Hedgehog信號通路調控骨形成探討中藥防治骨質疏松癥的研究進展

馬成祥 曹林忠,2* 魏晶晶 萬超超 楊博

1 甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州730000

2 甘肅中醫藥大學附屬醫院,甘肅 蘭州730099

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨密度減低、骨微結構破壞和脆性骨折為特征的全身性骨代謝疾病,是嚴重的公共衛生問題之一[1-2]。隨著全球老齡人口的增加,骨質疏松癥病例的數量每年都在上升,80歲以上人群中骨質疏松癥的發病率為70 %,在50歲以上人群中為15 %[3]。因此,尋找一種更安全有效的治療骨質疏松癥的方法具有重要的社會意義。骨質疏松癥的具體發病機制尚不清楚,普遍認為是由于骨髓間充質干細胞(bone marrow derived stroma cells,BMSCs)成骨成脂分化失衡,破骨細胞、成骨細胞活性改變,導致骨形成和骨吸收失衡[4-5]。

Hedgehog (Hh)基因最早于1980年在果蠅中發現,并因其突變使果蠅幼蟲形成刺猬樣形態而被命名為Hh,最近在脊椎動物中也得到證實[6]。近年來研究發現,Hh信號通路可以通過調控BMSCs成骨分化,進而影響骨形成,對維持骨穩態亦發揮重要作用。因此,本文探討了Hh信號通路在骨質疏松癥發生發展中的作用機制,以期為防治骨質疏松癥提供新的思路與方向。

1 Hedgehog信號通路

Hh信號通路是一種高度保守的通路,參與無脊椎動物和脊椎動物的胚胎發育、組織穩態和干細胞維持[7]。其主要包括Hh配體、patched受體(Ptch)、smoothened受體(Smo)、融合抑制因子(Sufu)和轉錄因子膠質瘤相關癌基因(Gli)4個核心部。在脊椎動物中,存在三個Hh基因家族成員,包括sonic Hh (Shh)、Indian Hh (Ihh)和desert Hh (Dhh)[8],分別編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。Shh、Ihh和Dhh統稱為Hh信號通路配體。Ptch是Hh配體的12個跨膜受體,包括兩個同源基因Ptch1和Ptch2,在脊椎動物中Ptch1對Hh信號通路起負調控調節。Smo是一種跨膜蛋白,具有信號傳感器的功能。脊椎動物一般含有Gli1、Gli2和Gli3三種Glis蛋白,它們都是具有鋅指結構的轉錄因子。通常,Gli1和Gli2主要作為轉錄激活因子,而Gli3作為Hh信號傳導的抑制因子,Sufu是Hh通路的負調控因子。

Hh通路通常是由Hh蛋白與其受體Ptch結合而觸發的。在沒有Hh配體的情況下,Ptch通常位于初級纖毛周圍并抑制Smo的活性,當Hh配體存在時,Hh蛋白與靶細胞上的Ptch結合,Ptch從初級纖毛中退出,這一作用解除了Ptch對Smo的抑制作用,導致Smo被激活,從而激活Hh信號,轉錄因子Gli1活化進入細胞核,調控下游靶基因的轉錄[9](圖1)。此外,某些共受體如生長阻滯特異性(Gas),已被證明與Hh配體相互作用以激活Hh信號,而Hh相互作用蛋白(HHIP)是一種可以結合所有Hh配體的膜糖蛋白,通過阻止Hh配體與Ptch的相互作用負調控Hh信號,最終減弱Hh信號[10]。

圖1 Hedgehog信號通路調控機制

2 Hh信號通路在骨質疏松癥中的調控作用

骨質疏松癥的具體發病機制尚不清楚,目前普遍認為是由于BMSCs成骨成脂分化失衡導致骨穩態失調。多項研究表明,Hh信號通路在骨形成和骨修復過程中發揮重要作用[11-13],Hh信號的失調與骨質疏松癥的發生發展密切相關。

2.1 Hh信號通路對骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的調控

骨質疏松癥是一種代謝性骨病,表現為骨形成和骨吸收失衡,導致骨量和微結構不斷破壞。成骨分化受損的BMSCs可導致成骨障礙,骨形成減少,甚至發生骨質疏松癥。已有研究發現,Hh信號通路在調控BMSCs成骨細胞分化過程中具有重要作用。音猬因子(Shh)蛋白作為Hh信號中研究最早及在胚胎發育過程中最重要的蛋白,能夠調節組織及細胞中的BMSCs向成骨細胞增殖與分化。研究發現,重組N-末端Shh (ShhN)在體外促進大鼠BMSCs的增殖和成骨分化[13]。Beloti等[14]探討Hh信號通路激動劑purmorphamine(嘌嗎啡胺)對BMSCs成骨細胞分化的影響,發現其能夠上調BMSCs向成骨細胞分化過程中標志物的表達,增強ALP的活性。Ma X等[15]在探討地塞米松體外誘導大鼠BMSCs成骨分化過程中Hh信號分子表達,發現在BMSCs的成骨細胞分化過程中,地塞米松可以通過Hh信號通路增強Shh的表達。Huang C等[16]研究發現,在免疫缺陷小鼠4 mm同種異體骨移植模型中,過表達ShhN的BMSCs的植入通過改善供體細胞的存活和分化,以及骨缺損部位的支架血運重建,顯著促進了骨缺損重建,加速了體內骨形成。考慮到Shh和Nel-like1蛋白(Nell-1)均具有骨誘導潛能,有研究建立了ShhN與Nell-1聯合治療的方法,結果發現與單獨使用任一細胞因子相比,這種特殊的組合策略顯著促進脂肪源性間充質干細胞(HASCs)的成骨分化,使用Smo拮抗劑(cyclopamine)抑制Hh信號通路,發現Nell-1單獨發揮的促成骨功能可以被消除[17]。可見,這種特殊的細胞因子組合策略可能對骨再生有潛在的治療作用。另外,研究發現,高糖(HG)條件對BMSCs成骨分化具有抑制作用。然而,重組Shh的加入緩解了HG誘導的抑制功能,其中轉染Shh慢病毒的細胞顯示基質礦化結節增加、ALP活性和骨涎蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)和骨形態發生蛋白4 (BMP-4)的表達水平更高。此外,建立糖尿病大鼠拔牙模型進行體外驗證,發現Shh給藥促進了拔牙窩內的骨形成[18-19]。

2.2 Hh信號通路對成骨細胞增殖、分化的調控

骨組織的發生主要依賴成骨細胞的增殖分化,Hh信號通路可通過調控成骨細胞增殖分化促進骨形成,進而防治骨質疏松癥的發生。SLITRK5是成骨細胞中Hh信號的負調控因子,Sun等[20]發現,SLITRK5在成骨細胞中選擇性表達,SLITRK5的缺失促進了成骨細胞在體外和體內的分化。SLITRK5的體外缺失導致Hh信號通路的增加,成骨細胞中SLITRK5的過表達抑制Hh信號通路下游靶點的誘導。該研究表明,Hh信號通路在促進成骨細胞增殖分化中發揮重要作用,這可能是促進骨形成的一個重要靶點。Gao等[21]研究發現,Exendin-4以劑量依賴的方式顯著促進成骨細胞的形成,上調GLP-1R、Hedgehog和Gli1的表達,Gli1- sirna顯著下調了Gli1和Runx2的表達,抵消了exendin -4誘導的成骨細胞分化,進一步證明了Hh信號通路在促進成骨細胞的成骨分化中的重要作用。Jiang等[22]發現,高糖(HG)條件抑制成骨細胞Shh通路,導致成骨細胞分化和骨形成減少,而激活Shh信號緩解了HG誘導的抑制功能。此外,Lin等[23]用microRNA-874處理成骨細胞,結果發現其可以通過靶向抑制Sufu和激活Hh信號通路,促進骨質疏松大鼠成骨細胞的增殖和分化。進一步證實,Hh信號通路通過調控成骨細胞增殖分化防治骨質疏松癥。

此外,研究表明,氧化應激可以抑制BMSCs成骨分化,并通過抑制Hh信號通路促進年齡相關性骨質疏松。另外,抑制層粘連蛋白α2 (LAMA2)也可通過調節Hh信號通路增強BMSCs成骨分化和抑制其成脂分化,這意味著調節Hh信號通路可能是治療骨質疏松癥的一種潛在策略[24]。此外,有研究證實,Ihh-Ptch1信號通路在骨穩態調節中具有重要的功能,因為Ptch1-缺陷(Ptch+/-)細胞表現成骨細胞分化增強,RUNX2的表達上調,這表明Ptch1可能是一種有前景的骨質疏松治療靶點[25]。通過以上研究,可以證明Hh信號通路促進BMSCs成骨分化,促進成骨細胞增殖分化,從而防治骨質疏松癥的發生。

3 中醫藥調控Hh信號通路防治骨質疏松癥

3.1 中藥單體

根據中醫學“腎藏精,主骨生髓”的理論,骨質疏松癥的治療多以補腎中藥為主[26],淫羊藿歸肝腎經,常用于補腎壯陽、祛風除濕,在骨科臨床應用較為廣泛[27]。淫羊藿苷是從淫羊藿中分離得到的一種戊烯基黃酮醇苷,是淫羊藿中主要的生物活性成分,其可以通過刺激BMSCs的成骨分化而抑制破骨分化和破骨細胞的骨吸收活性,從而促進骨形成,可作為骨質疏松癥的潛在治療手段[28]。劉杰等[29]探索淫羊藿苷對高糖致骨丟失的治療效果及相關分子機制,發現高濃度葡萄糖雖然一定程度上能促進MC3T3-E1細胞增殖,但卻損害細胞的葡萄糖和糖原代謝,并通過破壞原纖毛穩態引起Hh信號障礙導致成骨分化、礦化受損。淫羊藿苷抑制高糖環境下線粒體ROS過量產生來保護原纖毛,完整原纖毛是Gli2轉錄后修飾及成熟位點,從而通過Shh/Gli2途徑激活Hh信號促進成骨分化和礦化,挽救高糖致骨丟失,為淫羊藿苷防治骨質疏松癥提供了一個新的途徑。同時,辛紅美等[30]研究淫羊藿苷對成骨細胞增殖分化的影響及與Hh信號通路的相關性,實驗發現,淫羊藿苷可顯著升高成骨相關因子ALP的表達,促進成骨細胞增殖,并且證實該過程是由Hh信號通路介導的。進一步證明了淫羊藿苷在防治骨質疏松癥中的潛在作用。

補骨脂味苦,性溫,具有補腎壯陽之效。補骨脂是治療骨骼和關節疾病最常用的草藥之一,補骨脂素是從補骨脂中提取的,是補骨脂的重要活性成分,臨床應用廣泛,多用于治療骨質疏松癥。研究發現,補骨脂素可以通過增加ALP活性和增強成骨細胞特異性標記基因(如I型膠原蛋白和OPG)的表達來促進成骨細胞分化[31]。韓宇等[32]研究了補腎中藥補骨脂素防治骨質疏松癥的分子機制及與Hh信號通路的相關性,結果發現,與模型組相比,補骨脂素可明顯上調Hh信號通路相關因子Shh和Gli1及骨形成指標ALP的表達,下調Ptch1mRNA及其蛋白的表達。此結果表明,補骨脂素含藥血清通過Hh信號通路促進大鼠BMSCs成骨分化、增殖,進一步表明Hh信號通路在防治骨質疏松癥中的關鍵作用及補腎中藥的潛在作用。

柚皮苷是從干姜中提取的一種活性化合物,研究表明柚皮苷能促進骨髓基質細胞的增殖和成骨分化。Lin FX等[33]研究柚皮苷促進骨髓基質細胞的增殖和成骨分化的機制,發現柚皮苷可增加BMSCs的礦化,并誘導ALP活性。柚皮苷顯著提高Foxc2、Cbfα1、OCN和BSP的mRNA水平,降低PPARγ2的mRNA水平。此結果表明,柚皮苷通過Ihh信號通路上調Foxc2的表達,促進BMSCs的成骨分化,從而防治骨質疏松癥。

黃芪是我國著名的中草藥,為中醫臨床常用補益中藥。黃芪甲苷(astraloside, AST)是黃芪的主要生物活性成分。有研究探討了黃芪甲苷對成骨細胞樣細胞增殖和遷移的影響,結果發現,黃芪甲苷促進了成骨樣細胞MG-63細胞增殖和遷移。此外,發現Hh信號通路基因Shh和Gli1基因表達水平明顯升高。當使用環巴胺抑制Hh信號通路后,發現MG-63、U-2OS細胞增殖和遷移明顯降低。此結果表明,黃芪甲苷通過激活Hh信號通路促進人成骨樣細胞的增殖和遷移,從而防治骨質疏松癥的發生[34]。

3.2 中藥復方

高舉會等[35]探究右歸丸治療骨質疏松癥的療效機制是否與激活Hh信號通路進而促進BMSCs向成骨分化有關,結果發現,右歸丸可以誘導BMSCs內Shh、Ptc、Gli1蛋白的表達,能夠有效治療骨質疏松癥,這種作用可能通過Hh信號通路來實現的。此外,高舉會等[36]以中醫學中的“腎藏精,主骨,生髓”為理論依據,通過實驗進一步研究左歸丸治療骨質疏松癥的作用機制,發現左歸丸可以上調骨質疏松模型大鼠BMSCs中成骨相關因子和Hh通路蛋白的表達,表明左歸丸能夠通過激活Hh信號通路中的Shh、Smo、Gli1等靶基因有效治療骨質疏松癥。充分驗證了“腎藏精,主骨,生髓”的腎-髓關系的科學性及該理論在防治骨質疏松癥中的關鍵作用。同時,王雨荷[37]進一步研究發現,左歸丸可明顯抑制骨質疏松癥大鼠Hh信號通路關鍵因子Ihh、Ptch、Smo、Gli1 mRNA及蛋白表達水平,進而降低RANKL/OPG比值,抑制破骨細胞活性,防止骨量丟失。進一步闡明“腎主骨”機理,為中醫治療骨質疏松提供科學依據。

黃穎等[38]基于Hh信號通路探討金烏健骨膠囊對激素誘導性骨質疏松大鼠成骨相關基因的影響,結果發現,金烏健骨膠囊可明顯提高骨質疏松大鼠成骨相關因子Runx2、Osterix及OC、BSP、BALP表達水平,并且上調Hh通路相關因子Shh、Ptch1、Smo、Gli1基因的表達。此結果表明,金烏健骨膠囊可通過Hh信號通路促進成骨分化,從而防治激素誘導性骨質疏松癥的發生。

鄧洋洋等[39]研究去卵巢大鼠骨質疏松癥的發生機制與Hh信號通路的關系及中藥復方的干預作用,結果發現,骨質疏松癥的發生機制與Hh信號傳導通路SHH、Gli1 mRNA和蛋白活性下降有關,補腎填精中藥復方、活血化瘀中藥復方、補腎活血中藥復方通過激活Hh信號傳導通路中的Shh、Gli1,以促進骨形成,抑制骨吸收,起到防止骨質疏松癥的作用。有研究基于“腎虛血瘀”理論進一步探討了Hh信號通路與去卵巢骨質疏松癥模型大鼠骨代謝的關系及補腎填精、活血化瘀中藥復方的干預作用,結果發現,補腎活血中藥復方可通過下調Hh信號通路相關蛋白Ptch1和Gli3mRNA表達,從而防治絕經后骨質疏松癥的發生[40]。此外,梁學振等[41]研究了補腎活血法對激素誘導的股骨頭壞死大鼠骨代謝的影響及與Hh信號的相關性,發現糖皮質激素可誘導BMSCs成骨成脂分化失衡,補腎活血膠囊可通過Hh信號通路促進BMSCs成骨分化,抑制其成脂分化。同時,姜奧等[42]進一步研究發現,補腎、健脾、活血法通過調節骨組織Ihh含量,促進骨組織細胞增殖與分化,進而防治骨質疏松癥,進一步表明了補腎、活血、健脾中藥復方在調控Hh信號通路防治骨質疏松癥中發揮重要作用,揭示了“腎虛血瘀”“腎藏精主骨”“脾主運化而主四肢肌肉”理論為骨質疏松癥的重要機制。但也有研究發現,Hh信號通路與原發性骨質疏松癥中醫證型無明顯相關性[43]。

4 小結與展望

綜上所述,Hh信號通路在骨質疏松癥發生發展中發揮正向調控作用,并提示Hh信號通路可能作為治療骨質疏松癥和其他代謝性骨病的潛在治療靶點。本文主要總結了中藥單體、中藥復方通過調控Hh信號通路,進而防治骨質疏松癥。但目前通過針灸、電針、針刀、超聲波等療法調控Hh信號通路治療骨質疏松癥的研究較少,更多的中藥成分以及分子機制研究仍需進一步探討。此外,各種小分子或生物材料已被用來調節Hh信號以促進成骨[44-45],然而小分子材料的應用面臨著劑量要求高、特異性和穩定性低、作用時間短和體內潛在副作用等多重挑戰,因此,仍需進一步研究明確。此外,Hh信號通路調控骨形成的機制復雜,涉及許多信號介質和功能,并且作用的細胞類型具有特異性。因此,對于不同類型的細胞,需要在適當的時間微調Hh軸以促進骨形成和維持骨穩態。此外,骨形成是一個復雜的再生過程,受多種信號通路調控,Hh信號通路與其他骨形成相關信號通路的關系有待進一步研究。