金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌呼吸代謝與能量代謝的抑制機理

李玉珍，肖懷秋,,*，劉 淼，王 琳，曾夢琪，趙謀明

（1.湖南化工職業技術學院制藥與生物工程學院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510000）

肉制品和乳制品等食品因富含蛋白質、多糖和脂質等營養物質而易受到食源性致病菌與腐敗菌的生物污染，特別是大腸桿菌，其引發的食源性疾病已成為當前食品公共衛生主要威脅之一，食源性大腸桿菌的生物防控是現代食品安全領域的研究熱點[1-2]。糖酵解途徑（Embden-Meyerhof pathway，EMP）和三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）是大多數生物共有的基本代謝途徑，不僅是物質代謝中樞途徑，也是能量代謝關鍵途徑[3]。葡萄糖可經EMP和TCA氧化并產生大量能量，或經磷酸戊糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）降解生成6-磷酸葡萄糖并產生還原型輔酶（coenzyme，Co）I和CoII[4-5]。EMP、TCA和HMP是大腸桿菌最重要的3 條呼吸代謝產能途徑，菌體呼吸代謝水平是菌體代謝活力的重要體現，呼吸代謝受到抑制可影響菌體能量與物質代謝生物進程[6-7]。戴錦銘[8]研究發現，山蒼子精油可通過抑制TCA途徑實現對大腸桿菌O157:H7的呼吸抑制。大腸桿菌能量代謝關鍵酶主要錨定在細胞質膜上或分布在細胞質中，細胞質膜參與呼吸氧化產能等關鍵代謝過程，是維持細胞生理機能的重要膜基質載體[9]，離子跨膜轉運也是細胞信號轉導和物質轉運的生化基礎，胞內離子保持穩態對菌體能量與物質代謝極為重要[10]，如細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶對維持細胞質膜通透性、低鈉高鉀環境、細胞靜息電位及信號轉導有重要意義[11-12]。李婷等[13]研究了姜厚樸水提物對大腸桿菌細胞質膜離子通道ATP酶的影響，發現姜厚樸水提物作用4 h后Na＋K＋-ATP酶活性顯著上升，可能與應激適應有關。胞內ATP含量變化能直接反映菌體存活狀態[14]。戴錦銘[8]研究發現，山蒼子精油可導致大腸桿菌O157:H7胞內ATP合成速度降低或水解程度增強。本課題組前期研究發現，金屬抗菌肽SIF4為金屬陽離子抗菌肽，具有較好的胃腸耐受性和熱穩定性，對大腸桿菌具有較好抑菌活性，對大腸桿菌最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.4 mg/L[15]，對EMP和TCA關鍵酶有不同程度的抑制作用，可造成細胞質膜氧化損傷和誘導氧化應激產生過量活性氧自由基，破壞細胞質膜結構與功能[16]，但SIF4對大腸桿菌菌體呼吸代謝及能量代謝抑制機理尚未可知。鑒于EMP和TCA代謝的普遍性及其對大腸桿菌能量生成的重要性，本實驗著重從EMP和TCA視角分析金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌呼吸代謝和能量代謝的影響，以期為SIF4在食源性大腸桿菌的生物防控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金屬抗菌肽SIF4由本課題組自制[15]；大腸桿菌ATCC25922購自菌種保藏中心；刃天青 上海源葉生物科技有限公司；碘乙酸、丙二酸、磷酸鈉、TritionX-100國藥集團化學試劑有限公司；ATP含量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶 南寧東恒華道生物科技有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；超聲細胞破碎儀 寧波新芝生物有限公司；高速冷凍離心機 湘儀實驗室儀器開發有限公司；便攜式微量溶氧儀 北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體新陳代謝活力分析

參考Magnani等[17]方法并修改。將活化菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃、120 r/min培養12 h，8 000 r/min離心10 min，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.03 mol/L、pH 7.2，下同）洗滌并重懸。取4 份菌懸液，分別加入SIF4使其終質量濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC（MIC為0.4 mg/L，通過前期研究[15]確定），以不添加SIF4組為陰性對照。將刃天青溶液加入各菌懸液中（終質量分數為10%），37 ℃避光振蕩培養2 h，使其充分擴散至胞內。取等量樣品離心（10 000 r/min、4 min）后取上清液，用多功能酶標儀測定熒光強度，激發和發射波長分別設置為560 nm和590 nm。通過測定對照孔與刃天青無菌去離子水溶液熒光強度進行背景修正。

1.3.2 菌體呼吸代謝途徑分析

當抗菌肽與典型呼吸抑制劑所抑制的主要呼吸代謝途徑差異越大時，由于增效作用，疊加率會越高，反之亦然[18]，因此，當金屬抗菌肽SIF4與典型抑制劑作用于不同代謝途徑時，存在協同增效作用，疊加率會增大，而若金屬抗菌肽SIF4與典型抑制劑作用于同一呼吸代謝途徑時，無協同增效作用，疊加率較小，可通過疊加率判斷SIF4作用的呼吸代謝途徑。測定對照組初始呼吸速率（R0）和SIF4＋碘乙酸、SIF4＋丙二酸和SIF4＋磷酸鈉等組別呼吸速率（R1），計算呼吸抑制率（inhibition rate，IR）以評價對菌體的呼吸抑制率，計算各組別呼吸疊加率（superposing rate，SR）以判定菌體的呼吸代謝抑制途徑[8]。

1.3.2.1 初始呼吸速率測定

在離心管中加入3.6 mL無菌PBS、0.4 mL 1%葡萄糖溶液和1 mL大腸桿菌菌液（106CFU/mL），充分攪拌5 min；將離心管用封口膜包裹形成封閉系統并靜置1 min以制備初始反應體系，體系穩定后利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R0/（μmol O2/（g·min））。

1.3.2.2 呼吸抑制率測定

在離心管中分別加入3.6 mL PBS、0.4 mL 1%葡萄糖溶液和1 mL大腸桿菌菌液，再分別加入3 種典型呼吸抑制劑（碘乙酸、丙二酸、磷酸鈉，終質量濃度為500 mg/L）、SIF4（終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC），攪拌5 min后，將離心管用封口膜包裹形成一個封閉系統并靜置1 min，待體系穩定后利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R1/（μmol O2/（g·min）），并按式（1）計算IR[8]。

1.3.2.3 呼吸疊加率測定

在離心管中分別加入3.6 mL PBS溶液、0.4 mL 1%葡萄糖溶液、1 mL大腸桿菌菌液和SIF4（終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC），充分攪拌5 min后將離心管用封口膜包裹形成一個封閉系統并靜置1 min，待體系穩定后利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R1。隨后分別加入碘乙酸、丙二酸、磷酸鈉（終質量濃度為500 mg/L），在密閉系統中利用便攜式微量溶氧儀測定菌懸液溶氧量/（μmol O2/g），計算呼吸速率R2，并按式（2）計算SR[8]。

式 中：R1為S I F4處 理 后 菌 體 呼 吸 速率/（μmol O2/（g·min））；R2為添加典型抑制劑后菌體呼吸速率/（μmol O2/（g·min））。

1.3.3 細胞質膜離子通道ATP酶活力的測定

參考李婷等[13]的方法并修改。將對數生長期菌體以2%接種量接種至含SIF4（終質量濃度分別為0 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC）的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，以TritionX-100處理組（終質量濃度為100 mg/L，下同）為陽性對照，37 ℃、120 r/min培養12 h，每4 h取10 mL培養液，于4 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，PBS洗滌3 次并重懸，超聲細胞破碎儀破碎（超聲功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復30 次，下同），8 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液置冰浴中待測。按試劑盒說明測定Na＋K＋-ATP和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力。

1.3.4 胞內ATP生物合成分析

參考毛雪芳[19]的方法并修改。按2%接種量接種對數生長期菌體到牛肉膏蛋白胨液體培養中，37 ℃、120 r/min培養12 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用無菌PBS洗滌3 次，加入牛肉膏蛋白胨液體培養基重懸至OD600nm＝2.0。取4 份菌懸液并加入SIF4使其終質量濃度分別為0 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC，37 ℃、120 r/min培養12 h，每4 h取樣1 mL，以0 MIC組為陰性對照，以TritionX-100組為陽性對照。取1 mL細胞培養液用福林-酚法測定菌體蛋白質量濃度。取1 mL SIF4處理菌懸液，添加500 μL溶菌酶（10 mg/mL）和500 μL TE緩沖液混勻，37 ℃保溫20 min。加入3 mL無菌PBS稀釋后進行冰浴間隔超聲破碎，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液，用試劑盒測定胞內ATP含量。

1.4 數據處理與分析

結果以平均值±標準差（n＝3）表示，采用SPSS 25.0軟件中單因素方差檢驗進行組內或組間均數差異多重比較（以P＜0.05表示差異顯著），方差齊性時采用最小顯著性差異法，非齊性時使用塔姆黑尼T2法。

2 結果與分析

2.1 對菌體新陳代謝活力的影響

刃天青為氧化還原指示劑，可被胞內氧化還原酶不可逆還原為試鹵靈，使其從初始的深藍色弱熒光轉變為粉紅色強熒光并彌散至培養基，其不可逆還原程度與細胞新陳代謝活力呈正相關[20]。SIF4對大腸桿菌細胞代謝活力影響如圖1所示。

圖1 SIF4對大腸桿菌新陳代謝活力的影響Fig.1 Effect of SIF4 on cell metabolic activity

從圖1可看出，對照組（0 MIC組）菌體新陳代謝活力維持在正常水平，并未出現明顯波動，表明菌體能量代謝生產與釋放正常，細胞新陳代謝活力正常（＞97%）；經1/2 MIC、MIC和2 MIC的SIF4處理后，菌體新陳代謝活力顯著下降（P＜0.05），具有新陳代謝活力細菌占比分別下降至（63.09±2.02）%、（47.45±2.11）%和（28.80±2.03）%，相比對照組，菌體新陳代謝活力分別下降了35.17%、51.23%和70.41%，表明SIF4對大腸桿菌菌體新陳代謝有一定抑制作用。前期研究表明，SIF4可能以“毯式”模型破壞大腸桿菌菌體細胞質膜結構，增強細胞質膜通透性，并引起細胞膜去極化[15]，同時，SIF4還可導致細胞質膜氧化損傷并誘導氧化應激產生過量自由基，從而破壞細胞質膜結構與功能[16]。大腸桿菌新陳代謝過程中，為其傳遞能量的電子傳遞鏈主要位于細胞質膜內表面，當菌體細胞質膜受到SIF4刺激與破壞之后，可能喪失為新陳代謝傳遞能量的功能[17]，因此，菌體代謝活力顯著降低。

2.2 對菌體呼吸代謝途徑抑制的影響

EMP是大腸桿菌最重要的能量與物質代謝途徑，在有氧條件下，EMP生成的NADH＋H＋經由電子呼吸鏈以氧作為氫受體，最終生成H2O和NAD＋，無氧條件下，可將代謝中間產物（如丙酮酸）還原并生成NAD＋；EMP代謝產生的乙酰輔酶A經TCA可徹底氧化為CO2和H2O，并釋放大量能量；6-磷酸葡萄糖可作為HMP代謝起始物，為生物合成提供不同含碳數的碳骨架和還原力，HMP與EMP共同構成細胞糖分解代謝與有關合成代謝的調控網絡。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉分別是EMP、TCA和HMP途徑的典型標準抑制劑，可抑制相應代謝途徑從而降低呼吸代謝速率[21]。磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD）為巰基酶，是EMP生成ATP的關鍵酶，活性中心—SH可被碘乙酸不可逆抑制；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）是TCA途徑中的重要酶，能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，并將2H轉移生成FADH2，丙二酸為琥珀酸結構類似物，是SDH競爭性抑制劑，為TCA典型抑制劑；6-磷酸葡糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是HMP途徑關鍵酶，為四亞基寡聚酶，完全受NADPH/NADP＋的相對比例控制，胞內NADPH濃度高，HMP就會受到抑制，反之則被激活，磷酸鈉為HMP途徑典型抑制劑[22]。SIF4與標準呼吸代謝典型抑制劑對大腸桿菌菌體呼吸抑制效果如表1所示。

表1 SIF4及典型抑制劑對大腸桿菌呼吸抑制率的影響Table 1 Inhibitory effects of SIF4 and typical inhibitors on the respiration of Escherichia coli

由 表1 可 看 出，1/2 M I C、M I C 和2 M I C 組SIF4菌體呼吸抑制率分別為（6.692±0.451）%、（19.387±0.168）%和（25.222±0.326）%，呼吸抑制率與處理劑量呈正相關關系，且組間差異顯著（P＜0.05）。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉組菌體呼吸抑制率分別為（20.719±0.326）%、（24.047±0.165）%和（23.446±0.157）%，組間有顯著性差異（P＜0.05）。如上文所述，當SIF4與典型呼吸抑制劑抑制的主要呼吸代謝途徑相差越大時，由于增效作用，疊加率會越高，反之亦然[18]，因此，若SIF4與典型抑制劑無協同增效作用，則疊加率較小，可由此判定SIF4的呼吸代謝抑制機理。SIF4與典型抑制劑復配對呼吸疊加率的影響如表2所示。

表2 SIF4及典型抑制劑對大腸桿菌呼吸疊加率的影響Table 2 Synergistic inhibitory effect of SIF4 combined with typical inhibitors on the respiration of Escherichia coli

由表2可看出，碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉與SIF4復配的呼吸疊加率分別為（1 9.9 8 2±0.1 3 3）%、（27.207±0.178）%和（33.304±0.566）%，碘乙酸和SIF4復配的呼吸疊加率最低，表明SIF4很可能通過抑制EMP影響菌體能量與物質代謝。前期研究發現，SIF4主要通過抑制大腸桿菌EMP的已糖激酶活性來表現高抗菌活性[16]，本研究結果與前期研究所發現糖代謝抑制機理基本一致。

2.3 對菌體細胞質膜離子通道ATP酶的影響

Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶是極其重要的細胞質膜離子通道ATP酶，對維持細胞質膜通透性、結構完整性、低鈉高鉀胞內環境、靜息電位以及信號傳導有重要意義[23-24]，Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶的活性受膜流動性影響并受ATP水平調控[25]。

SIF4對細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活性的影響如圖2所示，經SIF4處理后，菌體細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力與對照組相比均顯著降低（P＜0.05），1/2 MIC組、MIC和2 MIC組處理8 h時Na＋K＋-ATP酶活力比處理4 h時均有所上升，分別從（30.47±0.92）、（23.69±0.86）、（21.67±0.95）U/mg上升至（31.80±0.91）、（26.03±0.72）、（23.99±0.44）U/mg，特別是MIC組和2 MIC組，組內差異均顯著（P＜0.05）；8 h后Na＋K＋-ATP酶活力均顯著下降，可能是由于SIF4處理前期菌體為應激適應階段，通過增加細胞質膜離子通道ATP酶活力來增強菌體呼吸代謝和抵御外界不利環境[16]；金屬抗菌肽SIF4為金屬陽離子抗菌肽，帶正電荷，可與革蘭氏陰性菌細胞膜上脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）通過靜電吸附作用結合于細胞膜脂質膜中，從而牽引整個抗菌肽分子進入質膜，擾亂質膜上蛋白質與脂質的有序排列，通過“位移”而聚合形成跨膜通道，從而破壞細胞膜結構完整性并導致胞內容物外溢，進而起到抑菌作用[16]，推斷細胞質膜是SIF4重要的抑菌效應靶點。TritonX-100組隨處理時間延長，細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力顯著下降，處理12 h時，Na＋K＋-ATP酶活力由初始的（39.03±1.00）U/mg顯著降低至（2.41±0.67）U/mg（P＜0.05），降幅為93.83%，主要是由于TritonX-100為具有親水和疏水基團的非離子型去垢劑，可將膜蛋白從細胞質膜解離，破壞細胞質膜結構并增強膜通透性[26]。細胞質膜受損會影響能量代謝和膜內外質子濃度差[17]，并影響Na＋K＋-ATP酶活性，使基于細胞膜的轉運代謝無法完成并誘導細胞提前程序性凋亡[15]。

圖2 SIF4對大腸桿菌Na＋K＋-ATP酶活力的影響Fig.2 Effect of SIF4 on Na+K+-ATPase activity in Escherichia coli

SIF4對細胞質膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力影響如圖3所示，對照組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力穩定，無明顯波動（P＞0.05）。SIF4處理8 h后，與處理4 h相比，1/2 MIC和MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力略有上升，2 MIC組則呈下降趨勢。SIF4處理12 h時，1/2 MIC、MIC和2 MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力由初始的（27.55±0.88）U/mg分別降至（20.27±0.58）、（14.30±0.74）U/mg和（7.65±0.53）U/mg（P＜0.05），降幅分別為26.42%、48.09%和72.23%，可能是由于SIF4破壞了細胞質膜結構，改變了細胞質膜通透性，使胞內Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等離子泄露，破壞了膜內外離子電動勢，從而使細胞質膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著下降[15-16]；此外，1/2 MIC和MIC組出現短暫Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力升高現象，隨后Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低，可能與菌體應激適應有關[27]。有研究表明，胞內Ca2＋過量可損害能量系統結構和功能，誘導產生過量自由基并導致組織與細胞損傷[28]，因此，Ca2＋Mg2＋-ATP酶活性與細胞質膜結構完整及細胞質膜氧化損傷有一定關系[16]。本研究還發現，TritonX-100組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力組內差異顯著（P＜0.05），這與其具有很強的細胞質膜結構破壞作用和影響細胞質膜通透性能力有關[26]。

圖3 SIF4對大腸桿菌Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力的影響Fig.3 Effect of SIF4 on Ca2+Mg2+-ATPase activity in Escherichia coli

2.4 對菌體胞內ATP生物合成的影響

當細胞質膜受損或細胞凋亡時，胞內ATP含量迅速下降，ATP含量變化能直接反映菌體存活狀態[14]。由圖4可看出，初始階段組間胞內ATP含量無顯著差異（P＞0.05）。處理4 h時，實驗組與對照組均存在顯著差異（P＜0.05），但1/2 MIC與MIC組、MIC與2 MIC組組間無顯著性差異（P＞0.05），而1/2 MIC與2 MIC組存在顯著性差異（P＜0.05），可能與1/2 MIC組處理劑量較低和處理時間過短有關；處理8 h和12 h時，組間均存在顯著差異（P＜0.05）。本研究還發現，對照組培養0～12 h時，胞內ATP酶含量由初始（46.13±0.70）×10-6μmol/g上升至（67.82±0.70）×10-6μmol/g，增幅為47.02%，可能與菌體代謝旺盛，需要大量ATP為菌體物質代謝提供能量來源和碳骨架等中間體，以及菌體處于對數生長期等因素有關[29-30]。TritonX-100組胞內ATP酶含量呈明顯降低的趨勢，從初始的（46.13±0.70）×10-6μmol/g下降至處理12 h時的（6.09±0.72）×10-6μmol/g，降幅達到86.80%，這與TritonX-100有較強的細胞質膜裂解能力有關[26]；SIF4處理后，除呼吸代謝受到抑制外，胞內ATP含量也呈下降趨勢，特別是2 MIC組對胞內ATP合成抑制最為明顯，胞內ATP含量減少可能與ATP合成速率降低或胞內ATP水解加速有關，或與細胞質膜高度受損導致細胞質膜錨定的能量代謝酶功能受損、細胞質膜滲透性增加以及生物氧化與電子傳遞鏈不可逆受損[16]等有關，本研究結果與Santos[31]和Chingaté[32]等報道結果相似。

圖4 SIF4對大腸桿菌胞內ATP含量的影響Fig.4 Effect of SIF4 on intracellular ATP concentration of Escherichia coli

3 結 論

本實驗研究了SIF4對菌體新陳代謝活力、呼吸代謝途徑、細胞質膜離子通道ATP酶及胞內ATP生物合成的影響。結果表明，金屬抗菌肽SIF4處理可顯著降低菌體新陳代謝活力（P＜0.05），經2 MIC SIF4處理后，新陳代謝活力降低了70.41%；SIF4對菌體有較好的呼吸抑制作用，MIC和2 MIC組呼吸抑制率分別高達（19.39±0.17）%和（25.22±0.32）%；呼吸疊加率分析結果表明，SIF4可能通過抑制EMP影響菌體呼吸代謝；此外，SIF4處理后，大腸桿菌細胞質膜離子通道Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低（P＜0.05），推斷細胞質膜是SIF4重要的抑菌效應靶點；處理8 h和12 h時，實驗組組間胞內ATP含量均存在顯著差異（P＜0.05），胞內ATP含量降幅最明顯，特別是2 MIC組，可能與細胞質膜受損、ATP合成減少或消耗增加、細胞質膜通透性增加等因素有關。