山蒼子精油對白假絲酵母菌細胞膜屏障影響的機理

孫 月，曾朝懿，李梓鈺，熊海波，林籽汐，車振明，唐 潔*

（西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039）

白假絲酵母菌（Candida albicans）作為一種條件致病菌，常見于宿主的胃、腸道、口腔、皮膚和泌尿系統，其具有表型可塑性，以不同形態在營養菌絲和芽殖酵母間切換，使其能夠定植并感染宿主從而引起疾病[1]。白假絲酵母菌雖被長期認為是通過臨床感染，但在抗生素廣泛應用的背景下，白假絲酵母菌抗藥性增加，導致其感染發生轉移。近年來已有研究發現，白假絲酵母菌能夠引起傳統發酵蔬菜及奶制品腐敗[2-3]，從而引起食品安全風險。目前，抗白假絲酵母菌的藥物主要包括多烯類和唑類等[4]。然而，這類常見的抗真菌藥物會產生肝毒性、腎毒性等副作用[5]，因此，亟待尋找一種天然、安全的替代藥物。

植物精油含有豐富的天然生物堿、黃酮類化合、單萜類、倍半萜類等物質，具有良好的廣譜殺菌性和不易造成耐藥性等特點。但不同精油由于化學組分和含量不同，其作用機制不同[6-8]。Azeredo等[9]研究發現不同生化成分組成的精油組合可顯著提高抗菌效力。Lü Fei等[10]評估比較了4 種化學成分差異很大的精油，通過協同作用測試，證實4 種精油組合可以在低濃度下有效抑制食品中的相關微生物。此外，Santiesteban-López等[11]研究了精油組合抑菌協同作用機制，結果表明，協同作用機制包括共同生化途徑的連續抑制以及保護性酶的抑制等。但不同抗菌特性的精油對不同微生物的具體抑菌機制還需明確。

山蒼子精油是一種高附加值產品，主要從山蒼子的新鮮果實中提取[12-13]，具有廣泛的生物和藥理活性，包括抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化作用等[14]。GB/T 2760——2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中提到山蒼子精油還可作為食品調味劑使用，與食品基質作用，從而改善食物感官品質。有研究表明，山蒼子精油及其活性化合物具有良好的抑菌活性，可廣泛抑制食源性病源菌，延長食品保質期[15]。戴錦銘[16]發現山蒼子精油的主要成分檸檬醛可以破壞大腸桿菌DNA結構，減少胞內DNA含量；此外，將山蒼子精油應用于4 種不同果蔬汁中均能夠抑制大腸桿菌繁殖。李欣越等[17]的研究表明山蒼子精油能夠有效抑制沙門菌生物被膜的形成；王軼楠[18]發現山蒼子精油會抑制辣椒疫霉菌菌絲生長、孢子囊形成、孢子囊萌發和孢子萌發。雖然山蒼子精油的抗菌活性已在很多研究中得到證實，但山蒼子精油應用于白假絲酵母菌的研究還鮮有報道，限制了山蒼子精油在食品工業中的進一步應用。

本研究選用山蒼子精油作為天然抗菌劑，分析其主要活性成分，通過不同質量濃度的山蒼子精油處理篩自“生花”泡菜中的白假絲酵母菌，觀察處理前后白假絲酵母菌細胞形態、表面疏水性、表面電荷、胞內核酸和蛋白質泄漏變化情況，探究山蒼子精油對白假絲酵母菌抗菌活性及其對細胞膜屏障影響的機理，以期為山蒼子精油及其生物活性化合物在食品工業中應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

白假絲酵母菌由中國（成都）西華大學四川食品微生物學重點實驗室提供；山蒼子精油（純度≥85%）上海源葉生物科技有限公司；YPD培養基 杭州微生物試劑有限公司；吐溫20、戊二醛（體積分數25%）成都市科隆化學品有限公司；正十六烷 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BPH-9082恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；ZWY-2102C雙層恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；GI54DWS全自動高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；FDU-1100真空冷凍干燥機 東京理化器械株式會社；5 8 0 4 R 冷凍離心機 德國Eppendorf公司；GCMS-QP2020 NX氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀日本島津公司；AR8011電導率測試儀 蘇州羅伯克測控技術有限公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度儀 英國馬爾文帕納科公司；CSUOP0600熒光倒置顯微鏡 重慶重光實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山蒼子精油成分測定

取3 mL的樣品于頂空萃取瓶中，蓋上瓶蓋，置于60 ℃水浴保溫30 min后，將萃取頭旋轉于2 cm處，插入頂空萃取瓶，壓入纖維頭，吸附30 min，吸附結束后，取出萃取頭重新旋轉到3 cm處，從GC-MS進樣口進樣解吸5 min后取出萃取頭。

色譜條件：Rtx-5MS色譜柱，載氣為高純度氦氣，柱箱溫度55 ℃，進樣口溫度220 ℃，分流比50∶1，總流量67.4 mL/min，柱流量1.00 mL/min，壓力119.8 kPa。升溫程序：55 ℃保持4 min，隨后以10 ℃/min升至130 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升至240 ℃，保持15 min，檢測器溫度為240 ℃。

MS條件：離子化電子電離源，電離電壓70 eV，離子源溫度280 ℃，接口溫度240 ℃，溶劑延遲時間2 min。

1.3.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

山蒼子精油對白假絲酵母菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MFC）的測定采用Zhang Yunbin等[19]的方法。將山蒼子精油用5%（質量分數，下同）吐溫20配制成質量濃度為32 mg/mL的母液，以二倍稀釋法將精油依次稀釋為質量濃度16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。每個樣品加入2%（以體系體積計）白假絲酵母菌菌懸液（使實驗終體系菌懸液濃度為1×107CFU/mL）30 ℃培養24 h，以添加5%吐溫20的YPD培養基作為陰性對照，以不接菌的不同質量濃度山蒼子精油作為陽性對照，測定OD600nm，其中與陽性對照組光密度值最接近的最低處理精油質量濃度為MIC。吸取100 μL蒼子精油濃度不低于MIC的菌懸液并涂布在YPD平板上，在30 ℃下孵育24 h后，相應的菌落數小于5的平板所對應最低質量濃度被認作山蒼子精油對白假絲酵母菌的MFC[20]。

1.3.3 抑菌動力學的測定

4.4.2 個體化鎮痛：結合文獻學習及我院臨床工作經驗，對于健康初產婦推薦使用椎管內嗎啡與非甾體類藥物和/或對乙酰氨基酚。對于全麻剖宮產，擴大皮膚切口，已知有慢性疼痛病史的產婦，需改變常規鎮痛方案，或者加大用藥劑量，可采用持續傷口浸潤阻滯鎮痛，持續腹橫肌平面阻滯鎮痛。對于二次剖宮產經產婦推薦使用椎管內嗎啡，圍術期低劑量舒芬太尼復合特耐(帕瑞昔布鈉)及地塞米松。對于爆發痛患者建議口服或者靜脈應用阿片類藥物，也可以給予“拯救性”腹橫肌平面阻滯?？诜⑵愃幬锿扑]：羥考酮、氫可酮、曲馬多。對于更嚴重的爆發痛或者不耐受口服時，可使用靜脈阿片類藥物。

以二倍稀釋法配制含不同質量濃度山蒼子精油（0、MIC、MFC）的YPD培養基，接種100 μL處于對數生長期的菌懸液于5 mL無菌YPD培養基中（使實驗終體系菌懸液濃度為1×107CFU/mL），分別于培養0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h時測定OD600nm。

1.3.4 微觀形態特征觀察

掃描電子顯微鏡可以觀察山蒼子精油在MIC和MFC下對白假絲酵母菌的影響。將處于對數期的白假絲酵母菌用冷凍離心機6 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌3 次并懸重至菌懸液濃度為1×107CFU/mL，以二倍稀釋法加入山蒼子精油，使其終質量濃度達到0（對照）、MIC、MFC，在30 ℃下搖床培養3 h，6 000 r/min離心10 min，加入體積分數2.5%戊二醛溶液固定3 h，離心10 min并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L pH 7.2）洗滌3 次，涂抹于載玻片上，用體積分數20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液依次沖洗，進行梯度脫水，裹上扎好孔的保鮮膜，于-20 ℃下預凍12 h，再放入冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，最后將有細胞的載玻片進行噴金處理，鏡檢拍照。

1.3.5 表面電荷的測定

將處于對數期的白假絲酵母菌加入含不同質量濃度山蒼子精油（0、MIC、MFC）的YPD培養基中，于30 ℃下培養15 h后用冷凍離心機6 000 r/min離心10 min，以PBS（0.01 mol/L pH 7.2）洗滌3 次并重懸至菌懸液濃度為1×107CFU/mL后，用激光粒度儀測細胞表面電荷。

1.3.6 細胞膜完整性的測定

用熒光倒置顯微鏡檢測細胞膜的完整性。調整對數生長期的白假絲酵母菌菌懸液濃度為1×107CFU/mL，分別加入不同質量濃度的山蒼子精油，使其終質量濃度分別為0、MIC、MFC。在30 ℃的搖床培養箱中培養4 h，混勻，取1 mL的培養液6 000 r/min離心10 min，用PBS（0.01 mol/L pH 7.2）洗滌3 次并懸重，于96 孔板中分別加入190 μL稀釋100 倍的菌懸液和10 μL按照體積比1∶3混合的SYBR Green I和PI染料，25 ℃避光孵育25 min，在20×物鏡、10×目鏡熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.7 電導率的測定

1.3.8 分子物質泄漏情況分析

參照柏梅[21]的方法對山蒼子精油作用后大分子物質泄漏情況進行分析。將培養至對數周期的白假絲酵母菌于6 000 r/min下離心10 min，獲得的菌體沉淀用無菌PBS（0.01 mol/L pH 7.2）清洗，此過程重復3 次后獲得菌體沉淀用無菌PBS（0.01 mol/L pH 7.2）重懸至菌懸液的濃度為1×107CFU/mL。將白假絲酵母菌菌懸液與不同質量濃度山蒼子精油（0、MIC、MFC）混合并在30 ℃下振蕩培養，每4 h使用紫外分光光度計測定OD260nm和OD280nm，以添加等量5%吐溫20的實驗組作為對照組。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3 個重復，采用Excel 2021軟件進行數據統計，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 山蒼子精油主要活性成分

采用GC-MS對山蒼子精油進行成分分析，所得分析譜圖如圖1所示，與NIST質譜標準品進行比對后的結果列于表1。

表1 山蒼子油精主要成分分析Table 1 Analysis of major components in Litsea cubeba essential oil

圖1 山蒼子精油GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Gas chromatography-mass spectrometry total ion current chromatogram of Litsea cubeba essential oil

由圖1可以得出，山蒼子精油經GC-MS分析，共檢測出90 種物質，其中(Z)-檸檬醛（13.28%）、檸檬醛（12.52%）、D-檸檬烯（12.45%）、甲基庚烯酮（7.13%）、芳樟醇（6.57%）、香茅醛（6.47%）含量較高（表1）。成分分析結果表明，山蒼子精油主要成分為單萜類化合物及其氧化物，如D-檸檬烯、月桂烯、檸檬醛、芳樟醇等，總質量分數為59.0361%。有研究表明，D-檸檬烯、檸檬醛、芳樟醇具有抑菌殺菌的作用[20,22-23]，在食品中可用作天然防腐保鮮劑。但也有研究者認為植物精油中存在的微量成分對抑菌活性的影響比植物精油中的主要成分更重要，主要成分與其他活性較弱的微量成分的組合可能會達到協同效應[10]，這表明與植物精油的主要成分相比，植物精油的抗菌活性更強。

2.2 山蒼子油對白假絲酵母菌的抗菌活性

通過二倍稀釋法確定山蒼子精油對白假絲酵母菌的MIC為0.25 mg/mL，通過不同質量濃度山蒼子精油處理后白假絲酵母菌的殘菌數如圖2A所示，確定MFC為1 mg/mL，這與吳均等[24]報道的山蒼子抑菌活性的MFC有一定的差異，這種差異可能是菌株的特異性造成的。山蒼子精油對白假絲酵母菌0～24 h的抗菌活性如圖2B所示，陰性對照組白假絲酵母菌在8～24 h內生長狀況良好，處于對數生長期。當山蒼子精油質量濃度達到MIC（0.25 mg/mL）和MFC（1 mg/mL）時，則完全抑制白假絲酵母菌的生長。其中，在山蒼子精油質量濃度為0.25 mg/mL條件下處理4 h，白假絲酵母菌生長已停滯。

圖2 山蒼子精油對白假絲酵母菌的抗菌活性Fig.2 Antimicrobial activity of Litsea cubeba essential oil against Candida albicans

2.3 山蒼子精油對白假絲酵母菌的抑菌機制

2.3.1 山蒼子精油作用前后白假絲酵母菌菌體微觀形態分析

用掃描電子顯微鏡觀察山蒼子精油處理前后白假絲酵母菌的微觀結構變化。未經山蒼子精油處理的白假絲酵母菌具有完整真菌的獨特特征，邊界光滑完整，呈橢圓形（圖3A）。與之相反，經MIC-山蒼子精油處理后的白假絲酵母菌呈下凹、扭曲、褶皺狀（圖3B）。當白假絲酵母菌暴露于MFC的山蒼子精油時，細胞明顯破裂，附著成團（圖3C）。結果表明，山蒼子精油對白假絲酵母菌的細胞壁有明顯的損傷作用，細胞形態發生改變，這些細胞結構的變化可能是由于膜的溶解和轉化。Bajpai等[25]證實了蠟樣芽孢桿菌形態的改變是細胞壁表面惡化、細胞腫脹、膜破裂所致。

圖3 掃描電子顯微鏡觀察白假絲酵母菌細胞形態Fig.3 Scanning electron microscopic observation of Candida albicans cell morphology

2.3.2 山蒼子精油對白假絲酵母菌細胞表面特性的影響

細胞膜的表面電荷在細胞的聚集與黏附、物質合成分解與運輸、信息的傳遞等過程中起重要作用[26]，表面電荷的改變被認為是細胞對外部刺激最快的反應之一[27]。山蒼子精油作用前后細胞表面電荷絕對值變化如圖4所示，與對照組相比較，經MIC和MFC山蒼子精油處理后，菌體表面電荷絕對值均有所減少。結果表明，當菌體暴露在一定量的山蒼子精油中，其表面電荷會減少，使細胞更易聚沉、成團，從而影響菌體正常生長繁殖。

圖4 山蒼子精油對白假絲酵母菌表面電荷的影響Fig.4 Effect of Litsea cubeba essential oil on surface charge of Candida albicans

2.3.3 山蒼子精油對白假絲酵母菌細胞膜完整性的影響

細胞膜是保護細胞免受細胞外環境影響、維持細胞內平衡的重要屏障。綠色熒光探SYBR Green I和紅色熒光染料PI可用于評價細胞膜的完整性。綠色熒光探針SYBR Green I可以被水解為熒光素，然后熒光素只在細胞膜完整的活細胞中積累。但PI只能通過受損的細胞膜進入細胞，隨后對核酸進行染色，并發出紅色熒光[28]。本研究中未經山蒼子精油處理的白假絲酵母菌細胞發出明亮的綠色熒光（圖5A），表明細胞膜完整；相反，白假絲酵母菌經MIC山蒼子精油處理后，綠色熒光強度明顯減弱，紅色熒光強度增強（圖5B），表明部分細胞受到了損傷，而在未受損傷的細胞中，SYBR Green I的水解性受到了一定程度的抑制。白假絲酵母菌經MFC山蒼子精油處理后，幾乎沒有綠色熒光發射（圖5C），表明幾乎所有白假絲酵母菌的細胞膜都被破壞，致使細胞失活死亡。Liu Xue等[29]證實了芳樟醇可以穿過細胞膜，改變膜組成，增加膜流動性，最終破壞細胞膜完整性。

圖5 山蒼子精油對白假絲酵母菌細胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of Litsea cubeba essential oil on the cell membrane integrity of Candida albicans

2.3.4 電解質泄漏情況分析結果

細胞膜具有選擇透過性，即使膜結構受到輕微損傷，膜的通透性也會顯著增加，導致離子穩態被破壞，滲透壓調節失控，從而使細胞產生毒性[30]。如圖6所示，經MIC和MFC山蒼子精油處理后的白假絲酵母菌細胞膜受到破壞，相對電導率明顯高于對照組。這是因為電解質從細胞泄漏到測試液中，并且隨山蒼子精油的濃度從MIC到MFC的增加，菌體細胞質泄漏量升高。說明山蒼子精油能夠破壞菌體細胞膜結構，導致胞內電解質流出，致使細胞生長受到抑制或死亡。與本研究結果類似，Ziaee等[20]用何首烏精油彎曲乳桿菌，Cui Haiying等[31]用牛至精油處理耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，Diao Wenru[32]用茴香籽油處理痢疾桿菌，發現細胞膜通透性增加引起電解質泄漏是導致彎曲乳桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、痢疾菌死亡的重要原因之一。

圖6 山蒼子精油對白假絲酵母菌電導率的影響Fig.6 Effect of Litsea cubeba essential oil on the electrical conductivity of Candida albicans

2.3.5 胞內大分子泄漏情況分析結果

細胞膜系統遭到損傷，便會造成細菌內部多種重要生物大分子（核酸、蛋白質、糖類等）泄漏，從而影響正常的合成代謝功能[33]，胞內核酸和蛋白質分別在OD260nm和OD280nm有最大吸收峰[34]。山蒼子精油處理后核酸和蛋白質泄漏情況如圖7所示，與對照組相比，經MIC和MFC的山蒼子精油處理后，胞外菌液中核酸（圖7A）和蛋白質（圖7B）的泄漏量明顯增加，其泄漏量與山蒼子精油的質量濃度、處理時間成呈正相關。表明山蒼子精油能夠破壞菌體細胞膜，增加其通透性，造成胞內大分子物質流出，從而導致菌體死亡。張梅等[35]證實了植物源防腐劑能夠使大腸桿菌、金黃的色葡萄球菌、白假絲酵母菌的胞內大分子核酸通過細胞膜滲漏到胞外，增加細胞膜的通透性，使細胞受到不可修復的破壞。

圖7 山蒼子精油對白假絲酵母菌胞內大分子泄漏的影響Fig.7 Effect of Litsea cubeba essential oil on intracellular macromolecule leakage from Candida albicans

3 結 論

本研究通過GC-MS組分分析鑒定出山蒼子精油由90 種化合物組成，主要為單萜類化合物和單萜氧化物，其含量最高的化合物依次是(Z)-檸檬醛（13.28%）、檸檬醛（12.52%）、D-檸檬烯（12.45%）、甲基庚烯酮（7.13%）、芳樟醇（6.57%）、香茅醛（6.47%）。山蒼子精油對白假絲酵母菌具有良好的抗菌活性，當山蒼子精油質量濃度為0.25 mg/mL處理4 h時，白假絲酵母菌生長已停滯。通過掃描電子顯微鏡觀察菌體的微觀結構發現，山蒼子精油處理白假絲酵母菌菌體后，后者細胞壁受損，細胞變形、萎縮，隨著山蒼子精油量的增加，對細胞膜的損傷作用增強。此外，山蒼子精油處理后白假絲酵母菌細胞膜完整性被破壞，通透性增加，胞內離子動態失衡，大分子物質泄漏，導致白假絲酵母菌代謝紊亂，菌體裂解死亡。本研究初步探究了山蒼子精油對白假絲酵母菌細胞膜屏障影響的機理，可為將山蒼子精油添加在發酵蔬菜汁和奶制品中抑制白假絲酵母菌提供理論依據，并對評估山蒼子精油及其生物活性化合物在食品加工與保存中的進一步研究開發利用具有一定的意義。