肽顯著增加了細胞NO的分泌量，CP-H、CP-M、CP-L給藥組NO分泌量分別為（8.60±0.22）、（10.25±0.22）μmol/L和（11.51±0.22）μmol/L；高糖作用細胞14 d后，HG組NO分泌量下降，薏苡仁生物肽給藥組NO分泌量相比HG組顯著增加（P＜0.05）。

表2 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC NO分泌量的影響Table 2 Effect of coix seed biopeptide on NO secretion in high glucoseinjured HUVECs

2.3 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC ROS產生量的影響

HG培養7 d，HUVEC細胞ROS分泌量顯著升高，相比NG組升高96.19%。薏苡仁生物肽處理顯著降低了細胞ROS的分泌量（P＜0.05），CP-H、CP-M、CP-L組的ROS分泌量分別為HG組的72.89%、68.05%、74.36%（圖2）。

圖2 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC ROS產生量的影響Fig.2 Effect of coix seed biopeptide on ROS production in high glucose-injured HUVECs

2.4 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC凋亡的影響

高糖作用HUVEC 7 d后，細胞凋亡率與NG組無顯著差異（圖3A～C），隨著高糖作用時間的延長，作用14 d后HG組凋亡細胞數量顯著增多，為NG組的1.61 倍（圖3D～F）（P＜0.05），表明長時間高糖損傷可誘導血管內皮細胞凋亡，因此在后續凋亡給藥研究中，將藥物作用時間調整至14 d，進行長期高糖損傷血管內皮細胞相關研究。

圖3 長期高糖損傷對HUVEC細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of long-term high glucose injury on cell apoptosis in HUVECs

高糖作用HUVEC 14 d后顯著降低了正常細胞的比例，細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與HG組相比，CP-H、CP-M、CP-L顯著降低了細胞的凋亡率（圖4）。

圖4 薏苡仁生物肽對長期高糖損傷HUVEC凋亡的影響Fig.4 Effect of coix seed biopeptide on cell apoptosis in HUVECs with long-term high glucose injury

2.5 薏苡仁生物肽對長期高糖損傷HUVEC炎癥基因表達的影響

與NG組相比，高糖處理HUVEC 7 d后，ICAM-1、IL-6、MCP-1和VCAM基因表達量顯著增加，分別為NG組的2.17、4.41、6.08 倍和2.08 倍（P＜0.05）。與HG組相比，CP-H、CP-M、CP-L組HUVECIL-6和MCP-1基因表達量顯著降低，CP-L組VCAM基因表達量顯著降低，為HG組的23.76%（P＜0.05），ICAM-1基因表達量也明顯下降（圖5）。

圖5 薏苡仁生物肽對長期高糖損傷HUVEC炎癥基因表達量的影響Fig.5 Effect of coix seed biopeptide on expression of inflammationrelated genes in HUVECs with long-term high glucose injury

3 討 論

高糖引起內皮功能障礙的作用機制是高糖可誘導線粒體產生過量ROS，進而通過多元醇、二酰甘油（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、己糖胺通路或者非酶糖基化產物形成引起內皮細胞發生氧化應激，引發內皮功能障礙[4]。同時，氧化應激通過Caspase 3、細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）、Akt激活、線粒體凋亡等通路誘發內皮細胞凋亡[22]。高糖可促進NADPH氧化為NADP＋，加快NAD＋還原為NADH，NADP＋、NADH可降低NO的生物利用度，增強氧化應激[23]。NO是重要的舒血管因子，可激活鳥苷酸環化酶，介導環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）調控的血管舒張，同時激活核因子-κB（nuclear factor kappa，NF-κB）信號通路，使VCAM、MCP-1表達量降低，減少白細胞黏附從而達到抗炎效果[4,24]。高糖可干擾線粒體電子傳遞鏈，使輔酶Q氧化作用增強，從而促進過氧化亞硝酸鹽的產生，最終導致細胞凋亡和壞死的發生[25]。研究表明，糖尿病患者Ang II表達量表達上調[26]；Ang II作用于內皮細胞表面血管緊張素II 1型受體（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）進而產生NF-κB和ROS，隨后激活黏附分子（如選擇素、VCAM-1和ICAM-1）、趨化因子（如MCP-1、IL-8）、細胞因子（如TNF-α和IL-6）、血管內皮和血小板衍生的生長因子等導致內皮功能障礙[27]。AngII主要通過黃嘌呤氧化酶、脂氧合酶、NAD(P)H氧化酶促進ROS的產生[28]。目前已從天然動植物中分離出具有內皮細胞保護功能的多肽類物質。袁小燕等[29]研究發現胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）可改善高糖誘導的HUVEC凋亡，且可能與磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt/內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路的表達上調相關；Guo Lixin等[30]研究發現GLP-1可降低高糖處理內皮細胞ICAM-1、VCAM-1和磷酸化JNK蛋白的表達，減少ROS生成和JNK-Bax信號通路激活；師巖等[31]發現肌肽能夠抑制高糖誘導的HUVEC凋亡。糖尿病在中醫上一般按消渴證陰虛燥熱型論治，臨床上以脾虛濕滯為常見[32]。薏苡仁粉具有降糖、降脂功效[33]。脾虛濕滯型糖尿病患者在常規治療基礎上服用薏苡仁，可縮短血糖控制所需時間，改善血糖指標，降低給藥量，避免發生低血糖等不良事件[34]；薏苡仁多糖可改善糖尿病患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、餐后血糖[35]。薏苡仁多糖可能通過調節葡萄糖激酶活性進而改善實驗性2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，并明顯降低動物血糖[36-37]。孟利娜[38]發現薏苡仁蛋白可通過降低小鼠PTEN和FOXO1基因的表達水平和提高PI3K、GLUT4基因的表達水平，促進機體對葡萄糖的吸收，降低血糖濃度。

本研究結果表明，薏苡仁生物肽可抑制高糖損傷內皮細胞ROS的產生，促進NO的分泌，降低細胞凋亡比例，同時可下調IL-6、VCAM、MCP-1基因的表達，提示薏苡仁生物肽可能通過影響NF-κB信號通路發揮保護作用。本研究表明有望利用薏苡仁生物肽開發具有高糖損傷HUVEC保護作用類藥物，為降糖藥物研發提供新的候選藥物。